Малки РНК и рак. Големи дела на малките молекули: Как малките РНК провеждат гените на бактериите Малки РНК

В жива клетка потокът от информация между ядрото и цитоплазмата никога не пресъхва, но разбирането на всичките й „обратки“ и дешифрирането на информацията, кодирана в нея, е наистина титанична задача. Един от най-важните пробиви в биологията на миналия век може да се счита за откриването на информационни (или шаблонни) РНК молекули (мРНК или иРНК), които служат като посредници, които пренасят информационни „съобщения“ от ядрото (от хромозомите) до цитоплазма. Решаващата роля на РНК в протеиновия синтез е предсказана още през 1939 г. в работата на Торбьорн Касперсон ( Торбьорн Касперсон), Жан Браше ( Жан Браше) и Джак Шулц ( Джак Шулц), а през 1971 г. от Джордж Марбейс ( Джордж Марбе) задейства синтеза на хемоглобин в жабешки ооцити чрез инжектиране на първата изолирана РНК на заек, кодираща този протеин.

През 1956–1957 г. в Съветския съюз А. Н. Белозерски и А. С. Спирин независимо доказаха съществуването на иРНК и също така установиха, че по-голямата част от РНК в клетката в никакъв случай не е матрична, а рибозомна РНК(рРНК). Рибозомната РНК - вторият "основен" тип клетъчна РНК - образува "скелета" и функционалния център на рибозомите във всички организми; именно рРНК (а не протеините) регулира основните етапи на протеиновия синтез. В същото време беше описан и изследван третият „основен” тип РНК – трансферна РНК (тРНК), която в комбинация с другите два – иРНК и рРНК – образуват единен протеин-синтезиращ комплекс. Според доста популярната хипотеза за „света на РНК“ именно тази нуклеинова киселина лежи в началото на живота на Земята.

Поради факта, че РНК е много по-хидрофилна от ДНК (поради замяната на дезоксирибоза с рибоза), тя е по-лабилна и може да се движи относително свободно в клетката и следователно да доставя краткотрайни реплики. генетична информация(mRNA) до мястото, където започва синтеза на протеин. Въпреки това, заслужава да се отбележи „неудобството“, свързано с това - РНК е много нестабилна. Съхранява се много по-лошо от ДНК (дори вътре в клетката) и се разгражда при най-малката промяна в условията (температура, pH). В допълнение към "собствената" нестабилност, голям принос имат рибонуклеазите (или РНКазите) - клас ензими, разцепващи РНК, много стабилни и "вездесъщи" - дори кожата на ръцете на експериментатора съдържа достатъчно количество от тези ензими за преминаване извади целия експеримент. Поради това работата с РНК е много по-трудна, отколкото с протеини или ДНК – последните обикновено могат да се съхраняват стотици хиляди години с малко или никакво увреждане.

Фантастична точност по време на работа, тридистилат, стерилни ръкавици, лабораторни съдове за еднократна употреба - всичко това е необходимо, за да се предотврати разграждането на РНК, но спазването на такива стандарти не винаги е било възможно. Следователно дълго време късите „фрагменти“ от РНК, които неизбежно замърсяват разтворите, просто бяха игнорирани. С течение на времето обаче стана ясно, че въпреки всички усилия за поддържане на стерилността на работната зона, „отломките“ естествено продължават да се откриват и след това се оказва, че хиляди къси двуверижни РНК винаги присъстват в цитоплазмата , изпълняващи доста специфични функции и абсолютно необходими за нормалното развитие на клетките и организмите.

Принцип на РНК интерференция

Фармацевтите също се интересуват от възможността за използване на siRNA, тъй като способността да се регулира работата на отделните гени обещава нечувани перспективи при лечението на множество заболявания. Малкият размер и високата специфичност на действие обещават висока ефикасност и ниска токсичност на лекарствата, базирани на siRNA; все пак реши проблема доставка siRNA към болните клетки в тялото все още не е успяла - причината за това е крехкостта и крехкостта на тези молекули. И въпреки че сега десетки екипи се опитват да намерят начин да насочат тези „магически куршуми“ точно към целта (вътре в болните органи), те все още не са постигнали видим успех. Освен това има и други трудности. Например, в случай на антивирусна терапия, високата селективност на действието на siRNA може да бъде лоша услуга - тъй като вирусите бързо мутират, модифицираният щам много бързо ще загуби чувствителност към siRNA, избрана в началото на терапията: известно е, че заместването само на един нуклеотид в siRNA води до значително намаляване на интерференционния ефект.

В този момент си струва да си припомним още веднъж - бяха открити siRNA само при растения, безгръбначни и едноклетъчни; Въпреки че хомолози на протеини за РНК интерференция (Dicer, RISC комплекс) също присъстват във висши животни, siRNAs не са открити чрез конвенционални методи. Каква изненада беше, когато изкуствено въведениСинтетичните аналози на siRNA произвеждат силен специфичен дозозависим ефект в клетъчни култури от бозайници! Това означаваше, че в клетките на гръбначните животни, РНК интерференцията не е заменена от по-сложни имунни системи, а еволюира заедно с организмите, превръщайки се в нещо по-„напреднало“. Следователно при бозайниците беше необходимо да се търсят не точни аналози на siRNA, а техните еволюционни наследници.

Играч #2 - miRNA

Всъщност, въз основа на еволюционно доста древния механизъм на РНК интерференция, по-развитите организми са разработили две специализирани системи за контрол на работата на гените, като всяка използва своя собствена група от малки РНК - miRNA(микроРНК) и piRNA(piRNA, Piwi-взаимодействаща РНК). И двете системи се появяват в гъби и кишечнополостни животни и се развиват заедно с тях, измествайки siRNA и механизма на "гола" РНК интерференция. Тяхната роля в осигуряването на имунитет намалява, тъй като тази функция е поета от по-напреднали механизми на клетъчния имунитет, по-специално интерфероновата система. Тази система обаче е толкова чувствителна, че работи и върху самата siRNA: появата на малки двуверижни РНК в клетка на бозайник предизвиква „алармен сигнал“ (активира секрецията на интерферон и предизвиква експресията на интерферон-зависими гени, които блокира изцяло всички процеси на превод). В тази връзка механизмът на РНК интерференция при висши животни се медиира главно от микроРНК и piRNA, едноверижни молекули със специфична структура, които не се откриват от интерфероновата система.

Тъй като геномът става по-сложен, miRNAs и piRNAs стават все по-замесени в регулирането на транскрипцията и транслацията. С течение на времето те се превърнаха в допълнителна, прецизна и фина система за регулиране на генома. За разлика от siRNAs, miRNAs и piRNAs (открити през 2001 г., виж каре 3) не се произвеждат от чужди двуверижни РНК молекули, а първоначално са кодирани в генома на гостоприемника.

Запознайте се с микроРНК

МикроРНК прекурсорът се транскрибира от двете вериги на геномна ДНК чрез РНК полимераза II, което води до междинна форма, pri-miRNA, която носи характеристиките на конвенционалната тРНК - m 7 G-cap и polyA опашка. Този прекурсор образува бримка с две едноверижни „опашки“ и няколко несдвоени нуклеотида в центъра (фиг. 3). Такъв цикъл се подлага на двуетапна обработка (фиг. 4): първо, ендонуклеазата на Drosha отрязва едноверижни РНК „опашки“ от фиби, след което отрязаната фиби (пред-микроРНК) се изнася в цитоплазмата, където разпознава се от Dicer, който прави още два разреза (изрязва се двуверижен участък). , обозначен с цвят на фиг. 3). В тази форма зрялата miRNA, подобно на siRNA, е включена в RISC комплекса.

Фигура 3. Структура на двуверижна молекула прекурсор на miRNA.Основни характеристики: наличието на запазени последователности, които образуват фиби; наличието на комплементарно копие (микроРНК*) с два „допълнителни“ нуклеотида в 3′ края; специфична последователност (2-8 bp), която образува мястото за разпознаване на ендонуклеази. Самата miRNA е подчертана в червено - това е, което Dicer изрязва.

Механизмът на действие на много микроРНК е подобен на този на siRNAs: къса (21-25 нуклеотида) едноверижна РНК в протеиновия комплекс RISC се свързва с висока специфичност към комплементарно място в 3'-нетранслираната област на целевата иРНК . Свързването води до разцепване на иРНК от Ago протеина. Въпреки това, активността на микроРНК (в сравнение с siRNAs) вече е по-диференцирана – ако комплементарността не е абсолютна, целевата иРНК може да не се разгради, а само обратимо блокирана (няма да има транслация). Може да се използва и същият RISC комплекс изкуствено въведени siRNA. Това обяснява защо siRNAs, направени по аналогия с протозоите, също са активни при бозайници.

Така можем да завършим илюстрацията на механизма на действие на РНК интерференцията при висши (двустранно симетрични) организми, като комбинираме в една фигура схемата на действие на микроРНК и биотехнологично въведените siРНК (фиг. 5).

Фигура 5. Обобщена схема на действието на изкуствени miRNAs и siRNAs(изкуствените siRNA се въвеждат в клетката с помощта на специализирани плазмиди - насочване към siRNA вектор).

Функции на miRNA

Физиологичните функции на miRNAs са изключително разнообразни; всъщност те действат като основни непротеинови регулатори на онтогенезата. miRNAs не отменят, а допълват "класическата" схема на генната регулация (индуктори, супресори, уплътняване на хроматина и т.н.). Освен това самият синтез на микроРНК се регулира по сложен начин (определени групи от микроРНК могат да бъдат включени от интерферони, интерлевкини, тумор некрозис фактор α (TNF-α) и много други цитокини). В резултат на това се появява многостепенна мрежа за създаване на „оркестър“ от хиляди гени, удивителна по своята сложност и гъвкавост, но това не е краят на въпроса.

miRNAs са по-„универсални“ от siRNAs: гените на „отдел“ не трябва да бъдат 100% допълващи се – регулирането също се осъществява с частично взаимодействие. Днес една от най-горещите теми в молекулярната биология е търсенето на микроРНК, които действат като алтернативни регулатори на известни физиологични процеси. Например, вече са описани miRNAs, участващи в регулирането на клетъчния цикъл и апоптозата в растенията, дрозофилите и нематодите; при хората, miRNAs регулират имунната система и развитието на хемопоетичните стволови клетки. Използването на технологии, базирани на биочипове (микро-масив скрининг) показа, че цели групи от малки РНК се включват и изключват на различни етапи от живота на клетката. За биологичните процеси са идентифицирани десетки специфични микроРНК, чието ниво на експресия при определени условия се променя хиляди пъти, подчертавайки изключителната контролируемост на тези процеси.

Доскоро се смяташе, че микроРНК само потискат - изцяло или частично - работата на гените. Наскоро обаче се оказа, че действието на miRNAs може коренно да се различава в зависимост от състоянието на клетката! В активно деляща се клетка, miRNA се свързва с комплементарна последователност в 3'-местото на иРНК и инхибира протеиновия синтез (транслация). Въпреки това, в състояние на покой или стрес (например при отглеждане на лоша среда) едно и също събитие води до обратния ефект – увеличаване на синтеза на целевия протеин!

Еволюция на miRNA

Броят на разновидностите на микроРНК във висшите организми все още не е напълно установен - според някои данни той надвишава 1% от броя на гените, кодиращи протеини (при хората, например, те говорят за 700 микроРНК и този брой постоянно се увеличава нарастващ). микроРНК регулират активността на около 30% от всички гени (цели за много от тях все още не са известни) и има както повсеместни, така и тъканно-специфични молекули - например един такъв важен пул от микроРНК регулира узряването на кръвните стволови клетки .

Широкият профил на експресия в различни тъкани на различни организми и биологичното изобилие от miRNAs показват еволюционно древен произход. За първи път миРНК са открити в нематоди и дълго време се смяташе, че тези молекули се появяват само в гъби и кишечнополостни; по-късно обаче те са открити и в едноклетъчни водорасли. Интересно е, че тъй като организмите стават по-сложни, броят и хетерогенността на микроРНК пула също се увеличават. Това косвено показва, че сложността на тези организми се осигурява по-специално от функционирането на miRNAs. Възможната еволюция на miRNA е показана на Фигура 6.

Фигура 6. Разнообразие от miRNAs в различни организми.Колкото по-висока е организацията на организма, толкова повече miRNA се намират в него (числото в скоби). Видовете са маркирани в червено, в което единичен miRNA.

Може да се направи ясна еволюционна връзка между siRNA и microRNA въз основа на следните факти:

• действието на двата вида е взаимозаменяемо и медиирано от хомоложни протеини;
• siRNAs, въведени в клетките на бозайници, специфично „изключват“ необходимите гени (въпреки известно активиране на интерфероновата защита);
• miRNAs се намират във все по-древни организми.

Тези и други данни предполагат произхода на двете системи от общ "прародител". Интересно е също да се отбележи, че „РНК“ имунитетът като независим предшественик на протеинови антитела потвърждава теорията за произхода на първите форми на живот, базирани на РНК, а не на протеини (припомнете си, че това е любимата теория на акад. А. С. Спирин).

Колкото по-далеч, толкова по-объркващо. Играч #3 - piRNA

Докато имаше само двама „играчи“ на арената на молекулярната биология – siRNA и microRNA – основната „цел“ на интерференцията на РНК изглеждаше напълно ясна. Всъщност: набор от хомоложни къси РНК и протеини в различни организми извършва сходни действия; тъй като организмите стават по-сложни, нараства и тяхната функционалност.

Въпреки това, в процеса на еволюция природата създава друга, еволюционно най-нова и високоспециализирана система, базирана на същия успешен принцип на РНК интерференция. Говорим за piRNA (piRNA, от РНК за взаимодействие с Piwi).

Колкото по-сложен е организиран геномът, толкова по-развит и адаптиран е организмът (или обратно? ;-). Въпреки това, увеличаването на сложността на генома има обратна страна: сложна генетична система става нестабилен. Това води до необходимостта от механизми, отговорни за поддържането на целостта на генома – в противен случай спонтанното „смесване“ на ДНК просто ще го деактивира. Мобилни генетични елементи ( SHP) - един от основните фактори за нестабилност на генома - са къси нестабилни региони, които могат да се транскрибират автономно и да мигрират през генома. Активирането на такива транспозируеми елементи води до множество счупвания на ДНК в хромозомите, които са изпълнени със смъртоносни последици.

Броят на MGE нараства нелинейно с размера на генома и тяхната активност трябва да бъде контролирана. За да направят това, животните, които вече започват с кишечнополостни, използват същия феномен на РНК интерференция. Тази функция се изпълнява и от къси РНК, но не от тези, които вече са били обсъдени, а от третия им тип, piRNAs.

"Портрет" на piRNA

piRNA функции

Основната функция на piRNA е потискането на активността на MGE на ниво транскрипция и транслация. Смята се, че piRNAs са активни само по време на ембриогенезата, когато непредвидимото разместване на генома е особено опасно и може да доведе до смъртта на ембриона. Това е логично – когато имунната система все още не е работила, клетките на ембриона се нуждаят от някаква проста, но ефективна защита. От външни патогени ембрионът е надеждно защитен от плацентата (или яйчната черупка). Но освен това е необходима защита и от ендогенни (вътрешни) вируси, предимно MGE.

Тази роля на piRNA е потвърдена от опит - "нокаут" или мутации на гените Ago3, Piwi или Aub водят до сериозни нарушения в развитието (и рязко увеличаване на броя на мутациите в генома на такъв организъм), а също така причиняват безплодие поради нарушено развитие на зародишните клетки.

Разпределение и еволюция на piRNA

Първите piRNAs вече са открити в морски анемони и гъби. Растенията очевидно са тръгнали по друг път - в тях не са открити протеини на Piwi, а ролята на "муцуна" за транспозони се изпълнява от ендонуклеазата Ago4 и siRNA.

При висшите животни, включително хората, системата piRNA е много добре развита, но тя може да бъде открита само в ембрионалните клетки и в амниотичния ендотел. Защо разпределението на piRNA в тялото е толкова ограничено, остава да се види. Може да се предположи, че като всяко мощно оръжие, piRNA е полезна само при много специфични условия (по време на феталното развитие), а при възрастен организъм тяхната дейност ще причини повече вреда, отколкото полза. Все пак броят на piRNAs е с порядък по-голям от броя на известните протеини и неспецифичните ефекти на piRNA в зрелите клетки са трудни за прогнозиране.

Заключение

В заключение бих искал да дам таблица, илюстрираща еволюцията на протеиновия апарат, участващ в РНК интерференцията (фиг. 9). Вижда се, че протозоите имат най-развитата система siRNA (протеинови семейства Ago, Dicer), а с усложняването на организмите акцентът се измества към по-специализирани системи - броят на протеиновите изоформи за микроРНК (Drosha, Pasha) и piRNA ( Piwi, Hen1) се увеличава. В същото време разнообразието от ензими, медииращи действието на siRNA, намалява.

Фигура 9. Разнообразие от протеини, участващи в РНК интерференцията(числата показват броя на протеините във всяка група). в синьоелементи, характерни за siRNA и microRNA са подчертани, и червен- протеин исвързани с piRNA.

Феноменът РНК интерференция започва да се използва от най-простите организми. Въз основа на този механизъм природата създаде прототип на имунната система и тъй като организмите стават по-сложни, РНК интерференцията се превръща в незаменим регулатор на активността на генома. Два различни механизма плюс три вида къси РНК ( см.раздел. 1) - в резултат виждаме хиляди фини регулатори на различни метаболитни и генетични пътища. Тази поразителна картина илюстрира гъвкавостта и еволюционната адаптация на молекулярната биологични системи. Кратките РНК отново доказват, че вътре в клетката няма „малки неща“ – има само малки молекули, пълното значение на чиято роля едва започваме да разбираме.

(Вярно, такава фантастична сложност предполага по-скоро, че еволюцията е „сляпа” и действа без предварително установено „ основен план» »;

Учените смятат, че неправилната експресия на малки РНК е една от причините за редица заболявания, които сериозно засягат здравето на много хора по света. Сред такива заболявания са сърдечно-съдовите 23 и онкологичните 24 . Що се отнася до последното, това не е изненадващо: ракът показва аномалии в развитието на клетките и в тяхната съдба, а малките РНК играят решаваща роля в съответните процеси. Ето един от най-значимите примери за огромното въздействие, което малките РНК имат върху тялото при рак. Става дума за злокачествен тумор, който се характеризира с неправилна експресия на онези гени, които действат по време на първоначалното развитие на организма, а не в постнаталния период. Това е вид мозъчен тумор в детска възраст, който обикновено се появява преди навършване на две години. Уви, това е много агресивна форма на рак и прогнозата тук е неблагоприятна дори при интензивно лечение. Онкологичният процес се развива в резултат на неправилно преразпределение на генетичния материал в мозъчните клетки. Промотор, който обикновено причинява силна експресия на един от протеин-кодиращите гени, претърпява рекомбинация с определен клъстер от малки РНК. Тогава целият този пренареден регион се усилва: с други думи, много негови копия се създават в генома. Следователно малките РНК, разположени "надолу по веригата" от преместения промотор, се експресират много повече, отколкото трябва. Нивото на съдържание на активни малки РНК е приблизително 150-1000 пъти по-високо от нормата.

Ориз. 18.3.Малките РНК, активирани с алкохол, могат да се свържат с информационните РНК, които не влияят на резистентността на организма към алкохол. Но тези малки РНК не се свързват с молекулите на информационната РНК, които насърчават такава резистентност. Това води до относително преобладаване на дела на молекулите на информационната РНК, кодиращи протеинови вариации, свързани с резистентност към алкохол.

Този клъстер кодира над 40 различни малки РНК. Всъщност това като цяло е най-големият от тези клъстери, които имат приматите. Обикновено се изразява само в ранен етап от човешкото развитие, през първите 8 седмици от ембрионалния живот. Силното му активиране в мозъка на бебето води до катастрофален ефект върху генетичната експресия. Едно следствие е експресията на епигенетичен протеин, който добавя модификации към ДНК. Това води до широкообхватни промени в целия модел на метилиране на ДНК, а оттам и до анормална експресия на всякакви гени, много от които трябва да се експресират само когато незрелите мозъчни клетки се делят по време на ранните етапи на развитие на организма. Така се стартира програмата за рак в клетките на бебето 25 .

Подобна комуникация между малки РНК и епигенетичния хардуер на клетката може да има значително влияние върху други ситуации, когато клетките развиват предразположение към рак. Този механизъм вероятно води до факта, че ефектът от нарушаването на експресията на малка РНК се засилва чрез промяна на епигенетичните модификации, които се предават на дъщерните клетки от майката. По този начин може да се формира схема на потенциално опасни промени в характера на генната експресия.

Досега учените не са разбрали всички етапи на взаимодействието на малки РНК с епигенетични процеси, но все пак успяват да получат някои намеци за особеностите на случващото се. Например, се оказа, че определен клас малки РНК, които повишават агресивността на рака на гърдата, са насочени към определени ензими в информационните РНК, които премахват ключови епигенетични модификации. Това променя модела на епигенетичните модификации в раковата клетка и допълнително нарушава генетичната експресия 26 .

Много форми на рак са трудни за проследяване при пациент. На труднодостъпни места могат да протичат онкологични процеси, което усложнява процедурата по вземане на проби. В такива случаи не е лесно за лекаря да проследи развитието на раковия процес и реакцията на лечението. Често лекарите са принудени да разчитат на индиректни измервания - да речем, на томографско сканиране на тумор. Някои изследователи смятат, че малките РНК молекули могат да помогнат за създаването на нова техника за наблюдение на развитието на тумора, което също така дава възможност да се изследва неговият произход. Когато раковите клетки умрат, малките РНК напускат клетката, когато тя се разкъса. Тези малки ненужни молекули често образуват комплекси с клетъчни протеини или се увиват във фрагменти от клетъчни мембрани. Поради това те са много стабилни в телесните течности, което означава, че такива РНК могат да бъдат изолирани и анализирани. Тъй като техният брой е малък, изследователите ще трябва да използват много чувствителни методи за анализ. Тук обаче няма нищо невъзможно: чувствителността на секвенирането нуклеинова киселинапостоянно нараства 27 . Публикувани са данни, потвърждаващи обещанието на този подход по отношение на рак на гърдата 28 , рак на яйчниците 29 и редица други онкологични заболявания. Анализът на циркулиращите малки РНК при пациенти с рак на белия дроб показа, че тези РНК помагат за разграничаването на пациенти с единичен белодробен възел (които не се нуждаят от терапия) и пациенти, които развиват злокачествени туморни възли (изискващи лечение) 30 .

), предотвратявайки транслацията на иРНК върху рибозомите в протеина, който кодира. В крайна сметка резултатът от действието на малки интерфериращи РНК е идентичен с този, сякаш експресията просто е намалена. ген.

Малки интерфериращи РНК са открити в 1999 ггрупата на Дейвид Болкомб Английски David Baulcombe) в Обединеното кралство като компонент на пост-транскрипционната система генно заглушаванев растенията ( Английски PTGS, en: пост-транскрипционно генно заглушаване ). Групата публикува констатациите в списанието наука.

Двуверижните РНК могат да увеличат генната експресия чрез механизъм, наречен РНК-зависима генна активация ( Английски RNAa, малка РНК-индуцирана генна активация). Доказано е, че двойноверижните РНК, комплементарни на промоторите на целеви гени, предизвикват активиране на съответните гени. РНК-зависимо активиране при прилагане на синтетични двойноверижни РНК е показано в човешки клетки. Не е известно дали подобна система съществува в клетките на други организми.

Със способността да се изключва по същество всеки ген по желание, РНК интерференцията, базирана на малки интерфериращи РНК, генерира огромен интерес в основната и приложна биология. Броят на широкообхватни RNAi-базирани анализи за идентифициране на важни гени в биохимичните пътища непрекъснато нараства. Тъй като развитието на заболявания се определя и от активността на гените, се очаква, че в някои случаи изключването на ген с малка интерферираща РНК може да има терапевтичен ефект.

Въпреки това, прилагането на РНК интерференция, основаваща се на малки интерфериращи РНК, към животните, и по-специално към хората, е изправена пред много трудности. Експериментите показват, че ефективността на малките интерфериращи РНК е различна за различните типове клетки: някои клетки лесно реагират на ефектите на малки интерфериращи РНК и показват намаляване на генната експресия, докато при други това не се наблюдава, въпреки ефективното трансфекция. Причините за това явление все още са слабо разбрани.

Резултатите от първата фаза на изпитвания на първите две терапевтични лекарства, действащи по механизма на РНК интерференция (предназначени за лечение макулна дегенерация), публикувани в края на 2005 г., показват, че малките интерфериращи РНК лекарства се понасят добре от пациентите и имат приемливи фармакокинетични свойства.

Предварителни клинични изпитвания на насочване на малки интерфериращи РНК вирус ебола, показват, че те могат да бъдат ефективни за постекспозиционна профилактика на заболяването. Това лекарство позволи оцеляването на цялата група експериментални примати, които са получили смъртоносна доза заирски еболавирус.

Дължината на siRNA е 21-25 bp; те се образуват от dsRNA. Източникът на такива РНК могат да бъдат вирусни инфекции, генетични конструкции, въведени в генома, дълги фиби в транскриптите и двупосочна транскрипция на транспозируеми елементи.
dsRNAs се нарязват от RNase Dicer на 21-25 bp фрагменти. с 3" краища, изпъкнали от 2 нуклеотида, след което една от веригите е част от RISC и насочва разрязването на хомоложни РНК. RISC съдържа siRNA, съответстващи както на плюс-, така и на минус-вериги на dsRNA. siRNAs нямат свои собствени гени и представляват фрагменти от по-дълги РНК. siRNAs насочват изрязването на целевата РНК, тъй като са напълно комплементарни към нея. При растенията, гъбите и нематодите РНК-зависимите РНК полимерази участват в потискането на генната експресия, за което също и siRNAs служат като праймери (семена за синтеза на нова РНК Получената dsRNA се нарязва с Dicer, образуват се нови siRNAs, които са вторични, като по този начин се усилва сигнала.

РНК интерференция

През 1998 г. Крейг С. Мело и Андрю Файър публикуват в Nature, в които се посочва, че двуверижните РНК (dsRNAs) са в състояние да потиснат генната експресия. По-късно се оказа, че активният принцип в този процес е късата едноверижна РНК. Механизмът на потискане на генната експресия от тези РНК се нарича
РНК интерференция и заглушаване на РНК. Такъв механизъм е открит във всички големи таксони на еукариоти: гръбначни и безгръбначни, растения и гъби. През 2006 г. беше присъдена Нобелова награда за това откритие.
Потискането на експресията може да се случи на ниво транскрипция или след транскрипция. Оказа се, че във всички случаи е необходим подобен набор от протеини и къси (21-32 bp) РНК.
siRNAs регулират генната активност по два начина. Както беше обсъдено по-горе, те насочват разрязването на целеви РНК. Това явление се нарича "потискане" ( потискане) в гъби, " пост-транслационно генно заглушаване"в растенията и" РНК интерференция " при животни. siRNAs с дължина 21-23 bp са включени в тези процеси. Друг вид ефект - siRNAs са в състояние да потискат транскрипцията на гени, съдържащи хомоложни siRNA последователности. Това явление се нарича заглушаване на транскрипционния ген (TGS) и се намира в дрожди, растения и животни. siRNAs също насочват ДНК метилиране, което води до образуването на хетерохроматин и транскрипционна репресия. TGS е най-добре проучен в дрождите S. pombe, където е установено, че siRNAs се вмъкват в RISC-подобен протеинов комплекс, наречен RITS. В неговия случай, както и в случая на RISC, siRNA взаимодейства с протеин от семейството AGO. Вероятно siRNA е в състояние да насочи този комплекс към ген, който съдържа хомоложен siRNA фрагмент. След това RITS протеините набират метилтрансферази, в резултат на което се образува хетерохроматин в локуса, кодиращ целевия ген на siRNA, и активната генна експресия спира.

Роля в клетъчните процеси

Какво е значението на siRNA в клетката?
siRNAs участват в клетъчната защита срещу вируси, трансгенна репресия, регулиране на някои гени и образуване на центромерен хетерохроматин. Важна функция на siRNA е потискането на експресията на мобилни генетични елементи. Такова потискане може да се случи както на ниво транскрипция, така и след транскрипция.
Геномът на някои от вирусите се състои от ДНК, при някои от тях - от РНК, освен това РНК във вирусите може да бъде както едноверижна, така и двуверижна. Процесът на рязане на чуждата (вирусна) иРНК в този случай протича по същия начин, както е описано по-горе, тоест чрез активиране на RISC ензимния комплекс. Въпреки това, за да бъдат по-ефективни, растенията и насекомите са измислили уникален начин за засилване на защитния ефект на siRNA. Като се присъедини към веригата на иРНК, регионът на siRNA може с помощта на ензимния комплекс DICER първо да завърши втората верига на иРНК и след това да я разреже на различни места, създавайки по този начин разнообразие от "вторични" siRNA. Те от своя страна образуват RISC и пренасят иРНК през всички етапи, обсъдени по-горе, до пълното й унищожаване. Такива "вторични" молекули ще могат специфично да се свързват не само с мястото на вирусната иРНК, към което е насочена "първичната" молекула, но също така и към други места, което драстично повишава ефективността на клетъчната защита.

Така в растенията и по-нисшите животински организми siRNAs са важна връзка в един вид „вътреклетъчен имунитет“, който им позволява да разпознават и бързо унищожават чуждата РНК. В случай, че в клетката влезе вирус, съдържащ РНК, такава защитна система ще предотврати размножаването му. Ако вирусът съдържа ДНК, системата siRNA ще попречи на производството му на вирусни протеини (тъй като необходимата за това иРНК ще бъде разпозната и отрязана) и използването на тази стратегия ще забави разпространението му в тялото.

При бозайниците, за разлика от насекомите и растенията, действа и друга защитна система. Когато чужда РНК, чиято дължина е повече от 30 bp, навлезе в "зряла" (диференцирана) клетка на бозайник, клетката започва да синтезира интерферон. Интерферонът, свързващ се със специфични рецептори на клетъчната повърхност, е в състояние да стимулира цяла група гени в клетката. В резултат на това в клетката се синтезират няколко вида ензими, които инхибират синтеза на протеини и разцепват вирусната РНК. В допълнение, интерферонът може да действа върху съседни, все още неинфектирани клетки, като по този начин блокира възможното разпространение на вируса.

Както можете да видите, и двете системи са сходни в много отношения: имат обща цели "методи" на работа. Дори самите имена "интерферон" и "(РНК) интерференция" идват от общ корен. Но те имат и една много съществена разлика: ако интерферонът, при първите признаци на инвазия, просто "замрази" работата на клетката, предотвратявайки (за всеки случай) производството на много, включително "невинни" протеини в клетката, тогава системата siRNA е изключително разбираема: всяка siRNA ще разпознае и унищожи само своята собствена специфична иРНК. Заместването само на един нуклеотид в siRNA води до рязко намаляване на ефекта на интерференцията . Нито един от известните досега генни блокери няма такава изключителна специфичност по отношение на своя целеви ген.

Откриването на РНК интерференцията даде нова надежда в борбата срещу СПИН и рак. Възможно е чрез използване на siRNA терапия заедно с традиционната антивирусна терапия да се постигне потенциращ ефект, когато два ефекта водят до по-изразен терапевтичен ефект от простата сума на всеки от тях, приложен поотделно.
За да се използва механизмът на сиРНК интерференция в клетките на бозайници, готови двуверижни siRNA молекули трябва да бъдат въведени в клетките. Оптималният размер на такива синтетични siRNAs е същите 21-28 нуклеотида. Ако увеличите дължината му, клетките ще реагират с производството на интерферон и намаляване на протеиновия синтез. Синтетичните siRNAs могат да влязат както в заразени, така и в здрави клетки и намаляването на производството на протеин в неинфектирани клетки би било силно нежелателно. От друга страна, ако се опитате да използвате siRNA, по-малка от 21 нуклеотида, специфичността на нейното свързване с желаната иРНК и способността за образуване на RISC комплекс са рязко намалени.

Ако по един или друг начин човек може да достави siRNA, която има способността да се свързва с всяка част от генома на ХИВ (която, както е известно, се състои от РНК), може да се опита да предотврати интегрирането й в ДНК на гостоприемника клетка. Освен това учените разработват начини за въздействие върху различните етапи на репродукцията на ХИВ в вече заразена клетка. Последният подход няма да осигури лечение, но може значително да намали скоростта на репродукция на вируса и да даде на притиснатата в ъгъла имунна система шанс да „почине“ от вирусната атака и да се опита да се справи с остатъците от самата болест. На фигурата тези два етапа на репродукция на ХИВ в клетката, които, както се надяват учените, могат да бъдат блокирани с помощта на siRNA, са маркирани с червени кръстове (етапи 4-5 - вграждане на вируса в хромозомата и етапи 5-6 - сглобяване на вируса и излизане от клетката).


Към днешна дата обаче всичко изброено по-горе се отнася само за областта на теорията. На практика, siRNA терапията среща трудности, които учените все още не са успели да заобиколят. Например, в случай на антивирусна терапия, високата специфичност на siRNA може да изиграе жестока шега: както е известно, вирусите имат способността бързо да мутират, т.е. променят състава на техните нуклеотиди. Особено успешен в това е ХИВ, чиято честота на промените е такава, че при човек, заразен с един подтип на вируса, след няколко години може да се изолира напълно различен подтип. В този случай модифицираният щам на HIV автоматично ще стане нечувствителен към siRNA, избрана в началото на терапията.

Стареене и канцерогенеза

Както всеки епигенетичен фактор, siRNAs влияят върху експресията на гени, които ги правят „мълчаливи“. Сега има произведения, които описват експерименти за изключване на гени, свързани с тумори. Гените се изключват (нокдаун) с помощта на siRNA. Например, китайски учени, използващи siRNA, изключиха гена на транскрипционния фактор 4 (TCF4), чиято активност причинява синдром на Пит-Хопкинс (много рядко генетично заболяване, характеризиращо се с умствена изостаналост и епизоди на хипервентилация и апнея) и други психични заболявания. В тази работа изследвахме ролята на TCF4 в раковите клетки на стомаха. Ектопичната експресия на TCF4 намалява клетъчния растеж в клетъчните линии на рак на стомаха, а нокаутът на siRNA на TCF4 гена увеличава клетъчната миграция. По този начин може да се заключи, че епигенетичното заглушаване на гена TCF4 играе важна роля в образуването и развитието на тумора.

Според изследвания в отдела по онкология, Център за рак на Алберт Айнщайн, ръководен от Леонард Х. Аугенлихт, siRNA участва в изключване на гена HDAC4, което причинява инхибиране на растежа на рак на дебелото черво, апоптоза и повишена транскрипция на p21. HDAC4 е хистон деацетилаза, която е тъканно специфична, потиска клетъчната диференциация и се регулира надолу по време на процеса на клетъчна диференциация. Работата показва, че HDAC4 е важен регулатор на пролиферацията на клетките на дебелото черво (което е важно в процеса на рак) и той от своя страна се регулира от siRNA.

Катедрата по патология на Медицинския факултет на Медицинския университет в Нара в Япония проведе изследване върху рака на простатата. Репликативното клетъчно стареене е бариера срещу неконтролираното делене и канцерогенезата. Краткотрайните делящи се клетки (TAC) са част от клетъчната популация на простатата, от която се развива туморът. Японски учени изследвали причините, поради които тези клетки преодоляват стареенето. Клетките на простатата в културата бяха трансфектирани с junB siRNA. Тези клетки показват повишено нивоекспресия на p53, p21, p16 и pRb, открита по време на стареене. Клетките в културата, които показват намалени нива на р16, се използват за следващата стъпка. Повтарящата се трансфекция на siRNA в TAC позволява на клетките да избегнат стареенето при p16/pRb инактивиране. В допълнение, заглушаването на junB протоонкогена от junB siRNA причинява клетъчна инвазия. Въз основа на това беше направено заключението, че junB е елемент за p16 и насърчава клетъчното стареене, предотвратявайки злокачествеността (злокачествеността) на TAC. По този начин junB е регулатор на канцерогенезата на простатата и може да бъде цел за терапевтична интервенция. А активността му може да се регулира с помощта на siRNA.

Провеждат се много такива проучвания. В момента siRNA е не само обект, но и инструмент в ръцете на медицински изследовател, биолог, онколог и геронтолог. Изследването на връзката на siRNA с онкологични заболявания, с експресията на свързани с възрастта гени, е най-важната задача за науката. Измина много малко време от откриването на siRNA и колко интересни проучвания и публикации, свързани с тях, се появиха. Няма съмнение, че тяхното изследване ще се превърне в една от стъпките на човечеството към победата над рака и стареенето...