высаливание : осаждение солями щелочных, щелочноземельных металлов (хлорид натрия, сульфат магния), сульфатом аммония; при этом не нарушается первичная структура белка;
осаждение : использование водоотнимающих веществ: спирт или ацетон при низких температурах (около –20 С).
При использовании этих методов белки лишаются гидратной оболочки и выпадают в осадок в растворе.
Денатурация - нарушение пространственной структуры белков (первичная структура молекулы сохраняется). Может быть обратимая (структура белка восстанавливается после устранения денатурирующего агента) или необратимая (пространственная структура молекулы не восстанавливается, например, при осаждении белков минеральными концентрированными кислотами, солями тяжелых металлов).
Методы разделения белков Отделение белков от низкомолекулярных примесей
Диализ
Используют специальную полимерную мембрану, которая имеет поры определенной величины. Малые молекулы (низкомолекулярные примеси) проходят через поры в мембране, а крупные (белки) задерживаются. Таким образом, белки отмывают от примесей.
Разделение белков по молекулярной массе
Гель-хроматография
Хроматографическую колонку заполняют гранулами геля (сефадекс), который имеет поры определенной величины. В колонку вносят смесь белков. Белки, размер которых меньше, чем размер пор сефадекса, задерживаются в колонке, так как «застревают» в порах, а остальные свободно выходят из колонки (рис. 2.1). Размер белка зависит от его молекулярной массы.
Рис. 2.1. Разделение белков методом гель-фильтрации
Ультрацентрифугирование
Этот метод основан на различной скорости седиментации (осаждения) белковых молекул в растворах с различным градиентом плотности (сахарозный буфер или хлорид цезия) (рис. 2.2).
Рис. 2.2. Разделение белков методом ультрацентрифугирования
Электрофорез
Данный метод основан на различной скорости миграции белков и пептидов в электрическом поле в зависимости от заряда.
Носителями для электрофореза могут служить гели, ацетатцеллюлоза, агар. Разделяемые молекулы движутся в геле в зависимости от размера: те из них, которые имеют бóльшие размеры, будут задерживаться при прохождении через поры геля. Меньшие молекулы будут встречать меньшее сопротивление и, соответственно, двигаться быстрее. В результате, после проведения электрофореза, бóльшие молекулы будут находиться ближе к старту, чем меньшие (рис. 2.3).
Рис. 2.3 . Разделение белков методом электрофореза в геле
Методом электрофореза можно разделить белки и по молекулярной массе. Для этого используют электрофорез в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия (ДДS-Na) .
Выделение
индивидуальных белков
Аффинная
хроматография
Метод основан на способности белков прочно связываться с различными молекулами нековалентными связями. Используется для выделения и очистки ферментов, иммуноглобулинов, рецепторных белков.
Молекулы веществ (лиганды), с которыми специфически связываются определенные белки, ковалентно соединяют с частицами инертного вещества. Смесь белков вносят в колонку, и искомый белок прочно присоединяется к лиганду. Остальные белки свободно выходят из колонки. Задержанный белок затем можно вымыть из колонки с помощью буферного раствора, содержащего в свободном состоянии лиганд. Этот высокочувствительный метод позволяет выделить в чистом виде очень малые количества белка из клеточного экстракта, содержащего сотни других белков.
Изоэлектрофокусирование
Метод основан на различной величине ИЭТ белков. Белки разделяют методом электрофореза на пластине с амфолином (это вещество, у которого заранее сформирован градиент pH в диапазоне от 3 до 10). При электрофорезе белки разделяются в соответствии со значением их ИЭТ (в ИЭТ заряд белка будет равен нулю, и он не будет передвигаться в электрическом поле).
Двухмерный электрофорез
Представляет собой сочетание изоэлектрофокусирования и электрофореза с ДДС-Na. Проводят сначала электрофорез в горизонтальном направлении на пластине с амфолином. Белки разделяются в зависимости от заряда (ИЭТ). Затем обрабатывают пластину раствором ДДС-Na и проводят электрофорез в вертикальном направлении. Белки разделяются в зависимости от молекулярной массы.
Иммуноэлектрофорез (Вестерн-блот)
Аналитический метод, используемый для определения специфичных белков в образце (рис 2.4).
Выделение белков из биологического материала.
Разделение белков по молекулярной массе методом электрофореза в ПААГ с ДДС-Na.
Перенос белков с геля на полимерную пластину с целью облегчения дальнейших работ.
Обработка пластины раствором неспецифического белка для заполнения оставшихся пор.
Таким образом, после этого этапа получена пластинка, в порах которой содержатся разделенные белки, а пространство между ними заполнено неспецифическим белком. Теперь надо выявить, есть ли среди белков искомый, ответственный за какое-то заболевание. Для выявления используют обработку антителами. Под первичными антителами понимают антитела к искомому белку. Под вторичными антителами понимают антитела к первичным антителам. В состав вторичных антител вводят дополнительно специальную метку (т.н. молекулярный зонд), чтобы потом можно было визуализировать результаты. В качестве метки используются радиоактивный фосфат или фермент, прочно связанные с вторичным антителом. Связывание сначала с первичными, а затем с вторичными антителами преследует две цели: стандартизация метода и улучшение результатов.
Обработка раствором первичных антител связывание происходит в том месте пластины, где есть антиген (искомый белок).
Удаление несвязавшихся антител (промывка).
Обработка раствором меченых вторичных антител для последующей проявки.
Удаление несвязавшихся вторичных антител (промывка).
Рис. 2.4 . Иммуноэлектрофорез (Вестерн-блот)
В случае присутствия искомого белка в биологическом материале – на пластинке появляется полоса, свидетельствующая о связывании этого белка с соответствующими антителами.
Заголовок
2
2
Выделение и очистка белков осуществляется поэтапно.
1. Гомогенизация
– это тщательное измельчение объектов биохимического исследования до однородного, то есть гомогенного состояния, то есть белки подвергаются тщательной дезинтеграции вплоть до разрушения клеточной стенки.
При этом используют:
а)
ножевые гомогенизаторы типа Уорринга;
б)
пестиковые гомогенизаторы Поттера - Эльвегейма;
в)
шаровые и валковые мельницы – для более плотных объектов;
г)
метод попеременного замораживания и оттаивания, при этом разрыв клеточной стенки происходит под действием кристалликов льда;
д)
метод «азотной бомбы» – под высоким давлением клетки насыщаются азотом, затем давление резко сбрасывают, выделяется газообразный азот, который как бы взрывает клетку изнутри;
е)
УЗ, различные пресс - методы, переваривание клеточных стенок ферментами. В большинстве случаев при гомогенизации выделяется тепло, при этом многие белки могут инактивироваться, поэтому все процедуры проводятся в холодных помещениях при t 0 или охлаждают сырье с помощью льда. При этом тщательно контролируют объем и время разрушения клеток, рабочее давление. Идеальным считается такой гомогенизат, который может подвергнуться дальнейшему экстрагированию.
2. Экстракция белков , то есть их перевод в растворенное состояние; чаще всего экстракцию проводят вместе с измельчением одновременно.
Экстракцию проводят:
а)
растворением в 8-10% растворах солей;
б)
с использованием буферных растворов с рН от кислых до слабощелочных (боратных, фосфатных, цитратных, трис - буферных: смесь трисаминометана с NH2 – CH3 + HCl;
в)
осаждение белков органическими растворителями (этанол, метанол, бутанол, ацетон и их комбинациями), при этом происходит расщепление белково-липидных и белково-белковых компонентов, то есть разрушение ЧСБ.
3. Очистка и фракционирование белков. После экстрагирования производят разделение или фракционирование смеси на индивидуальные белки и их дальнейшую очистку:
а) высаливание – это процесс осаждения белков нейтральными солевыми растворами щелочных и щелочноземельных металлов.
Механизм высаливания – добавляемые анионы и катионы разрушают гидратную белковую оболочку белков, являющуюся одним из факторов устойчивости белковых растворов. Чаще всего применяются растворы сульфатов Na и аммония. Многие белки отличаются по размеру гидратной оболочки и величине заряда. Для каждого белка есть своя зона высаливания. После удаления высаливающего агента белок сохраняет свою биологическую активность и физико-химические свойства. В клинической практике применяется метод высаливания для разделения глобулинов (при добавлении 50% раствора сульфата аммония (NH 4)2SO 4 выпадает осадок) и альбуминов (при добавлении 100% раствора сульфата аммония (NH 4)2SO 4 выпадает осадок).
На величину высаливания оказывают влияние:
1) природа и концентрация соли;
2) рН-среды;
3) температура.
Главную роль при этом играют валентности ионов. Поэтому действие соли оценивают по ионной силе раствора μ:
, то есть ионная сила раствора (μ) равна произведению ½ концентрации каждого иона (С) на квадрат его валентности (V).
Метод Кона является разновидностью высаливания. Одновременно происходит экстракция и осаждения компонентов. Изменяя последовательно температуру (обычно низкие t o –0+8 o С), рН раствора и концентрированного этанола, из плазмы крови последовательно выделяют до 18 фракций белков.
Метод Кона
применяют в фармацевтическом производстве при получении кровезаменителей;
б) методы хроматографии
. Основоположником разработки хроматографических методов анализа считается русский ученый Михаил Цвет (1903). В настоящее время существует много ее разновидностей. В основе метода лежит способность веществ специфически адсорбироваться на адсорбенте, заключенном в колонку или помещенном на каком-либо носителе. При этом происходит разделение анализируемых веществ и их концентрирование в строго определенном слое адсорбента. Затем через колонку пропускают соответствующие элюенты (растворители), которые ослабляют силы адсорбции и вымывают адсорбированные вещества из колонки. Вещества собираются в коллекторе фракций.
Основополагающим в хроматографии является коэффициент распределения , который равен отношению концентрации вещества в подвижной фазе к концентрации вещества в неподвижной фазе (или стационарной фазе ).
Неподвижная стационарная фаза – может быть твердой или жидкой или смесью твердой и жидкой.
Подвижная фаза – жидкая или газообразная, она течет по стационарной, или пропускается через нее.
В зависимости от вида стационарной и подвижной фазы бывают различные модификации хроматографического анализа.
Адсорбционная – основана на различной степени адсорбции белков адсорбентом и растворимости их в соответствующем растворителе.
Применяемые адсорбенты – кремниевая кислота, Al 2 О 3 , CaCO 3 , MgO, древесный уголь. Адсорбент в виде суспензии с растворителем (чаще с буферным раствором) упаковывают в колонке (стеклянная вертикальная трубка). Образец наносят на колонку, затем через нее пропускают растворитель или смесь растворителей.
Разделение основано на том, что вещества с более высоким К распр. (Б), продвигаются по колонке с большей скоростью. Сбор фракций осуществляется с помощью коллектора фракций.
Распределительная хроматография
– основана на распределении смеси белков между двумя жидкими фазами. Разделение может происходить на специальной хроматографической бумаге, а также в колонках, как в адсорбционной. Твердая фаза в данном случае служит только опорой для жидкой стационарной фазы. Хроматографическая бумага обладает свойством задерживать воду между своими целлюлозными волокнами. Эта вода - неподвижная стационарная фаза. Когда по бумаге под действием капиллярных сил движется неводный растворитель (подвижная фаза), молекулы вещества, нанесенного на бумагу, распределяются между двумя фазами в соответствии с их коэффициентом распределения. Чем выше растворимость вещества в подвижной фазе, тем дальше оно продвинется по бумаге вместе с растворителем.
В случае распределения хроматографии на колонке – носители – это целлюлоза, крахмал, силикагель и др., неподвижная фаза – вода. При нанесении на колонку вещества смеси движутся по колонке с разной скоростью с учетом Краспр.
Rf для каждого соединения в стандартных условиях величина постоянная.
Ионообменная хроматография – основана на притяжении противоположно заряженных частиц. Для этого используют различные ионообменные смолы: катионообменные – содержат отрицательно заряженные группы – сульфированные стиролы и КМЦ, которые притягивают положительно заряженные ионы исследуемых веществ. Их называют также кислотными ионообменниками.
Анионообменные смолы, или основные ионообменники, содержат положительно заряженные группы, притягивающие отрицательно заряженные молекулы белков
Триметиламиностирол, это производное стиролов и целлюлозы.
В зависимости от q разделяемых белков используют соответствующие ионообменники, с которыми взаимодействуют определенные белки, а другие беспрепятственно выходят из колонки. «Осажденные» на колонке белки снимают, используя более концентрированные солевые растворы или изменяя рН элюента.
Аффинная хроматография (или хроматография по сродству) основана на принципе избирательного взаимодействия белков или других макромолекул с иммобилизованными на носителях специфическими веществами – лигандами (это может быть кофермент, если выделяют фермент, антитело антиген и др. Благодаря высокой специфичности белков к иммобилизованным лигандам к нему присоединяется только один белок из смеси. Смывается буферными смесями с измененным рН или измененной ионной силой.
Достоинство – возможность одноэтапно выделить заданное вещество высокой степени чистоты.
Метод гель - фильтрации или метод молекулярных «сит» - это разновидность проникающей хроматографии.
Разделение молекул по размерам и форме основано на свойствах молекулярного сита, которые обладают многие пористые материалы, например органические полимеры с трехмерной сетчатой структурой, придающей им свойства гелей. Гель фильтрация – это разделение веществ с помощью гелей, основанное на различиях в размере молекул (сефароза, сефадекс, сефакрил, биогели и т.д.). Под действием эпихлоргидрина полисахаридные цепочки декстрана (синтезируется микроорганизмами) сшиваются в сетчатую структуру, становятся нерастворимыми в воде, но сохраняют к ней большое сродство. Благодаря этой гидрофильности полученные зерна (называемые сефадексом) сильно набухают с образованием геля, которым заполняют колонку. Метод основан на том, что крупные молекулы не проникают во внутреннюю водную фазу, а более мелкие молекулы сперва проникают в поры «сита», как бы застревают в них, а поэтому движутся с меньшей скоростью. Соответственно белки с большей Mr первыми поступают в приемник. В последнее время в проникающей хроматографии все чаще используют в качестве молекулярного сита пористые стеклянные гранулы.
Электрофоретический метод в биохимии – основан на различии скорости передвижения молекул в электрическом поле (аминокислоты, пептиды, белки, нуклеиновые кислоты).
Различие скорости движения зависит:
1. от q молекулы: подвижность молекул тем больше, чем больше суммарный q. Величина q зависит от рН;
2. от размеров молекул: чем крупнее молекулы, тем меньше их подвижность. Это связано с возрастанием сил трения и электростатических взаимодействий крупных молекул с окружающей средой;
3. от формы молекул: молекулы одинакового размера, но различной формы, например, фибрилл и глобул белка обладают различной скоростью. Это связано с различиями в силах трения и электростатического взаимодействия.
Виды электрофореза
а) Изоэлектрическое фокусирование. Разделение происходит на вертикальной колонке в град. как рН, так и напряжения. С помощью специальных носителей амфолитов в колонке устанавливается град. рН от 0 до 14. В колонку помещают смесь веществ, подключаю электроток. Каждый из компонентов движется к той части колонки, где значение рН соответствует его изоэлектрической точке и там останавливается, то есть фокусируется.
Достоинство: происходит разделение, очистка и идентификация белков в один прием. У метода высокая разрешительная способность (0,02 pI).
б) Изотахофорез – это электрофорез на поддерживающих средах. После включения электротока ионы с самой высокой подвижностью движутся к соответствующему электроду первыми, с самой низкой – последними, обладающие промежуточной подвижностью – располагаются посередине.
в) Диск-электрофорез – прибор состоит из двух сосудов с буфером – верхнего и нижнего, соединенных вертикальными трубками, содержащими разнопористый гель. По мере движения ионизированных частиц под действием электротока. Более высокая пористость – в верхней части геля.
г) Иммуноэлектрофорез – метод сочетающий электрофорез с иммунодиффузией (для обнаружения антигенов в сложных физиологических смесях). На специальный носитель перпендикулярно друг другу помещают смесь антигенов и смесь антител. При включении электротока они разделяются на индивидуальные вещества и диффундируют на гелевом носителе. В месте встречи антигена с соответствующим антителом происходит специфическая реакция преципитации в форме дуги. Количеств образовавшихся дуг соответствует количеству антигенов.
Методы определения Mr белков
У большого числа белков химический состав и последовательность аминокислот не установлена (1010–1012 белков), поэтому у таких белков определяют Mr. При этом используются различные методы.
а) Седиментационный метод – определение Mr проводят в специальных центрифугах (первая центрифуга была предложена шведским биохимиком Сведбергом), в которых удается создать центробежное ускорение, которое больше в 200 тыс. и более раз ускорения земного притяжения. Mr определяют по V седиментации молекул. По мере перемещения молекул от центра к периферии образуется резкая граница белок-растворитель. Скорость седиментации выражают через константу седиментации (S):
где V – скорость перемещения границы белок-растворитель (см/с);
– угловая скорость ротора (рад/с);
– расстояние от центра ротора до середины ячейки с раствором белков (см).
Величина константы седиментации S, которая равна 110–13 С условно принята за 1 и называется 1 Сведбергом (S). S для белков лежит в пределах 1-50 S, иногда до 100 S.
Mr белков определяется по уравнению Сведберга:
где R – универсальная газовая постоянная;
Т – абсолютная температура по Кельвину;
S – константа седиментации;
Д – коэффициент диффузии;
– плотность растворителя;
V – парциальный удельный объем газа.
Этот метод дорогостоящий из-за применения аппаратуры.
Более просты и дешевы:
б) Гель-фильтрация в тонком слое сефадекса.
Длина пробега белка (в мм) находится в логарифмической зависимости от Mr.
Х – Mr искомого белка на калибровочном графике.
в) Диск-электрофорез в полиакриламидном слое – также существует зависимость между логарифмом Mr калибровочных белков и длиной их пробега.
Методы определения гомогенности белков
Степень чистоты выделенного белка определяется:
- ультрацентрифугированием;
- методом диск - электрофореза;
- различными иммунохимическими методами;
- определением растворимости белка (метод Нортропа) основан на правиле фаз, согласно которому растворимость чистого вещества при данных условиях опыта зависит только от температуры, но не зависит от концентрации вещества в твердой фазе.
Если белок гомогенный, то на графике получается один перегиб (а), если есть примеси белков (б, в), то получим несколько перегибов кривой насыщения. У всех белков свои индивидуальные кривые растворимости.
Рассматриваемые вопросы:Методы выделения органелл и мембран из тканей, клетки.
Этапы субклеточного фракционирования: экстракция,
гомогенизация и центрифугирование, их особенности.
Методы разделения и очистки субклеточных компонентов.
Выделение мембранных частиц.
Идентификация мембранных фракций, критерии их очистки.
Контроль наличия примесей с помощью световой и
электронной микроскопии, анализа липидного состава или
определении активности маркерных ферментов.
Определение белкового состава в выделяемых мембранных
фракциях. Определение активности маркерных ферментов
определенного типа выделенной мембранной фракции. Получение отдельных клеточных компонентов дает возможность изучать
их биохимию и функциональные особенности. Например, можно создать
бесклеточную систему для рибосом, которые будут синтезировать белок
по заданной экспериментатором информационной РНК. Выделенные
митохондрии в подобранных условиях могуг осуществлять синтез АТФ, на
выделенном хроматине при участии соответствующих ферментов может
происходить синтез РНК и т.д.
В последнее время применяются бесклеточные системы для воссоздания
клеточных надмолекулярных структур. Так, используя очищенные от
гранул желтка экстракты цитоплазмы яиц земноводных или яиц морских
ежей, можно получить ядра с ядерной оболочкой из введенной в эту
бесклеточную систему чужеродной ДНК (например, ДНК бактериофага).
Такая ДНК связывается с белками-гастонами, которые есть в избытке в
таком экстракте, образуется хроматин (дезоксирибонуклеопротеид),
который покрывается двойной мембранной оболочкой, несущей даже
ядерные поры. Такие модельные системы помогают изучать тонкие,
интимные процессы, например транспорт макромолекул из цитоплазмы в
ядро, и наоборот. В цитоплазматических экстрактах яиц земноводных и
иглокожих такие ядра могут периодически делиться путем митоза. Эти
модели внесли огромный вклад в расшифровку природы регуляции
клеточного цикла.Для того чтобы выделить клеточные органеллы,
исследуемый образец измельчают и
затем гомогенизируют в забуференной среде с
использованием гомогенизатора Поттера-Элведжема
(тефлоновый пестик, вращающийся в стеклянном
цилиндре). Это сравнительно мягкий метод, который
особенно предпочтителен для выделения лабильных
молекул и ультраструктур. Другие методики разрушения
клеток включают ферментативный лизис, разрушающий
клеточные стенки, или механическое разрушение
замороженных тканей (размолом или с помощью
вращающихся ножей; под большим давлением;
осмотическим шоком; многократным чередованием
замораживания и оттаивания). Для выделения интактных органелл важно, чтобы среда, в которой
проводится гомогенизация, была изотонической, т.е.
осмотическое давление буфера должно соответствовать давлению
внутри клетки. Если раствор гипотоничен, органеллы будут
«впитывать» дополнительную воду и лопнут, а в
гипертонических растворах они, напротив, сморщиваются.
Вслед за гомогенизацией следует фильтрование для удаления
интактных клеток и соединительных тканей. Собственно
фракционирование клеточных органелл проводится с помощью
дифференциального центрифугирования, т.е. центрифугирования
при различных скоростях вращения ротора. При этом ступенчатое
увеличение центробежной силы (которую принято выражать
величиной, кратной нормальному ускорению свободного падения g
= 9,81 м/с2) приводит к последовательному осаждению различных
органелл, т.е. их разделению в соответствии с плотностью и
размером.Одним из основных способов выделения клеточных структyp является
дифференциальное (разделительное) центрифугирование. Принцип его
применения в том, что время осаждения частиц в гомогенате зависит от их
размера и плотности: чем больше частица или чем она тяжелее, тем быстрее
она осядет на дно пробирки. Для убыстрения процесса оседания варьируют
ускорения, создаваемые центрифугой.
При центрифугировании раньше всего и при небольших ускорениях осядут ядра
и неразрушенные клетки, при 15-30 тыс. g осядут крупные частицы,
макросомы, состоящие из митохондрий, мелких пластид, пероксисом,
лизосом и др., при 50 тыс. g осядут микросомы, фрагменты вакуолярной
системы клетки.
При повторном дробном центрифугировании этих смешанных подфрак-ций
можно получить чистые фракции. Так, при разделении макросомной
подфракции получают отдельно митохондрии, лизосомы, пероксисомы. При
разделении микросом можно получить фракцию мембран аппарата Гольджи,
фрагментов плазматической мембраны, вакуолей, гранулярного ретикулума. В
случаях более тонкого разделения фракций используют центрифугирование в
градиенте плотности сахарозы, что позволяет хорошо разделить компоненты,
даже незначительно отличающиеся друг от друга по удельной массе. Выделение клеточных органелл обычно проводят при низких
температурах (0-5°С) для того, чтобы уменьшить степень
деградации материала за счет реакций, катализируемых
ферментами; последние высвобождаются в процессе разрушения
ткани. Добавление тиолов и хелатирующих агентов необходимо для
защиты функциональных SH-групп от окисления.
Прежде чем выделенные фракции анализировать биохимическими
способами, необходимо проверить их на чистоту с помощью
электронного микроскопа.
Получение отдельных клеточных компонентов дает возможность
изучать их биохимию и функциональные особенности. Так можно
создать бесклеточную систему для рибосом, которые будут
синтезировать белок по заданной экспериментатором
информационной РНК. Выделенные митохондрии в подобранных
условиях могуг осуществлять синтез АТФ, на выделенном хроматине
при участии соответствующих ферментов может происходить
синтез РНК и т.д.Основы метода центрифугирования
Частицы в растворе осаждаются (седиментация),
когда их плотность выше плотности раствора, или
всплывают (флотация), когда их плотность ниже
плотности раствора. Чем больше разница в
плотности, тем быстрее идет распределение частиц.
Когда плотности частиц и раствора одинаковые
(изопикнические условия), частицы остаются
неподвижными. При малой разнице в плотности
частицы можно разделить только в центрифуге,
которая создает центробежную силу, во много раз
превышающую силу земного притяжения.соотношение между плотностью и коэффициентом седиментациидля
различных частиц в растворе хлорида цезия (CsCI). Скорость седиментации частицы (ν) зависит от угловой
скорости (ω), эффективного радиуса ротора rэфф(расстояние от
оси вращения) и седиментационных свойств частиц.
Седиментационные свойства частицы
характеризуются коэффициентом седиментации S и
выражаются в единицах Сведберга (1S = 10-13с).
Величина S может колебаться в широких пределах. Для
сравнения коэффициентов седиментации в различных средах
их обычно корректируют по плотности и вязкости водыпри
20oC (S20w).
Коэффициент седиментации зависит от молекулярной массы
(М) частицы, ее формы (коэффициент трения f),
парциального удельного объема ΰ (величина, обратная
плотности частицы).
Центрифугирование в градиенте плотности
Макромолекулы или органеллы, незначительно различающиеся по размеру или по плотности,
можно разделитьцентрифугированием в градиенте плотности. Для этих целей используются два
метода.
При зональном центрифугировании анализируемая проба (например, белки или клетки)
наслаивается тонким слоем поверх буферного раствора. В процессе центрифугирования частицы
проходят через раствор, так как их плотность выше плотности раствора. Скорость движения
зависит от массы и формы частиц (см. формулы на схемеА). Центрифугирование прекращают
прежде, чем частицы достигнут дна центрифужной пробирки. Затем дно прокалывают и
собирают ряд фракций, содержащих различные частицы. Стабильность градиента плотности в
процессе центрифугирования достигается применением растворов углеводов или коллоидного
силикагеля,концентрация которых возрастает от поверхности к дну пробирки. Градиент плотности
препятствует образованию конвекционных потоков, снижающих качество разделения.
При изопикническом центрифугировании пробу (например ДНК, РНК или вирусы) равномерно
распределяют во всем объеме раствора (обычно CsCI). В этом случае разделение продолжается
значительно дольше, чем при зональном центрифугировании. Градиент плотности создается в
процессе центрифугирования за счет седиментациии диффузии. Со временем каждая частица
попадает в область, соответствующую ее собственной плавучей плотности. Центрифугирование
прекращают, когда устанавливается равновесие. Полученные фракции анализируют, используя
подходящую измерительную технику.Молекулы-маркеры
В процессе фракционирования важно
контролировать чистоту фракций. Присутствие
в определенной фракции той или иной
органеллы и наличие других компонентов
определяют с помощью молекул-маркеров.
Обычно это органеллоспецифичные
ферменты (ферменты-маркеры).
Распределение ферментов-маркеров в клетке
отражает локализацию в ней
соответствующих каталитических реакций.Функции и состав биомембран
Наиболее важными мембранами в животных клетках
являются плазматическая мембрана, внутренняя и
внешняя ядерные мембраны, мембраны
эндоплазматического ретикулума и аппарата Гольджи
, внутренние и внешние митохондриальные
мембраны. Лизосомы, пероксисомы, различные
везикулы также отделены от цитоплазмымембранами
. Клетки растений содержат дополнительно мембраны
хлоропластов, лейкопластов и вакуолей. Все
мембраны полярны, т.е. существует различие в
составах внутреннего и внешнего по отношению к
цитоплазме слоев.Биомембраны и их составляющие выполняют следующие функции:
1. Ограничение и обособление клеток и органелл. Обособление клеток от межклеточной
среды обеспечиваетсяплазматической мембраной, защищающей клетки от
механического и химического воздействий. Плазматическая мембрана обеспечивает
также сохранение разности концентраций метаболитов и неорганических ионов между
внутриклеточной и внешней средой.
2. Контролируемый транспорт метаболитов и ионов определяет внутреннюю среду, что
существенно для гомеостаза, т.е. поддержания постоянной концентрации метаболитов и
неорганических ионов, и других физиологических параметров. Регулируемый и
избирательный транспорт метаболитов и неорганических ионов через поры и
посредством переносчиков становится возможным благодаря обособлению клеток и
органелл с помощью мембранных систем.
3. Восприятие внеклеточных сигналов и их передача внутрь клетки, а также инициация
сигналов.
4. Ферментативный катализ. В мембранах на границе между липидной и водной фазами
локализованы ферменты. Именно здесь происходят реакции с неполярными
субстратами. Примерами служат биосинтез липидов и метаболизмнеполярных
ксенобиотиков. В мембранах локализованы наиболее важные реакции энергетического
обмена, такие, как окислительное фосфорилирование (дыхательная цепь) и фотосинтез.
5. Контактное взаимодействие с межклеточным матриксом и взаимодействие с другими
клетками при слиянии клетоки образовании тканей.
6. Заякоривание цитоскелета, обеспечивающее поддержание формы клеток и органелл
и клеточной подвижности.После гомогенизации образца, центрифугирования гомогената с
разной скоростью получают отдельные фракции, содержащие
клеточные ядра, митохондрии и другие органеллы, а также
надосадочную жидкость, в которой находятся растворимые
белки цитозоля клетки.
Экстракция белков, связанных с мембранами, и разрушение
олигомерных белков на протомеры
Если искомый белок прочно связан с какими-либо структурами
клетки, его необходимо перевести в раствор.
Для разрушения гидрофобных взаимодействий между белками
и липидами мембран в раствор добавляют детергенты: Чаще
всего используют тритон Х-100 или додецилсульфат натрия.
При действии детергентов обычно разрушаются и гидрофобные
взаимодействия между протомерами в олигомерных белкахУдаление из pacтвopa небелковых веществ
Нуклеиновые кислоты, липиды и Другие
небелковые вещества можно удалить из раствора, используя их особенные физикохимические
свойства. Так, липиды легко
удаляются
из
раствора
добавлением
органических
растворителей,
например
ацетона. Однако воздействие должНо бытЬ
кратковременным. так как ацетон вызывает
денатурацию некоторых белков. Нуклеиновые
кислоты осаждают добавлением в раствор
стрептомицина.Выделение липидов мембран осуществляют сразу после получения мембранной
фракции, которую необходимо защищать от действия протео- и липолитических
ферментов, автоокисления.
Обычно все процедуры проводят при низкой температуре, поддерживая определенные
значения pH и ионной силы. Для экстракции липидов используют смесь хлороформ-
метанол. Для одновременной экстракции белков и липидов из теней эритроцитов их
экстрагируют смесью бутанол-вода. При этом большая часть белков переходит в
водный, а липида в бутанольный слой.
Количественный анализ сложных смесей фосфолипидов проводят
хроматографическими методами. Для препаративных целей в основном используют
хроматографию на колонках. Для микроаналитических исследований успешно
применяют тонкослойную хроматографию, с помощью которой можно разделить
практически все классы липидов, локализовать и идентифицировать их при
использовании специальных реактивов.
По элюирующей способности растворители располагаются в следующем
возрастающем порядке петролейный эфир, цикло-гексан, четыреххлористый углерод,
толуол, бензол, хлороформ, диэтиловый эфир, этилацетат, ацетон, н-пропанол,
этанол, метанол, вода. После пропускания растворителей пластинку высушивают на
воздухе и идентифицируют липиды с помощью окрашивания специфическими
реагентами. Для количественного определения фосфолипидов, разделенных
тонкослойной хроматографией, используют спектрофотометрические методы. Исследования мембран в значительной
мере базируются на двух основных
методических приемах: это разборка
нативной (то есть природной) мембраны на
составляющие ее элементы и последующая
полная или частичная сборка искусственной
мембраны с использованием всех или
части компонентов исходной мембраны.
Применительно к мембранам эти приемы
получили название "солюбилизация" и
"реконструкция». Для солюбилизации лучше использовать детергенты с
низкой ККМ, так как такие детергенты легче
встраиваются в мембрану и быстрее вызывают ее
распад до смешанных мицелл. В этом качестве
наиболее эффективны ионные детергенты.
В качестве параметров, характеризующих способность
детергентов к мицеллообразованию, обычно
используют критическую концентрацию
мицеллообразования (ККМ) и число агрегации. ККМ –
это та концентрация, при которой детергент начинает
образовывать мицеллы. До этого он находится в воде
в мономерной форме в состоянии истинного
раствора. Число агрегации показывает, сколько
молекул детергента приходится на одну мицеллу.Чаще всего используются четыре основных способа удаления
детергента: диализ, гель-фильтрация, сильное разбавление
солюбилизата и адсорбция детергента на гидрофобных полимерах.
Более быстрый способ основан на удалении детергента с помощью
гель-фильтрации, когда солюбилизат пропускают через инертный
гель, размер пор которого достаточно велик, чтобы удержать
молекулы детергента, но мал по сравнению с образующимися
мембранными частицами, которые свободно проходят между
гранулами геля.
С максимальной полнотой детергент может быть удален из мембраны
путем его адсорбции на гидрофобных полимерах. Этот способ
особенно хорош для удаления остаточных количеств детергента из
уже сформировавшихся мембранных частиц. Однако для удаления
детергента из исходного солюбилизата он малопригоден, так как на
начальных стадиях реконструкции удаление детергента может
сопровождаться адсорбцией значительных количеств белка и липида
на полимере. Поэтому обычно этот метод используют в комбинации с
другими способами на конечной стадии удаления детергента.
высокой способностью хранения, гарантирующей их активное биологическое начало.
ЛИТЕРАТУРА
1. Клычкова Г.Ю. Разработка технологии комплексного препарата из хрящевой ткани кальмара, лосося и осетра // Материа -лы Всерос. Интернет-конф. молодых ученых. - Владивосток: ТИН -РО-Центр, 2004. - С. 164-170.
2. Мецлер Д. Биохимия. Т. 2. - М., 1980. - 605 с.
3. Суховерхова Г.Ю. Биохимическая характеристика хрящевой ткани гидробионтов и технология БАД к пище: Дис. ... канд. техн. наук. - Владивосток, 2006. - 157 с.
4. Сытова М.В. Научное обоснование комплексной переработки амурских осетровых рыб: Автореф. дис. ... канд. техн. наук
М.: ВНИРО, 2005. - 24 с.
Кафедра пищевой биотехнологии
Поступила 07.02.07 г.
ИДЕНТИФИКАЦИЯ БЕЛКОВЫХ КОМПОНЕНТОВ КЕРА ТИНОВОГО ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗАТА
Ч.Ю. ШАМХАНОВ, Л.В. АНТИПОВА
Грозненский государственный нефтяной институт Воронежская государственная технологическая академия
Одним из наиболее эффективных способов обработки вторичных ресурсов мясной и птицеперерабатывающей промышленности является применение методов современной биотехнологии для получения пищевых гидролизатов . Функционально-технологические свойства полученных продуктов зависят от биохимического состава и молекулярной массы его белковых компонентов.
При использовании физико-химических методов для определения молекулярной массы белков результат зависит не только от массы, но и от электрического заряда и формы молекулы белка, особенно при изменении скорости диффузии белка, скорости седиментации в гравитационном поле . В связи с этим при определении молекулярных масс белков предпочтительнее использовать статистические методы, когда белковый раствор находится в состоянии равновесия, например, при пропускании его через колонку, заполненную гелем .
Цель работы - определение молекулярной массы М белковых компонентов кератинового ферментативного гидролизата и его биохимического состава.
Для определения молекулярной массы белковых компонентов кератинового гидролизата применяли метод гель-фильтрации . Использовали сефадекс в-100 (средний, диаметр частиц 40-120 мкм) с пределами фракционирования 4000-150000 Да.
Колонку размерами 46,0 х 1,9 см заполняли сефа-дексом, обработанным 0,02 М универсальным буфером с рН 7,0. Наносили на нее 1,5 см3 раствора -7 мг/см3 - кератинового гидролизата и элюировали тем же универсальным буфером со скоростью 12 см3/ч. Собирали фракции по 3 см3 и затем определяли в них содержание белка спектрофотометрически на СФ-46 при 280 нм. Для определения молекулярной массы фракций кератинового гидролизата колонку с сефадексом предварительно проградуировали в тех же условиях при помощи нескольких чистых (маркерных) белков с известной М. Калибровочную кривую строили, используя линейную зависимость между ^ М и объемом
элюата Уе, вышедшего с колонки. В табл. 1 представлены некоторые физико-химические характеристики маркерных белков.
Таблица 1
Маркерный белок М, Да 1§ м V, см3
Лизоцим 13930 4,143 54
Трипсин 25700 4,409 48
Пероксидаза 34000 4,531 45
Бычий альбумин 68000 4,832 36
Голубой декстран 2000000 6,301 21
Водорастворимая фракция
керопептида <10000 2,845 72
Водорастворимая фракция кератинового гидролизата выходит с колонки в значительно меньшем объеме, чем маркерный белок лизоцим с наименьшей молекулярной массой. Следовательно, в кератиновом гидролизате (керопептиде) отсутствуют белковые фракции с М > 13930 Да. Ориентировочная масса продуктов гидролиза находится ниже уровня 10000 Да, определяемого методом гель-фильтрации на сефадексе в-100 маркерными белками. Линейная зависимость между ^ М белков и объемом элюата Уе, вышедшего с колонки, представлена на рис. 1 (1 - голубой декстран; 2 - бычий альбумин; 3 - пероксидаза; 4 - трипсин; 5 -лизоцим; 6 - водорастворимая фракция керопептида).
В связи с отсутствием маркерных белков в исследуемом диапазоне 10000-5000 Да поиск фракции водорастворимого белка осуществляли при помощи порис-
Таблица 2
М, Да Растворимый белок и пептиды, мг/см3 Суммарные пептиды и аминокислоты, мкг/см3 Тирозин, мкмоль/см3 Редуцирующие вещества, мкг/см3
0-10000 5,64 7337 7,835 2815
0-5000 4,21 5278 5,960 2272
% от исходной 74,6 71,9 76,1 80,7
тых мембран марок УПМ-100 и УАМ-50 на лабораторной ультрафильтрационной установке (ЗАО НПО «Техкон»). Схема включала саму установку с 5%-м раствором керопептида, помещенную для его постоянного перемешивания на магнитную мешалку. Для эффективного разделения белкового раствора в верхнюю часть установки под давлением подавали сжатый воздух Продукты гидролиза проходили через пористые мембраны, поочередно сменяемые в зависимости от желаемой молекулярной массы ультрафильтрата, в нижнюю часть установки и собирались в приемную емкость. В полученных ультрафильтратах определяли ряд биохимических показателей, позволяющих оценить распределение продуктов гидролиза по молекулярной массе (табл. 2).
В керопептиде присутствуют низкомолекулярные белки с М 5000-10000 Да. Их массовая доля оценивается как разница в показаниях для фракций 0-10000 и 0-5000 Да и составляет 1,43 мг/см3. Эта фракция дала также положительную реакцию на нингидриновую реакцию (2059 мкг/см3), тирозин (1,875 мкмоль/см3) и редуцирующие вещества (543 мкг/см3). Однако основная доля продуктов гидролиза сосредоточена в более низкомолекулярной фракции с М < 5000 Да, соответствующей по существующей классификации фракции пептидов. Массовая доля всех исследуемых показателей составляет более 7 0% от аналогичных значений во фракции 0-10000 Да.
Дальнейшее определение молекулярной массы водорастворимых белковых фракций керопептида проводили на сефадексе в-25 (средний, диаметр частиц 50-150 мкм), позволяющем устанавливать ее в пределах фракционирования 1000-5000 Да. Условия проведения гель-фильтрации оставались неизменными. По
результатам определения белка во фракциях строили профиль элюции. Во всех фракциях помимо белка определяли содержание низкомолекулярных веществ нингидриновым методом, тирозина и редуцирующих веществ (РВ), а также устанавливали количественное распределение белковых фракций. На рис. 2 представлена гель-хроматограмма ферментативного кератино-вого гидролизата через сефадекс в-25 (кривая 1 - белок; 2 - нингидриновая проба; 3 - тирозин; 4 - РВ).
В этом случае белок обнаруживается в виде двух небольших пиков практически в первых же фракциях. Массовая доля белка во фракциях № 1-8 с 3-24 см3
имеет достаточно высокие значения и составляет 0,12-0,18 мг/см3 (кривая 1).
Основная масса продукта выходила с колонки в виде максимального пика белка объемом 27 см3 элюата (фракция № 9, по 3 см3 элюата). Массовая доля белка в этой фракции зарегистрирована на уровне 0,66 мг/см3, что в 3-4 раза выше, чем в остальных исследуемых фракциях.
Дальнейшая элюция керопептида в диапазоне объемов 36-96 см3 выявила три пика с понижением в них массовой доли белка не более 0,08 мг/см3. Полностью раствор керопептида элюируется в конечном объеме 96 см3.
Во фракции № 9 обнаружено все количество имеющихся в наличии РВ массовой долей 66 мкг/см3 (кривая 4). Нингидриновую реакцию применяли при гель-хроматографии для идентификации распределения продуктов гидролиза по молекулярной массе. Установлено, что при взаимодействии избыточного количества нингидрина и белковых продуктов со свободной МН2-группой и в зависимости от количества этих групп можно определить местонахождение белковых
РВ, мкг/см3 175 со Г 5 о л с; ,7 0,
100 125 X - 3 со о о. 0,5
80 § 100 2 _ н 0,4
60 1 изин, 7 сл 0,3
40 1 л 5 о - (П 2 о I- 0,2
20 25 _ 2 ай О 0,1
6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 90 96 V, см
производных при элюции через сефадекс. Так, низкая массовая доля нингидрина (4-6 мкг/см3) весьма точно отражает количество свободных аминогрупп и определяет нахождение высокомолекулярных пептидов с М 3000-5000 Да во фракциях J№ 1-8 (кривая 2). Известно, что в диапазон измерения молекулярной массы продуктов гидролиза < 5000 Да входят только пептиды и аминокислоты. При больших концентрациях белка (фракция № 9) соответственно увеличивается окрашивание его свободных аминогрупп нингидрином -64 мкг/см3. Этот диапазон элюции характеризует наличие во фракциях № 8-12 среднемолекулярных пептидов с М 300-3000 Да. Определяемый с помощью маркерных белков по калибровочной кривой lg M керопептида 2,845 также указывает на его ориентировочную массу > 700 Да. Дальнейший анализ профиля элю-ции по нингидриновой пробе (фракции № 12-36) выявил пик, не соответствующий его концентрации по белку, как наблюдалось для пептидов в предыдущих фракциях. Массовая доля низкомолекулярных веществ во фракции № 23 составила 157 мкг/см3, что более чем в 2 раза превышает аналогичный показатель для пептидов во фракции № 9. Обратная пропорциональная зависимость показателей белка и нингидрино-вой пробы во фракциях № 9 и 23 указывает по качественному анализу на присутствие в последней фракции продуктов гидролиза в виде свободных аминокислот. Принадлежность к ней и аминокислоты тирозина (0,06 мкмоль/см3) является еще одним доказательством высказанного положения.
Таким образом, гель-фильтрация кератинового гидролизата через сефадексы G-100 и G-25 свидетельствует о наличии в нем низкомолекулярного раствори-
мого белка (< 10000 Да), составляющего 25% от его общего количества в гидролизате. Преобладающая часть белковых продуктов - 75% - представлена среднемолекулярными пептидами (300-3000 Да) с ориентировочной М > 700 Да. В данном случае белковые цепочки содержат 5-20 аминокислотных остатков. Важно подчеркнуть, что фракция № 9 одновременно дает реакции на биуретовую связь, нингидрин, тирозин и РВ. Подобная характеристика предполагает наличие в белке кератине углеводов и их непосредственной связи с белком в составе единого комплекса.
ЛИТЕРАТУРА
1. Антипова Л.В., Пащенко Л.П., Шамханов Ч.Ю., Ку -рилова Е.С. Получение и характеристика пищевого кератинового гидролизата // Хранение и переработка сельхозсырья. - 2003. - № 7.
2. Антипова Л.В., Шамханов Ч.Ю., Осминин О.С., По -жалова Н.А. Биохимические характеристики процесса ферментативного гидролиза кератинсодержащего сырья птицеперерабаты -вающей отрасли // Изв. вузов. Пищевая технология. - 2003. - № 5-6.
3. Антипова Л.В., Шамханов Ч.Ю., Осминин О.С. Со -
вершенствование технологии производства керопептида из перо-пу -хового сырья // Мясная индустрия. - 2004. - № 3. - С. 44-47.
4. Рогов И.А., Антипова Л.В., Дунченко Н.И., Жереб -цов Н.А. Химия пищи. В 2 кн. Кн. 1. Белки: структура, функции, роль в питании. - М.: Колос, 2000. - 384 с.
5. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. - М.: Наука, 1985. - 536 с.
6. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимоло-гии. - 2-е изд., перераб. и доп. - М. : Высш. шк., 1980. - 272 с.
Кафедра технологии продуктов питания Кафедра технологии мяса и мясных продуктов
Поступила 0S.02.0? г.
ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ МЕХАНИЗМА КОНСЕРВИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ КОМПОНЕНТОВ КОПТИЛЬНЫХ ЭКСТРАКТОВ
С.В. ЗОЛОТОКОПОВА, И.А. ПАЛАГИНА
Астраханский государственный технический университет Астраханский филиал Саратовского государственного социально-экономического университета
Важным направлением исследований последних лет является изучение влияния различных пищевых добавок не только на вкус и аромат, но и на увеличение сроков хранения продуктов питания. С древних времен для консервирования используют пряные растения, поваренную соль, копчение и др. Анализ показывает, что в настоящее время рынок завоевывают коптильные экстракты. Продукты питания с ароматом копчения пользуются у населения особой популярностью, а традиционное копчение уступает свои позиции бездымному.
Экологически выгодными и перспективными являются экстракты, получаемые при щадящих условиях.
Над усовершенствованием технологии экстракции не одно десятилетие работает Г.И. Касьянов - заслуженный деятель науки и техники РФ, заслуженный изобретатель РФ, доктор технических наук, профессор, заведующий кафедрой технологии мясных и рыбных продуктов Кубанского государственного технологического университета. Действующая при КубГТУ и Краснодарском научно-исследовательском институте хранения и переработки сельскохозяйственной продукции под его руководством научно-педагогическая школа «Теория и практика обработки сырья растительного и животного происхождения сжиженными и сжатыми газами» занимается проблемами повышения эффективности переработки различного сырья, позволяющими улучшить качество выпускаемой продукции, сократить продолжительность процессов обработки и одновременно снизить энергетические затраты.
Для идентификации белков используются различные системы поиска в базах данных EMBL, Sequest, разработанные внутри исследовательских коллективов. Однако стандартом для идентификации белков стала поисковая машина Mascot. Как практически во всех поисковых системах в ней используется вэб-интнерфейс и сама поисковая система доступна в Интернете, но ее также можно приобрести и установить на компьютере пользователя.
Mascot может работать с различными подключаемыми белковыми и геномными базами данных. Это могут быть обширные общедоступные базы, такие как NCBI или SwissProt, коммерческие, а также созданные самим пользователем.
Во всех системах идентификация осуществляется по полученным исследователем масс-спектрометрическим данным, путем их сопоставления с известными структурами белков.
Учитывая, что в последние десятилетия сиквенирование белков свелось, по сути, с сиквенированию кодирующих их генов, на практике разумнее идентифицировать белки сопоставляя экспериментальные масс-спектрометрические данные с известными геномами.
Существуют различные алгоритмы идентификации белков, однако их возможности ограничены известными на сегодняшний день геномами. Хотя, учитывая что организмы разных видов все-таки имют гомологичные белки, зачастую удается идентифицировать белки из организмов с неизвестным геномом.
Различные методические подходы протеомных исследований, дают принципиально различные типы данных, и требуют своих вычислительных подходов при обработке.
Наиболее доступным и высокопроизводительном является метод идентификации по масс-спетрометрическим пептидным картам специфического протеолитического гидролиза. В англоязычной литературе он известен как Peptide Mass Fingerprint (PMF) В качестве специфической протеазы чаще всего используется трипсин. На первом этапе выделенный (например, элетрофорезом) белок подвергается протеолитическому гидролизу. В результате такого гидролиза получается смесь пептидов. Учитывая, что используется высокоспецифичная протеаза, это будет смесь вполне определенных пептидов. Так, при использовании трипсина белок будет "порезан" по аргинину и лизину.
Следующий этап - регистрация масс-спектра полученной смеси. В результате чего получается набор или список молекулярных масс. Он не дает никакой информации о структуре или других свойствах продуктов, в основе метода только предположение что это молекулярные массы пептидов, и эти пептиды образовались в результате специфического гидролиза. Здесь и спрятана главная идея подхода - если каждый белок имеет свой набор пептидов и соответствующий ему перечень молекулярных масс, то вполне возможно и решение обратной задачи - найти для полученного перечня молекулярных масс соответствующий ему белок. И такую задачу действительно часто удается решить.
В частности это позволяет сделать маскот.
