soljenjem: taloženje solima alkalijskih, zemnoalkalijskih metala (natrijev klorid, magnezijev sulfat), amonijev sulfat; istodobno, primarna struktura proteina nije poremećena;
taloženje: korištenje sredstava za odvodnjavanje: alkohol ili aceton na niskim temperaturama (oko -20°C).
Kada se koriste ove metode, proteini gube svoju hidratantnu ljusku i talože se u otopini.
Denaturacija- kršenje prostorne strukture proteina (primarna struktura molekule je očuvana). Može biti reverzibilna (struktura proteina se obnavlja nakon uklanjanja denaturirajućeg agensa) ili nepovratna (prostorna struktura molekule se ne obnavlja, na primjer, kada se proteini precipitiraju koncentriranim mineralnim kiselinama, solima teških metala).
Metode odvajanja proteina Odvajanje proteina od nečistoća male molekularne mase
Dijaliza
Koristi se posebna polimerna membrana koja ima pore određene veličine. Male molekule (nečistoće male molekularne mase) prolaze kroz pore u membrani, dok se velike molekule (proteini) zadržavaju. Tako se proteini ispiru od nečistoća.
Razdvajanje proteina prema molekularnoj težini
Gel kromatografija
Kromatografska kolona je ispunjena granulama gela (Sephadex) koje imaju pore određene veličine. U kolonu se dodaje mješavina proteina. Proteini, čija je veličina manja od veličine pora Sephadexa, zadržavaju se u stupcu, jer se „zapinju“ u porama, a ostali slobodno napuštaju stupac (slika 2.1). Veličina proteina ovisi o njegovoj molekularnoj težini.
Riža. 2.1. Odvajanje proteina gel filtracijom
Ultracentrifugiranje
Ova se metoda temelji na različitim brzinama sedimentacije (precipitacije) proteinskih molekula u otopinama s različitim gradijentima gustoće (saharozni pufer ili cezijev klorid) (slika 2.2).
Riža. 2.2. Odvajanje proteina ultracentrifugiranjem
elektroforeza
Ova se metoda temelji na različitim brzinama migracije proteina i peptida u električnom polju ovisno o naboju.
Kao nosači za elektroforezu mogu poslužiti gelovi, acetat celuloze, agar. Molekule koje treba odvojiti kreću se u gelu ovisno o njihovoj veličini: one veće će se zadržati dok prolaze kroz pore gela. Manje molekule će naići na manji otpor i stoga će se kretati brže. Kao rezultat toga, nakon elektroforeze, veće molekule će biti bliže početku od manjih (slika 2.3).
Riža. 2.3. Odvajanje proteina gel elektroforezom
Proteini se također mogu odvojiti elektroforezom prema molekularnoj težini. Za ovu upotrebu elektroforeza u PAAG u prisutnosti natrijevog dodecil sulfata (SDS-Na).
Izolacija pojedinačnih proteina
Afinitetna kromatografija
Metoda se temelji na sposobnosti proteina da se snažno vežu na različite molekule nekovalentnim vezama. Koristi se za izolaciju i pročišćavanje enzima, imunoglobulina, receptorskih proteina.
Molekule tvari (ligandi), s kojima se određeni proteini specifično vežu, kovalentno se spajaju s česticama inertne tvari. Smjesa proteina je dodana u kolonu, a željeni protein je čvrsto vezan za ligand. Preostali proteini slobodno izlaze iz stupca. Zadržani protein se zatim može isprati iz kolone puferom koji sadrži slobodni ligand. Ova vrlo osjetljiva metoda omogućuje izolaciju vrlo malih količina čistog proteina iz staničnog ekstrakta koji sadrži stotine drugih proteina.
Izoelektrično fokusiranje
Metoda se temelji na različitim IEP vrijednostima proteina. Proteini se odvajaju elektroforezom na ploči s amfolinom (to je tvar koja ima prethodno formirani pH gradijent u rasponu od 3 do 10). Tijekom elektroforeze, proteini se odvajaju prema vrijednosti njihovog IEP-a (u IEP-u će naboj proteina biti nula i neće se kretati u električnom polju).
2D elektroforeza
To je kombinacija izoelektričnog fokusiranja i elektroforeze sa SDS-Na. Najprije se elektroforeza provodi u vodoravnom smjeru na ploči s amfolinom. Proteini se odvajaju ovisno o naboju (CEP). Zatim se ploča tretira otopinom SDS-Na i provodi se elektroforeza u okomitom smjeru. Proteini se klasificiraju na temelju molekularne težine.
Imunoelektroforeza (Western blot)
Analitička metoda koja se koristi za određivanje specifičnih proteina u uzorku (slika 2.4).
Izolacija proteina iz biološkog materijala.
Odvajanje proteina prema molekularnoj masi elektroforezom u PAAG-u sa SDS-Na.
Prijenos proteina iz gela na polimernu ploču kako bi se olakšao daljnji rad.
Obrada ploče nespecifičnom otopinom proteina za popunjavanje preostalih pora.
Tako je nakon ove faze dobivena ploča čije pore sadrže odvojene proteine, a prostor između njih ispunjen je nespecifičnim proteinom. Sada moramo utvrditi jesu li među proteinima koje tražimo odgovorni za neku vrstu bolesti. Za otkrivanje se koristi liječenje antitijelima. Pod primarnim antitijelima podrazumijevaju se antitijela na željeni protein. Pod sekundarnim antitijelima podrazumijevaju se antitijela na primarna antitijela. U sastav sekundarnih antitijela dodaje se dodatna posebna oznaka (tzv. molekularna sonda) kako bi se kasnije mogli vizualizirati rezultati. Radioaktivni fosfat ili enzim čvrsto vezan za sekundarno protutijelo koristi se kao oznaka. Vezanje prvo na primarna, a zatim na sekundarna antitijela ima dva cilja: standardizirati metodu i poboljšati rezultate.
Obrada otopinom primarnih antitijela vezanje se događa na mjestu ploče gdje se nalazi antigen (željni protein).
Uklanjanje nevezanih antitijela (ispiranje).
Liječenje otopinom obilježenih sekundarnih protutijela za kasniji razvoj.
Uklanjanje nevezanih sekundarnih antitijela (ispiranje).
Riža. 2.4. Imunoelektroforeza (Western blot)
U slučaju prisutnosti željenog proteina u biološkom materijalu, na ploči se pojavljuje traka koja ukazuje na vezanje ovog proteina na odgovarajuća protutijela.
Zaglavlje
2
2
Izolacija i pročišćavanje proteina provodi se u fazama.
1. Homogenizacija- ovo je temeljito mljevenje predmeta biokemijskog istraživanja do homogenog, odnosno homogenog stanja, odnosno, proteini prolaze kroz temeljitu dezintegraciju do uništenja stanične stijenke.
Pri tome koriste:
a) Homogenizatori noževa ratnog tipa;
b) homogenizatori za tučak Potter - Elveheim;
u) kuglični i valjkasti mlinovi - za gušće predmete;
G) metoda naizmjeničnog smrzavanja i odmrzavanja, dok do pucanja stanične stijenke dolazi pod djelovanjem kristala leda;
e) metoda "dušikove bombe" - pod visokim tlakom stanice su zasićene dušikom, zatim se tlak naglo oslobađa, oslobađa se plinoviti dušik, koji, takoreći, eksplodira stanicu iznutra;
e) Ultrazvuk, razne press metode, probava staničnih stijenki enzimima. U većini slučajeva dolazi do oslobađanja topline tijekom homogenizacije, dok se mnogi proteini mogu inaktivirati, pa se svi postupci provode u hladnim prostorijama na t 0 ili se sirovine hlade ledom. Istodobno se pomno kontrolira volumen i vrijeme uništavanja stanice, kao i radni tlak. Idealan homogenizat je onaj koji se može dalje ekstrahirati.
2. Ekstrakcija proteina, odnosno njihov prijenos u otopljeno stanje; najčešće se ekstrakcija provodi zajedno s mljevenjem u isto vrijeme.
Ekstrakcija se provodi:
a) otapanje u 8-10% otopinama soli;
b) korištenjem puferskih otopina s pH od kiselog do slabo alkalnog (borat, fosfat, citrat, tris - pufer: smjesa trisaminometana s NH2 - CH3 + HCl;
u) taloženje proteina organskim otapalima (etanol, metanol, butanol, aceton i njihove kombinacije), uz cijepanje proteinsko-lipidnih i proteinsko-proteinskih komponenti, odnosno uništavanje HSB-a.
3. Pročišćavanje i frakcioniranje proteina. Nakon ekstrakcije, smjesa se odvaja ili frakcionira na pojedinačne proteine i dalje pročišćava:
a) soljenje- to je proces taloženja proteina neutralnim otopinama soli zemnoalkalijskih i zemnoalkalijskih metala.
mehanizam za soljenje– dodani anioni i kationi uništavaju hidratiziranu proteinsku ljusku proteina, što je jedan od faktora stabilnosti proteinskih otopina. Najčešće se koriste otopine Na i amonijevih sulfata. Mnogi proteini se razlikuju po veličini hidratacijske ljuske i veličini naboja. Svaki protein ima svoju zonu isoljavanja. Nakon uklanjanja agensa za soljenje, protein zadržava svoju biološku aktivnost i fizikalno-kemijska svojstva. U kliničkoj praksi metoda isoljavanja koristi se za odvajanje globulina (uz dodatak 50% otopine amonijevog sulfata (NH 4) 2SO 4 nastaje talog) i albumina (uz dodatak 100% otopine amonij sulfata (NH 4) 2SO 4 formira se talog).
Na soljenje utječu:
1) priroda i koncentracija soli;
2) pH okoline;
3) temperatura.
Glavnu ulogu imaju valencije iona. Stoga se učinak soli procjenjuje ionskom jakošću otopine μ:
, odnosno ionska snaga otopine (μ) jednaka je umnošku ½ koncentracije svakog iona (C) i kvadrata njegove valencije (V).
Kohnova metoda je vrsta soljenja. Istovremeno se odvija ekstrakcija i taloženje komponenti. Sukcesivnom promjenom temperature (obično niske t o -0 + 8 o C), pH otopine i koncentriranog etanola, do 18 proteinskih frakcija se uzastopno izolira iz krvne plazme.
Kohnova metoda koristi se u farmaceutskoj proizvodnji u proizvodnji krvnih nadomjestaka;
b) kromatografske metode. Ruski znanstvenik Mihail Cvet (1903.) smatra se utemeljiteljem razvoja kromatografskih metoda analize. Trenutno postoji mnogo njegovih sorti. Metoda se temelji na sposobnosti tvari da se specifično adsorbiraju na adsorbensu zatvorenom u koloni ili stavljenom na neki nosač. Kada se to dogodi, vrši se odvajanje analiziranih tvari i njihova koncentracija u strogo definiranom sloju adsorbenta. Zatim se kroz kolonu propuštaju odgovarajući eluensi (otapala), koji slabe adsorpcijske sile i ispiru adsorbirane tvari iz kolone. Tvari se skupljaju u kolektoru frakcija.
Osnova kromatografije je omjer raspodjele, što je jednako omjeru koncentracije tvari u mobilna faza na koncentraciju tvari u stacionarna faza(ili stacionarna faza).
Stacionarna stacionarna faza– može biti kruta ili tekuća ili mješavina krutine i tekućine.
mobilna faza- tekući ili plinoviti, teče kroz stacionar, ili se kroz njega prolazi.
Ovisno o vrsti stacionarne i mobilne faze, postoje različite modifikacije kromatografske analize.
Adsorpcija- temelji se na različitom stupnju adsorpcije proteina od strane adsorbensa i njihovoj topljivosti u odgovarajućem otapalu.
Adsorbensi koji se koriste su silicijska kiselina, Al 2 O 3 , CaCO 3 , MgO, drveni ugljen. Adsorbens u obliku suspenzije s otapalom (obično s puferskom otopinom) se pakira u stupac (staklena okomita cijev). Uzorak se nanosi na kolonu, zatim se kroz nju propušta otapalo ili smjesa otapala.
Razdvajanje se temelji na činjenici da tvari s višom raspodjelom K. (B) kretanje duž stupa bržom brzinom. Frakcije se skupljaju pomoću kolektora frakcija.
Razdjelna kromatografija- temelji se na raspodjeli mješavine proteina između dvije tekuće faze. Odvajanje se može odvijati na posebnom kromatografskom papiru, kao i u kolonama, kao kod adsorpcije. Čvrsta faza u ovom slučaju služi samo kao potpora za tekuću stacionarnu fazu. Kromatografski papir ima svojstvo zadržavanja vode između svojih celuloznih vlakana. Ova voda je stacionarna stacionarna faza. Kada se nevodeno otapalo (mobilna faza) kreće kroz papir pod djelovanjem kapilarnih sila, molekule tvari taložene na papiru se raspoređuju između dvije faze u skladu s njihovim koeficijentom raspodjele. Što je veća topljivost tvari u mobilnoj fazi, to će se dalje kretati duž papira zajedno s otapalom.
U slučaju raspodjele kromatografije na koloni, nosači su celuloza, škrob, silikagel itd., stacionarna faza je voda. Kada se nanese na stupac, tvari smjese kreću se duž stupca različitim brzinama, uzimajući u obzir Krasp.
Rf za svaki spoj pod standardnim uvjetima je konstantna vrijednost.
Kromatografija ionske izmjene - temelji se na privlačenju suprotno nabijenih čestica. Za to se koriste različite smole za ionsku izmjenu: smole za kationsku izmjenu sadrže negativno nabijene skupine - sulfonirane stirene i CMC, koji privlače pozitivno nabijene ione ispitivanih tvari. Nazivaju se i kiselinski ionski izmjenjivači.
Anionske izmjenjivače, ili bazični ionski izmjenjivači, sadrže pozitivno nabijene skupine koje privlače negativno nabijene proteinske molekule.
Trimetilaminostiren je derivat stirena i celuloze.
Ovisno o q proteina koji se odvajaju, koriste se odgovarajući ionski izmjenjivači s kojima određeni proteini stupaju u interakciju, dok drugi slobodno napuštaju kolonu. Proteini "precipitirani" na koloni uklanjaju se upotrebom koncentriranijih slanih otopina ili promjenom pH eluensa.
Afinitetna kromatografija (ili afinitetna kromatografija) temelji se na principu selektivne interakcije proteina ili drugih makromolekula sa specifičnim tvarima imobiliziranim na nosačima - ligandima (ovo može biti koenzim ako se izolira enzim, protutijelo, antigen i sl. Zbog visoka specifičnost proteina, imobilizirani ligandi su vezani na njega samo jedan protein po smjesi. Ispere se puferskim smjesama s promijenjenim pH ili promijenjenom ionskom snagom.
Prednost je mogućnost izolacije određene tvari visokog stupnja čistoće u jednom koraku.
Metoda gel filtracije ili metoda molekularnog sita je vrsta permeacijske kromatografije.
Razdvajanje molekula po veličini i obliku temelji se na svojstvima molekularnog sita koje imaju mnogi porozni materijali, kao što su organski polimeri s trodimenzionalnom mrežnom strukturom koja im daje svojstva gelova. Gel filtracija je odvajanje tvari pomoću gelova na temelju razlika u veličini molekula (sefaroza, sefadeks, sefakril, biogelovi itd.). Pod djelovanjem epiklorohidrina, polisaharidni lanci dekstrana (sintetizirani mikroorganizmima) su umreženi u mrežnu strukturu, postaju netopivi u vodi, ali zadržavaju visok afinitet za nju. Zbog ove hidrofilnosti, rezultirajuća zrna (nazvana Sephadex) snažno nabubre i tvore gel koji se puni u kolonu. Metoda se temelji na činjenici da velike molekule ne prodiru u unutarnju vodenu fazu, a manje molekule prvo prodiru u pore „sita“, kao da su zaglavljene u njima, te se stoga kreću manjom brzinom. Sukladno tome, proteini s višim Mr prvi ulaze u prijemnik. U posljednje vrijeme, porozne staklene kuglice sve se više koriste kao molekularno sito u permeacijskoj kromatografiji.
Elektroforetska metoda u biokemiji temelji se na razlici u brzini kretanja molekula u električnom polju (aminokiseline, peptidi, proteini, nukleinske kiseline).
Razlika u brzini ovisi o:
1. na q molekule: što je veća pokretljivost molekula, to je veći ukupni q. Vrijednost q ovisi o pH;
2. na veličinu molekula: što su molekule veće, to je njihova mobilnost manja. To je zbog povećanja sila trenja i elektrostatičkih interakcija velikih molekula s okolinom;
3. o obliku molekula: molekule iste veličine, ali različitog oblika, na primjer, fibrile i proteinske globule imaju različite brzine. To je zbog razlika u silama trenja i elektrostatičke interakcije.
Vrste elektroforeze
a) Izoelektrično fokusiranje. Odvajanje se događa na okomitom stupcu u stupnjevima. i pH i napon. Uz pomoć posebnih nosača amfolita u koloni se uspostavlja tuča. pH od 0 do 14. U stupac se stavlja smjesa tvari, a priključuje se električna struja. Svaka od komponenti prelazi u onaj dio kolone gdje pH vrijednost odgovara njegovoj izoelektričnoj točki i tu se zaustavlja, odnosno fokusira se.
Prednost: odvaja, pročišćava i identificira proteine u jednom koraku. Metoda ima visoku rezoluciju (0,02 pI).
b) Izotahoforeza je elektroforeza na podlogu. Nakon uključivanja električne struje, ioni s najvećom pokretljivošću prvi se kreću do odgovarajuće elektrode, a najniža - zadnja, koja ima srednju pokretljivost - nalazi se u sredini.
c) Disk elektroforeza – aparat se sastoji od dvije posude s puferom – gornje i donje, povezane okomitim cijevima koje sadrže gel različitih pora. Kako se ionizirane čestice kreću pod djelovanjem električne struje. Veća poroznost je na vrhu gela.
d) Imunoelektroforeza - metoda koja kombinira elektroforezu s imunodifuzijom (za detekciju antigena u složenim fiziološkim smjesama). Smjesa antigena i smjesa antitijela postavljaju se okomito jedno na drugo na poseban nosač. Kada se uključi električna struja, one se odvajaju u pojedinačne tvari i difundiraju na nosaču gela. Na mjestu susreta antigena s odgovarajućim protutijelom javlja se specifična reakcija precipitacije u obliku luka. Broj formiranih lukova odgovara broju antigena.
Metode za određivanje Mr proteina
U velikom broju proteina nije utvrđen kemijski sastav i slijed aminokiselina (1010-1012 proteina), stoga je g. Za to se koriste različite metode.
a) Metoda sedimentacije - određivanje Mr provodi se u posebnim centrifugama (prvu centrifugu je predložio švedski biokemičar Svedberg), u kojima je moguće stvoriti centrifugalno ubrzanje koje je više od 200 tisuća ili više puta veće od ubrzanja zemljina gravitacija. Mr se određuje iz V taloženja molekula. Kako se molekule kreću od središta prema periferiji, nastaje oštro sučelje protein-otapalo. Brzina sedimentacije izražava se kroz konstantu sedimentacije (S):
gdje je V brzina kretanja sučelja protein-otapalo (cm/s);
je kutna brzina rotora (rad/s);
je udaljenost od središta rotora do sredine stanice s otopinom proteina (cm).
Vrijednost konstante sedimentacije S, koja je jednaka 110–13 C, uvjetno se uzima kao 1 i naziva se 1 Svedberg (S). S za proteine se kreće od 1-50 S, ponekad do 100 S.
Mr proteina određuje se Svedbergovom jednadžbom:
gdje je R univerzalna plinska konstanta;
T je apsolutna temperatura u Kelvinima;
S je konstanta sedimentacije;
D je koeficijent difuzije;
je gustoća otapala;
V je parcijalni specifični volumen plina.
Ova metoda je skupa zbog korištenja opreme.
Jednostavnije i jeftinije:
b) Gel filtracija u tankom sloju Sephadexa.
Duljina puta proteina (u mm) je logaritamska za Mr.
X - Mr željenog proteina na kalibracijskom grafikonu.
c) Elektroforeza diska u poliakrilamidnom sloju - također postoji veza između logaritma Mr kalibracijskih proteina i njihove duljine puta.
Metode za određivanje homogenosti proteina
Stupanj čistoće izoliranog proteina određuje se:
- ultracentrifugiranje;
- metoda disk-elektroforeze;
- razne imunokemijske metode;
- određivanje topljivosti proteina (Nortropova metoda) temelji se na pravilu faza, prema kojem topljivost čiste tvari u zadanim eksperimentalnim uvjetima ovisi samo o temperaturi, ali ne ovisi o koncentraciji tvari u čvrstoj fazi.
Ako je protein homogen, onda se na grafu (a) dobije jedna infleksija, ako ima proteinskih nečistoća (b, c), tada ćemo dobiti nekoliko pregiba krivulje zasićenja. Svi proteini imaju svoje individualne krivulje topljivosti.
Pitanja koja se razmatraju:Metode za izolaciju organela i membrana iz tkiva, stanica.
Faze substanične frakcionacije: ekstrakcija,
homogenizacija i centrifugiranje, njihove značajke.
Metode odvajanja i pročišćavanja substaničnih komponenti.
Izolacija membranskih čestica.
Identifikacija membranskih frakcija, kriteriji za njihovo pročišćavanje.
Praćenje prisutnosti nečistoća pomoću svjetla i
elektronska mikroskopija, analiza lipida, odn
određivanje aktivnosti markerskih enzima.
Određivanje sastava proteina u izoliranoj membrani
razlomci. Određivanje aktivnosti markerskih enzima
određeni tip izolirane membranske frakcije. Dobivanje pojedinačnih staničnih komponenti omogućuje proučavanje
njihova biokemija i funkcionalna svojstva. Na primjer, možete stvoriti
sustav bez stanica za ribosome koji će sintetizirati protein
prema glasničkoj RNK koju je dao eksperimentator. Posvećen
mitohondrije u odabranim uvjetima mogu provoditi sintezu ATP-a, na
izolirani kromatin uz sudjelovanje odgovarajućih enzima može
Dolazi do sinteze RNA itd.
Nedavno se za rekreaciju koriste sustavi bez stanica
stanične supramolekularne strukture. Dakle, korištenjem pročišćenog od
granule žumanjka ekstrakti citoplazme jaja vodozemaca ili morskih jaja
ježevi, možete dobiti jezgre s nuklearnom ljuskom iz unesenih u ovo
sustav strane DNK bez stanica (na primjer, DNK bakteriofaga).
Takva se DNK veže na proteine gastona, kojih ima u izobilju
takav ekstrakt nastaje kromatin (deoksiribonukleoprotein),
koji je prekriven dvostrukom membranskom ljuskom, nosi ravnomjerno
nuklearne pore. Takvi modelski sustavi pomažu u proučavanju suptilnih,
intimni procesi, kao što je transport makromolekula iz citoplazme u
jezgra i obrnuto. U citoplazmatskim ekstraktima jaja vodozemaca i
Kod bodljokožaca takve se jezgre mogu povremeno dijeliti mitozom. Ove
modeli su dali ogroman doprinos dešifriranju prirode regulacije
stanični ciklus. Za izolaciju staničnih organela
ispitni uzorak se drobi i
zatim homogeniziran u puferiranom mediju sa
pomoću Potter-Elwedge homogenizatora
(Teflonski tučak koji se okreće u čaši
cilindar). Ovo je relativno blaga metoda, koja
osobito korisno za izolaciju labilnih
molekule i ultrastrukture. Druge tehnike uništavanja
stanice uključuju enzimsku lizu, koja uništava
stanične stijenke ili mehaničko uništenje
smrznuta tkiva (mljevenjem ili upotrebom
rotirajući noževi; pod velikim pritiskom;
osmotski šok; višestruka izmjena
smrzavanje i odmrzavanje). Za izolaciju intaktnih organela važno je da okolina u kojoj
homogenizacija je provedena, bila je izotonična, t.j.
osmotski tlak pufera mora odgovarati tlaku
unutar ćelije. Ako je otopina hipotonična, organele će
"upija" dodatnu vodu i prsne, i u
u hipertonskim otopinama, naprotiv, smanjuju se.
Nakon homogenizacije slijedi filtriranje radi uklanjanja
netaknute stanice i vezivna tkiva. Zapravo
frakcioniranje staničnih organela provodi se pomoću
diferencijalno centrifugiranje, t.j. centrifugiranje
pri različitim brzinama rotora. U isto vrijeme, stepenasti
povećanje centrifugalne sile (koje se obično izražava
višekratnik normalnog gravitacijskog ubrzanja g
= 9.81 m/s2) dovodi do uzastopnog taloženja raznih
organele, tj. odvajajući ih prema gustoći i
veličina. Jedna od glavnih metoda za izolaciju staničnih struktura je
diferencijalno (razdvojno) centrifugiranje. Njegov princip
primjene u tome što vrijeme taloženja čestica u homogenatu ovisi o njihovoj
veličina i gustoća: što je čestica veća ili je teža, to je brže
potonut će na dno cijevi. Da biste ubrzali proces taloženja, varirajte
ubrzanje koje stvara centrifuga.
Prilikom centrifugiranja, jezgre će se najprije slegnuti i pri malim ubrzanjima
i neuništene stanice, na 15-30 tisuća g velike će se čestice taložiti,
makrosomi koji se sastoje od mitohondrija, malih plastida, peroksisoma,
lizosomi, itd., na 50 tisuća g, mikrosomi, fragmenti vakuola
stanični sustavi.
S ponovljenim frakcijskim centrifugiranjem ovih miješanih podfrakcija
mogu se dobiti čiste frakcije. Dakle, pri odvajanju makrosomskog
subfrakcije primaju odvojeno mitohondrije, lizosome, peroksisome. Na
odvajanjem mikrosoma, moguće je dobiti dio membrana Golgijevog aparata,
fragmenti plazma membrane, vakuole, granularni retikulum. NA
U slučajevima finijeg odvajanja frakcija koristi se centrifugiranje
gradijent gustoće saharoze, koji omogućuje dobro odvajanje komponenti,
čak se malo razlikuju jedno od drugog po specifičnoj težini. Izolacija staničnih organela obično se provodi na niskom
temperature (0-5°C) kako bi se smanjio stupanj
degradacija materijala zbog kataliziranih reakcija
enzimi; potonji se oslobađaju u procesu uništenja
tkanine. Dodatak tiola i kelatora je neophodan za
zaštita funkcionalnih SH-skupina od oksidacije.
Prije nego što se izolirane frakcije analiziraju biokemijski
metodama, potrebno ih je provjeriti na čistoću korištenjem
elektronski mikroskop.
Dobivanje pojedinačnih staničnih komponenti to omogućuje
proučavati njihovu biokemiju i funkcionalne značajke. Dakle moguće je
stvoriti sustav bez stanica za ribosome koji će
sintetizirati protein kako je odredio eksperimentator
glasničku RNA. Izolirani mitohondriji u podudarnim
uvjetima može provesti sintezu ATP-a, na odabranom kromatinu
uz sudjelovanje odgovarajućih enzima može nastati
sinteza RNA itd. Osnove metode centrifugiranja
Čestice u otopini se talože (sedimentacija),
kada je njihova gustoća veća od gustoće otopine, ili
plutati (plutati) kada je njihova gustoća manja
gustoća otopine. Što je veća razlika u
gustoće, to je brža raspodjela čestica.
Kada su gustoće čestica i otopine iste
(izopični uvjeti), čestice ostaju
nepomično. Uz malu razliku u gustoći
čestice se mogu odvojiti samo u centrifugi,
koji stvara centrifugalnu silu, mnogo puta
veća od sile teže. odnos između gustoće i faktora sedimentacije za
razne čestice u otopini cezijevog klorida (CsCI). Brzina sedimentacije čestica (ν) ovisi o kutu
brzina (ω), efektivni polumjer rotora ref (udaljenost od
os rotacije) i sedimentacijskih svojstava čestica.
Sedimentacijska svojstva čestice
karakterizirani su koeficijentom sedimentacije S i
izraženi su u Svedbergovim jedinicama (1S = 10-13s).
Vrijednost S može uvelike varirati. Za
usporedba koeficijenata sedimentacije u različitim sredinama
obično se korigiraju za gustoću i viskoznost vode na
20oC (S20w).
Koeficijent sedimentacije ovisi o molekulskoj masi
(M) čestice, njihovi oblici (koeficijent trenja f),
djelomični specifični volumen ΰ (recipročna vrijednost
gustoća čestica).
Centrifugiranje s gradijentom gustoće
Makromolekule ili organele koje se neznatno razlikuju po veličini ili gustoći
mogu se odvojiti centrifugiranjem s gradijentom gustoće. U tu svrhu dva
metoda.
U zonskom centrifugiranju, uzorak koji se analizira (npr. proteini ili stanice)
slojevito u tankom sloju na vrh otopine pufera. Tijekom centrifugiranja čestica
proći kroz otopinu jer je njihova gustoća veća od gustoće otopine. Brzina putovanja
ovisi o masi i obliku čestica (vidi formule u shemi A). Zaustavite centrifugiranje
prije nego što čestice stignu do dna centrifugalne cijevi. Zatim se dno probuši i
prikupiti brojne frakcije koje sadrže različite čestice. Stabilnost gradijenta gustoće u
proces centrifugiranja postiže se korištenjem otopina ugljikohidrata ili koloidnih
silika gel, čija koncentracija raste od površine prema dnu epruvete. gradijent gustoće
sprječava nastanak konvekcijskih struja koje smanjuju kvalitetu odvajanja.
U izopikničkom centrifugiranju uzorak (npr. DNA, RNA ili virusi) je jednoličan
raspoređeni po volumenu otopine (obično CsCI). U ovom slučaju, podjela se nastavlja
mnogo dulje nego kod zonskog centrifugiranja. Gradijent gustoće se stvara u
proces centrifugiranja zbog sedimentacije i difuzije. S vremenom svaka čestica
pada u područje koje odgovara njegovoj vlastitoj gustoći plutanja. centrifugiranje
zaustaviti kada se uspostavi ravnoteža. Rezultirajuće frakcije analizirane su korištenjem
odgovarajuću tehniku mjerenja. markerske molekule
U procesu frakcioniranja, važno je
kontrolirati čistoću frakcija. Prisutnost
u određenoj frakciji jednog ili drugog
organele i prisutnost drugih komponenti
određena pomoću markerskih molekula.
Oni su obično specifični za organele
enzimi (markerni enzimi).
Raspodjela markerskih enzima u stanici
odražava lokalizaciju
odgovarajuće katalitičke reakcije. Funkcije i sastav biomembrana
Najvažnije membrane u životinjskim stanicama
su plazma membrana, unutarnja i
vanjska nuklearna membrana, membrana
endoplazmatski retikulum i golgijev aparat
, unutarnji i vanjski mitohondrijski
membrane. Lizosomi, peroksisomi, razni
vezikule su također odvojene od citoplazme membranama
. Biljne stanice sadrže dodatne membrane
kloroplasti, leukoplasti i vakuole. svi
membrane su polarne, t.j. postoji razlika u
sastavi unutarnjeg i vanjskog u odnosu na
slojeva citoplazme. Biomembrane i njihove komponente obavljaju sljedeće funkcije:
1. Ograničenje i izolacija stanica i organela. Odvajanje stanica od izvanstaničnih
okoliš osigurava plazma membrana, koja štiti stanice od
mehanički i kemijski utjecaji. Plazma membrana osigurava
također održavajući razliku u koncentracijama metabolita i anorganskih iona između
unutarstanično i vanjsko okruženje.
2. Kontrolirani transport metabolita i iona određuje unutarnji okoliš, koji
bitna za homeostazu, tj. održavanje stalne koncentracije metabolita i
anorganskih iona i drugih fizioloških parametara. podesivo i
selektivni transport metabolita i anorganskih iona kroz pore i
kroz prijenosnike postaje moguće zbog izolacije stanica i
organele kroz membranske sustave.
3. Percepcija izvanstaničnih signala i njihov prijenos u stanicu, kao i inicijacija
signale.
4. Enzimska kataliza. U membranama na granici između lipidne i vodene faze
lokalizirani enzimi. Ovdje su reakcije s nepolarnim
podloge. Primjeri su biosinteza lipida i metabolizam nepolarnih
ksenobiotici. Najvažnije energetske reakcije lokalizirane su u membranama.
metabolizam, kao što je oksidativna fosforilacija (dišni lanac) i fotosinteza.
5. Kontaktna interakcija s međustaničnim matriksom i interakcija s drugima
stanice tijekom stanične fuzije i stvaranja tkiva.
6. Sidrenje citoskeleta za održavanje oblika stanica i organela
i pokretljivost stanica. Nakon homogenizacije uzorka, centrifugiranje homogenata s
zasebne frakcije koje sadrže
stanične jezgre, mitohondrije i druge organele, kao i
supernatant koji sadrži topive
proteini citosola stanica.
Ekstrakcija proteina povezanih s membranom i razgradnja
oligomernih proteina u protomere
Ako je željeni protein snažno povezan s bilo kojom strukturom
stanica, mora se prenijeti u otopinu.
Za prekid hidrofobnih interakcija između proteina
i membranski lipidi, u otopinu se dodaju deterdženti:
samo koristite triton X-100 ili natrijev dodecil sulfat.
Pod djelovanjem deterdženata, hidrofobno
interakcije između protomera u oligomernim proteinima Uklanjanje neproteinskih tvari iz otopine
Nukleinske kiseline, lipidi i drugi
neproteinske tvari mogu se ukloniti iz otopine pomoću njihove posebne fizikalno-kemijske
Svojstva. Dakle, lipidi su laki
su uklonjeni
iz
riješenje
dodajući
organski
otapala
Na primjer
aceton. Međutim, utjecaj mora biti
kratkoročno. jer aceton uzrokuje
denaturacija nekih proteina. Nukleinska
kiseline se talože dodavanjem u otopinu
streptomicin. Izolacija membranskih lipida provodi se odmah nakon dobivanja membrane
frakcija koju je potrebno zaštititi od djelovanja proteo- i lipolitika
enzimi, autooksidacija.
Obično se svi postupci provode na niskoj temperaturi, održavajući određene
Vrijednosti pH i ionske jakosti. Za ekstrakciju lipida koristi se mješavina kloroforma-
metanol. Za istovremenu ekstrakciju proteina i lipida iz sjene eritrocita, njihova
ekstrahiran smjesom butanol-voda. Istovremeno se većina proteina pretvara u
vode i lipida u sloj butanola.
Provedena je kvantitativna analiza složenih smjesa fosfolipida
kromatografske metode. U pripremne svrhe uglavnom se koriste
kolonska kromatografija. Za uspješno mikroanalitičke studije
za odvajanje se koristi tankoslojna kromatografija
praktički sve klase lipida, kako bi ih lokalizirali i identificirali na
korištenjem posebnih reagensa.
Otapala su rangirana prema njihovoj moći eluiranja.
uzlazni petroleter, cikloheksan, ugljik tetraklorid,
toluen, benzen, kloroform, dietil eter, etil acetat, aceton, n-propanol,
etanol, metanol, voda. Nakon prolaska kroz otapala, ploča se suši
zraka i identificirati lipide bojenjem specifičnim
reagensi. Za kvantitativno određivanje fosfolipida odvojeni
tankoslojnom kromatografijom, spektrofotometrijskim metodama. Istraživanje membrana je uvelike
mjere se temelje na dvije glavne
metodološke tehnike: ovo je rastavljanje
nativnu (tj. prirodnu) membranu na
njegovih sastavnih elemenata i naknadnih
potpuna ili djelomična montaža umjetnih
membrane koristeći sve ili
dijelovi izvornih komponenti membrane.
Primijenjene na membrane, ove tehnike
naziva "solubilizacija" i
"rekonstrukcija". Za solubilizaciju je bolje koristiti deterdžente sa
niska CMC, budući da su takvi deterdženti lakši
ugrađeni u membranu i uzrokuju ga brže
raspadanje do mješovitih micela. U ovom svojstvu
najučinkovitiji ionski deterdženti.
Kao parametri koji karakteriziraju sposobnost
deterdženti za micelizaciju, obično
koristiti kritičnu koncentraciju
micelizacija (CMC) i broj agregacije. KKM -
je koncentracija pri kojoj deterdžent počinje
formiraju micele. Prije toga je u vodi
u monomernom obliku u pravom stanju
riješenje. Zbirni broj pokazuje koliko
molekula deterdženta po miceli. Postoje četiri glavne metode uklanjanja koje se najčešće koriste.
deterdžent: dijaliza, gel filtracija, visoko razrjeđenje
adsorpcija solubilizata i deterdženta na hidrofobnim polimerima.
Brži način temelji se na uklanjanju deterdženta s
gel filtracija, kada se solubilizat propušta kroz inert
gel čija je veličina pora dovoljno velika da zadrži
molekule deterdženta, ali male u usporedbi s dobivenim
čestice membrane koje slobodno prolaze između
granule gela.
Uz maksimalnu potpunost, deterdžent se može ukloniti s membrane
svojom adsorpcijom na hidrofobne polimere. Ovuda
posebno dobar za uklanjanje ostataka deterdženta sa
već formirane čestice membrane. Međutim, za uklanjanje
deterdžent iz početnog solubilizata, od male je koristi, budući da
rane faze rekonstrukcije, uklanjanje deterdžent limenke
biti popraćeno adsorpcijom značajnih količina proteina i lipida
na polimeru. Stoga se ova metoda obično koristi u kombinaciji s
drugim sredstvima u završnoj fazi uklanjanja deterdženta.
visok kapacitet skladištenja, što jamči njihov aktivni biološki princip.
KNJIŽEVNOST
1. Klychkova G.Yu. Razvoj tehnologije za složeni pripravak od hrskavičnog tkiva lignje, lososa i jesetra // Proceedings of Vseros. Internet konf. mladi znanstvenici. - Vladivostok: TIN-RO-Centar, 2004. - S. 164-170.
2. Metzler D. Biokemija. T. 2. - M., 1980. - 605 str.
3. Sukhoverkhova G.Yu. Biokemijske karakteristike hrskavičnog tkiva hidrobionta i tehnologija dodataka prehrani prehrani: Dis. ... cand. tech. znanosti. - Vladivostok, 2006. - 157 str.
4. Sytova M.V. Znanstveno utemeljenje složene obrade amurske jesetre: Sažetak diplomskog rada. dis. ... cand. tech. znanosti
M.: VNIRO, 2005. - 24 str.
Zavod za prehrambenu biotehnologiju
Primljeno 07.02.07
IDENTIFIKACIJA PROTEINSKIH KOMPONENTI KERATIN ENZIMSKOG HIDROLIZATA
Ch.Yu. ŠAMKHANOV, L.V. ANTIPOVA
Državni institut za naftu Grozni Voronješka državna tehnološka akademija
Jedan od najučinkovitijih načina prerade sekundarnih resursa industrije prerade mesa i peradi je korištenje suvremenih biotehnoloških metoda za dobivanje hidrolizata hrane. Funkcionalna i tehnološka svojstva dobivenih proizvoda ovise o biokemijskom sastavu i molekularnoj masi njegovih proteinskih komponenti.
Pri korištenju fizikalno-kemijskih metoda za određivanje molekularne težine proteina, rezultat ne ovisi samo o masi, već i o električnom naboju i obliku proteinske molekule, osobito pri promjeni brzine difuzije proteina, brzine sedimentacije u gravitacijskoj molekuli. polje. S tim u vezi, pri određivanju molekularne mase proteina, poželjno je koristiti statističke metode kada je otopina proteina u stanju ravnoteže, na primjer, kada se prolazi kroz kolonu ispunjenu gelom.
Svrha rada je odrediti molekularnu masu M proteinskih komponenti keratinskog enzimatskog hidrolizata i njegov biokemijski sastav.
Metoda gel filtracije korištena je za određivanje molekularne mase proteinskih komponenti keratin hidrolizata. Sephadex v-100 (srednji, promjer čestica 40-120 µm) korišten je s granicama frakcioniranja od 4000-150000 Da.
Kolona 46,0 x 1,9 cm napunjena je Sephadexom tretiranim s 0,02 M univerzalnim puferom, pH 7,0. Na njega je naneseno 1,5 cm3 otopine -7 mg/cm3 - keratin hidrolizata i eluirano istim univerzalnim puferom brzinom od 12 cm3/h. Sakupljene su frakcije od 3 cm3 i zatim je u njima spektrofotometrijski određen sadržaj proteina na SF-46 na 280 nm. Da bi se odredila molekularna težina frakcija keratin hidrolizata, kolona sa Sephadexom je prethodno kalibrirana pod istim uvjetima korištenjem nekoliko čistih (marker) proteina s poznatim M. Kalibracijska krivulja je izgrađena korištenjem linearnog odnosa između ^ M i volumena
eluate Ye, pušten iz kolone. U tablici. Slika 1 prikazuje neke od fizikalno-kemijskih karakteristika proteina markera.
stol 1
Protein markera M, Da 1§ m V, cm3
Lizozim 13930 4,143 54
Tripsin 25700 4,409 48
Peroksidaza 34000 4,531 45
Goveđi albumin 68000 4,832 36
Plavi dekstran 2000000 6.301 21
Frakcija topljiva u vodi
keropeptid<10000 2,845 72
Vodotopiva frakcija keratin hidrolizata napušta kolonu u puno manjem volumenu od markerskog proteina lizozima s najnižom molekularnom težinom. Stoga u keratin hidrolizatu (keropeptidu) nema proteinskih frakcija s M > 13930 Da. Približna masa produkata hidrolize je ispod 10 000 Da, određena gel filtracijom na Sephadex B-100 markerskim proteinima. Linearni odnos između ^M proteina i volumena eluata Ye oslobođenog iz kolone prikazan je na slici 1. 1 (1 - plavi dekstran; 2 - goveđi albumin; 3 - peroksidaza; 4 - tripsin; 5 - lizozim; 6 - frakcija keropeptida topiva u vodi).
Zbog odsustva proteina markera u proučavanom rasponu od 10000-5000 Da, potraga za frakcijom proteina topivom u vodi provedena je korištenjem poroznih
tablica 2
M, Da Topljivi proteini i peptidi, mg/cm3 Ukupni peptidi i aminokiseline, µg/cm3 Tirozin, µmol/cm3 Reducirajuće tvari, µg/cm3
0-10000 5,64 7337 7,835 2815
0-5000 4,21 5278 5,960 2272
% od početne vrijednosti 74,6 71,9 76,1 80,7
membrane razreda UPM-100 i UAM-50 na laboratorijskoj ultrafiltracijskoj jedinici (CJSC NPO Tekhkon). Shema je uključivala samu instalaciju s 5% otopinom keropeptida postavljenom na magnetsku mješalicu za njeno stalno miješanje. Za učinkovito odvajanje proteinske otopine, komprimirani zrak je dovođen u gornji dio aparata pod tlakom.Produkti hidrolize prolazili su kroz porozne membrane, naizmjenično se zamjenjivali ovisno o željenoj molekularnoj masi ultrafiltrata, do donjeg dijela aparata i prikupljeni u prihvatnoj posudi. U nastalim ultrafiltratima određen je niz biokemijskih parametara koji su omogućili procjenu raspodjele produkata hidrolize prema molekularnoj masi (tablica 2).
Keropeptid sadrži proteine male molekularne mase s M 5000-10000 Da. Njihov maseni udio procjenjuje se kao razlika u očitanjima za frakcije 0-10000 i 0-5000 Da i iznosi 1,43 mg/cm3. Ova frakcija također je dala pozitivnu reakciju na reakciju ninhidrina (2059 µg/cm3), tirozin (1,875 µmol/cm3) i redukcijske tvari (543 µg/cm3). Međutim, glavni udio produkata hidrolize koncentriran je u frakciji niže molekularne mase s M< 5000 Да, соответствующей по существующей классификации фракции пептидов. Массовая доля всех исследуемых показателей составляет более 7 0% от аналогичных значений во фракции 0-10000 Да.
Daljnje određivanje molekularne mase u vodi topljivih proteinskih frakcija keropeptida provedeno je na Sephadexu B-25 (prosječni, promjer čestica 50-150 μm), što omogućuje njegovo postavljanje u raspon frakcioniranja od 1000-5000 da. Uvjeti gel filtracije ostali su nepromijenjeni. Po
Rezultati određivanja proteina u frakcijama korišteni su za konstruiranje profila eluiranja. U svim frakcijama, osim bjelančevina, ninhidrinskom metodom određen je sadržaj niskomolekularnih tvari, tirozina i redukcijskih tvari (RS), a određena je i kvantitativna raspodjela proteinskih frakcija. Na sl. Slika 2 prikazuje gel kromatogram enzimskog hidrolizata keratina kroz Sephadex B-25 (krivulja 1 - protein; 2 - ninhidrinski test; 3 - tirozin; 4 - PB).
U ovom slučaju, protein se detektira u obliku dva mala vrha gotovo u prvim frakcijama. Maseni udio proteina u frakcijama br. 1-8 od 3-24 cm3
ima prilično visoke vrijednosti i iznosi 0,12-0,18 mg/cm3 (krivulja 1).
Najveći dio produkta izašao je iz kolone kao maksimalni proteinski vrh s volumenom 27 cm3 eluata (frakcija br. 9, po 3 cm3 eluata). Maseni udio proteina u ovoj frakciji registriran je na razini od 0,66 mg/cm3, što je 3-4 puta više nego u ostalim istraživanim frakcijama.
Daljnjim eluiranjem keropeptida u rasponu volumena od 36-96 cm3 otkrivena su tri vrha sa smanjenjem masenog udjela proteina u njima za ne više od 0,08 mg/cm3. Kompletna otopina keropeptida je eluirana u konačnom volumenu od 96 cm3.
U frakciji broj 9 pronađena je cjelokupna količina raspoloživog RS, masenog udjela od 66 μg/cm3 (krivulja 4). Reakcija ninhidrina korištena je u gel kromatografiji za identifikaciju distribucije produkata hidrolize prema molekularnoj težini. Utvrđeno je da kada suvišna količina ninhidrina i proteinskih proizvoda stupi u interakciju sa slobodnom MH2 skupinom, a ovisno o broju tih skupina, moguće je locirati protein
RV, μg/cm3 175 co D 5 o l s; .7 0
100 125 X - 3 co o o. 0.5
80 § 100 2 _ n 0,4
60 1 isin, 7 sl 0,3
40 1 l 5 o - (P 2 o I- 0,2
20 25 _ 2 ai O 0.1
6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 90 96 V, cm
derivate eluiranjem kroz Sephadex. Dakle, niski maseni udio ninhidrina (4-6 µg/cm3) vrlo precizno odražava količinu slobodnih amino skupina i određuje prisutnost peptida visoke molekularne težine s M 3000-5000 Da u frakcijama J# 1-8 (krivulja 2) . Poznato je da u rasponu mjerenja molekularne mase produkata hidrolize< 5000 Да входят только пептиды и аминокислоты. При больших концентрациях белка (фракция № 9) соответственно увеличивается окрашивание его свободных аминогрупп нингидрином -64 мкг/см3. Этот диапазон элюции характеризует наличие во фракциях № 8-12 среднемолекулярных пептидов с М 300-3000 Да. Определяемый с помощью маркерных белков по калибровочной кривой lg M керопептида 2,845 также указывает на его ориентировочную массу >700 Da. Daljnja analiza profila eluiranja za uzorak ninhidrina (frakcije br. 12-36) otkrila je vrh koji ne odgovara njegovoj koncentraciji proteina, kao što je uočeno za peptide u prethodnim frakcijama. Maseni udio tvari male molekularne mase u frakciji br. 23 bio je 157 µg/cm3, što je više od 2 puta više od onog za peptide u frakciji br. 9. prisutnost produkata hidrolize u obliku slobodnih aminokiselina u posljednji razlomak. Pripadnost njoj i aminokiselina tirozin (0,06 µmol/cm3) još je jedan dokaz navedenog stava.
Dakle, gel filtracija keratin hidrolizata kroz Sephadex G-100 i G-25 ukazuje na prisutnost male molekularne otopljene tvari u njemu.
moj protein (< 10000 Да), составляющего 25% от его общего количества в гидролизате. Преобладающая часть белковых продуктов - 75% - представлена среднемолекулярными пептидами (300-3000 Да) с ориентировочной М >700 Da. U ovom slučaju proteinski lanci sadrže 5-20 aminokiselinskih ostataka. Važno je naglasiti da frakcija br. 9 istovremeno daje reakcije na biuretnu vezu, ninhidrin, tirozin i RV. Ova karakteristika ukazuje na prisutnost ugljikohidrata u proteinu keratina i njihovu izravnu povezanost s proteinom kao dijelom jednog kompleksa.
KNJIŽEVNOST
1. Antipova L.V., Pashchenko L.P., Shamkhanov Ch.Yu., Kurilova E.S. Dobivanje i karakterizacija hidrolizata keratina u hrani // Skladištenje i prerada poljoprivrednih sirovina. - 2003. - Broj 7.
2. Antipova L.V., Shamkhanov Ch.Yu., Osminin O.S., Pozhalova N.A. Biokemijske karakteristike procesa enzimske hidrolize keratin-sadržajnih sirovina u industriji prerade peradi Izv. sveučilišta. Tehnologija hrane. - 2003. - Broj 5-6.
3. Antipova L.V., Shamkhanov Ch.Yu., Osminin O.S. Ko -
poboljšanje tehnologije proizvodnje keropeptida od perjastih sirovina // Mesna industrija. - 2004. - br. 3. - S. 44-47.
4. Rogov I.A., Antipova L.V., Dunchenko N.I., Zhereb-tsov N.A. Kemija hrane. U 2 knjige. Knjiga. 1. Proteini: struktura, funkcije, uloga u ishrani. - M.: Kolos, 2000. - 384 str.
5. Osterman L.A. Kromatografija proteina i nukleinskih kiselina. - M.: Nauka, 1985. - 536 str.
6. Kochetov G.A. Praktični vodič za enzimologiju. - 2. izd., prerađeno. i dodatni - M.: Više. škola, 1980. - 272 str.
Zavod za prehrambenu tehnologiju Zavod za tehnologiju mesa i mesnih prerađevina
Primljeno 0S.02.0? G.
TEORIJSKA TEMELJNOST MEHANIZMA OČUVANJA DJELOVANJA KOMPONENTI EKSTRAKATA OD PUŠENJA
S.V. ZOLOTOKOPOVA, I.A. PALAGINA
Državno tehničko sveučilište Astrakhan Astrakhanski ogranak Saratovskog državnog društveno-ekonomskog sveučilišta
Važno područje istraživanja posljednjih godina je proučavanje utjecaja različitih prehrambenih aditiva ne samo na okus i aromu, već i na produženje roka trajanja prehrambenih proizvoda. Od davnina se za konzerviranje koristilo začinsko bilje, kuhinjska sol, dimljenje i dr. Analiza pokazuje da ekstrakti dima trenutno osvajaju tržište. Među stanovništvom su posebno popularne namirnice s okusom dima, a tradicionalno pušenje gubi svoje pozicije u odnosu na bezdimno.
Ekološki korisni i obećavajući su ekstrakti dobiveni u blagim uvjetima.
G.I. desetljećima radi na poboljšanju tehnologije ekstrakcije. Kasyanov - zaslužni radnik znanosti i tehnologije Ruske Federacije, zaslužni izumitelj Ruske Federacije, doktor tehničkih znanosti, profesor, voditelj Odjela za tehnologiju mesnih i ribljih proizvoda Kubanskog državnog tehnološkog sveučilišta. Znanstveno-pedagoška škola “Teorija i praksa prerade sirovina biljnog i životinjskog podrijetla ukapljenim i komprimiranim plinovima”, koja djeluje u okviru KubGTU-a i Krasnodarskog istraživačkog instituta za skladištenje i preradu poljoprivrednih proizvoda, bavi se problemima povećanja učinkovitosti. prerade raznih sirovina, što omogućuje poboljšanje kvalitete proizvoda, skraćivanje vremena obrade i istovremeno smanjenje troškova energije.
Proteini se identificiraju korištenjem različitih sustava pretraživanja u bazama podataka EMBL i Sequest razvijenim unutar istraživačkih timova. Međutim, tražilica Mascot postala je standard za identifikaciju proteina. Kao i gotovo sve tražilice, koristi web sučelje i sama tražilica dostupna je na internetu, ali se može kupiti i instalirati na računalo korisnika.
Maskota može raditi s raznim priključnim proteinskim i genomskim bazama podataka. To mogu biti opsežne javne baze podataka, poput NCBI ili SwissProt, komercijalne, kao i one koje kreira sam korisnik.
U svim sustavima identifikacija se provodi prema masenim spektrometrijskim podacima dobivenim od strane istraživača, uspoređujući ih s poznatim proteinskim strukturama.
S obzirom da se posljednjih desetljeća sekvencioniranje proteina u biti svelo na sekvenciranje gena koji ih kodiraju, u praksi je razumnije identificirati proteine uspoređujući eksperimentalne masene spektrometrijske podatke s poznatim genomima.
Postoje različiti algoritmi za identifikaciju proteina, ali su njihove mogućnosti ograničene trenutno poznatim genomima. Iako, s obzirom na to da organizmi različitih vrsta još uvijek imaju homologne proteine, često je moguće identificirati proteine iz organizama s nepoznatim genomom.
Različiti metodološki pristupi proteomskom istraživanju daju bitno različite vrste podataka i zahtijevaju vlastite računske pristupe za obradu.
Najpristupačnija i najučinkovitija metoda je metoda identifikacije masenom spektrometrijom peptidnih mapa specifične proteolitičke hidrolize. U engleskoj literaturi poznat je kao Peptide Mass Fingerprint (PMF).Tripsin se najčešće koristi kao specifična proteaza. U prvoj fazi, izolirani protein (na primjer, elektroforezom) prolazi kroz proteolitičku hidrolizu. Kao rezultat takve hidrolize dobiva se smjesa peptida. S obzirom na to da se koristi visoko specifična proteaza, ovo će biti mješavina dobro definiranih peptida. Dakle, kada se koristi tripsin, protein će "presjeći" arginin i lizin.
Sljedeća faza je registracija masenog spektra dobivene smjese. Rezultat je skup ili popis molekulskih težina. Ne daje nikakve podatke o strukturi ili drugim svojstvima proizvoda, metoda se temelji samo na pretpostavci da su to molekularne mase peptida, a ti peptidi su nastali kao rezultat specifične hidrolize. Ovdje se krije glavna ideja pristupa - ako svaki protein ima svoj skup peptida i odgovarajući popis molekulskih težina, tada je sasvim moguće riješiti inverzni problem - pronaći odgovarajući protein za rezultirajući popis molekulskih težina. I takav problem je doista često moguće riješiti.
Konkretno, to vam omogućuje da napravite maskotu.
