Nastavni rad: Tekuća kromatografija visokih performansi zagađivača prirodnih i otpadnih voda. Tekuća kromatografija HPLC analiza kromatografija

9885 0

HPLC je tekuća kolonska kromatografija u kojoj se mogu koristiti različiti sorpcijski mehanizmi. U suštini, HPLC je moderan oblik klasične tekućinske kolonske kromatografije. U nastavku su navedene neke od najznačajnijih kvalitativnih karakteristika HPFA:
- velika brzina procesa, što je omogućilo smanjenje trajanja odvajanja s nekoliko sati i dana na minute;
- minimalni stupanj zamućenja kromatografskih zona, što omogućuje odvajanje spojeva koji se tek neznatno razlikuju u konstantama sorpcije;
- visok stupanj mehanizacije i automatizacije odvajanja i obrade informacija, zahvaljujući čemu je kolonska tekućinska kromatografija dosegla novu razinu ponovljivosti i točnosti.

Intenzivna istraživanja posljednjih desetljeća, ogromna količina akumuliranih eksperimentalnih podataka danas omogućuju da se govori o klasifikaciji varijanti u okviru metode tekućinske kromatografije visoke učinkovitosti. Naravno, u ovom slučaju, klasifikacija prema gore navedenom mehanizmu sorpcije ostaje valjana.

Uobičajena klasifikacija temelji se na usporednom polaritetu mobilne i stacionarne faze. Razlikuje se kromatografija normalne i reverzne faze.

Kromatografija normalne faze (NPC) je varijanta HPLC-a kada je mobilna faza manje polarna od stacionarne faze, a postoji razlog vjerovati da je glavni čimbenik koji određuje zadržavanje interakcija sorbata izravno s površinom ili volumenom sorbenta .

Kromatografija reverzne faze (RPC) je varijanta HPLC-a kada je mobilna faza polarnija od stacionarne, a zadržavanje se određuje izravnim kontaktom molekula sorbata s površinom ili volumenom sorbenta; u tom se slučaju ionizirani sorbati ne zamjenjuju za ione mobilne faze adsorbirane na površini.

Ion-izmjenjivačka kromatografija - varijanta u kojoj se sorpcija provodi izmjenom sorpiranih iona mobilne faze za ione kromatografiranih tvari; ligand-izmjenjivačka kromatografija može se odrediti na potpuno isti način.

Kromatografija na dinamički modificiranim sorbentima je varijanta HPLC-a, u kojoj sorbat ne stupa u izravnu interakciju s površinom sorbenta, već ulazi u vezu s molekulama blizu površinskih slojeva eluensa.
Ion-par kromatografija je varijanta kromatografije reverzne faze ioniziranih spojeva, u kojoj se mobilnoj fazi dodaje hidrofobni protuion, koji kvalitativno mijenja sorpcijske karakteristike sustava.

Ekskluzijska kromatografija je metoda za odvajanje spojeva prema njihovoj molekularnoj težini, temeljena na razlici u brzini difuzije u porama stacionarne faze molekula različitih veličina.

Za HPFA, vrlo važna karakteristika je veličina sorbenata, obično 3-5 µm, sada do 1,8 µm. To omogućuje brzo i potpuno odvajanje složenih smjesa tvari (prosječno vrijeme analize je od 3 do 30 min).

Zadatak odvajanja rješava se pomoću kromatografske kolone, koja je cijev ispunjena sorbentom. Tijekom analize kroz kromatografsku kolonu konstantnom brzinom se dovodi tekućina (eluens) određenog sastava. Točno izmjerena doza uzorka se ubrizgava u ovaj tok. Komponente uzorka unesene u kromatografsku kolonu, zbog različitog afiniteta prema sorbentu kolone, kreću se duž nje različitim brzinama i do detektora uzastopno stižu u različito vrijeme.

Dakle, kromatografska kolona je odgovorna za selektivnost i učinkovitost odvajanja komponenti. Odabirom različitih vrsta kolona možete kontrolirati stupanj odvajanja analiziranih tvari. Spojevi se identificiraju po vremenu zadržavanja. Kvantitativno određivanje svake komponente izračunava se na temelju veličine analitičkog signala izmjerenog pomoću detektora spojenog na izlaz kromatografske kolone.

Sorbenti. Nastanak HPLC-a uvelike je povezan s stvaranjem novih generacija sorbenata s dobrim kinetičkim svojstvima i različitim termodinamičkim svojstvima. Glavni materijal za sorbente u HPLC-u je silika gel. Mehanički je jak i ima značajnu poroznost, što daje veliki kapacitet izmjene za male veličine stupova. Najčešća veličina čestica je 5-10 mikrona. Što je bliži sferičnom obliku čestica, manji je otpor protoka, to je veća učinkovitost, osobito ako se odstranjuje vrlo uska frakcija (na primjer, 7 +1 mikrona).

Specifična površina silikagela je 10-600 m/g. Silikagel se može modificirati raznim kemijskim skupinama koje se cijepe na površinu (C-18, CN, NH2, SO3H), što omogućuje korištenje sorbenata na njegovoj osnovi za odvajanje različitih klasa spojeva. Glavni nedostatak silikagela je njegova niska kemijska otpornost pri pH< 2 и рН >9 (silicijum se otapa u lužinama i kiselinama). Stoga je trenutno u tijeku intenzivna potraga za sorbentima na bazi polimera koji su stabilni na pH od 1 do 14, na primjer na bazi polimetil metakrilata, polistirena itd.

Sorbenti za ionsko-izmjenjivačku kromatografiju. Zbog posebnosti odvajanja (u kiselom ili alkalnom mediju), glavni materijal je sorbent na polistiren s divinilbenzenom različitog stupnja umrežavanja sa SO3 -H + skupinama cijepljenim na njihovu površinu (jako kiseli kationski izmjenjivači) ili -COO- Naf (izmjenjivači kationa sa slabom kiselinom), -H2N + (CH3) 3Cl- (anionski izmjenjivači jake baze) ili -N+HR2Cl- (anionski izmjenjivači sa slabom bazom).

Sorbenti za gel-penetrirajuću kromatografiju. Glavni tip je stiren-DVB. Također se koriste makroporozna stakla, metil metakrilat, silika gel. Za ionsku ekskluzijsku kromatografiju koriste se isti sorbenti.
Pumpe. Kako bi se osigurao protok mobilne faze (MP) kroz kolonu s navedenim parametrima, koriste se visokotlačne pumpe. Najvažnije specifikacije za LC pumpe su: raspon protoka; maksimalni radni pritisak; ponovljivost protoka; raspon pulsiranja dovoda otapala.

Po prirodi opskrbe otapalom, crpke mogu biti konstantne opskrbe (protoka) i konstantnog tlaka. U osnovi, u analitičkom radu koristi se način konstantnog protoka, pri punjenju kolona koristi se način konstantnog tlaka. Prema principu rada, pumpe se dijele na štrcaljke i klipne klipne pumpe.

štrcaljke. Crpke ovog tipa karakterizira gotovo potpuna odsutnost pulsiranja u protoku mobilne faze tijekom rada. Nedostaci crpke: a) velika potrošnja vremena i otapala za ispiranje pri izmjeni otapala; b) suspenzija odvajanja tijekom punjenja pumpe; c) velike dimenzije i težina uz visok protok i pritisak (potreban vam je snažan motor i velika sila klipa s velikom površinom).

Klipne klipne pumpe. Crpke ovog tipa osiguravaju konstantan volumetrijski protok mobilne faze dugo vremena. Maksimalni radni tlak 300-500 atm, brzina protoka 0,01-10 ml/min. Reproducibilnost volumetrijske hrane - 0,5%. Glavni nedostatak je što se otapalo dovodi u sustav u obliku niza uzastopnih impulsa, pa dolazi do pulsiranja tlaka i protoka.

To je glavni razlog povećane buke i desenzibilizacije gotovo svih detektora koji se koriste u LC, posebice elektrokemijskih. Načini suzbijanja pulsiranja: korištenjem dvostrukih pumpi ili Bag-lai pumpe s dva klipa, korištenjem uređaja za prigušivanje i elektroničkih uređaja.

Količina volumetrijske hrane određena je s tri parametra: promjerom klipa (obično 3,13; 5,0; 7,0 mm), njegovom amplitudom (12-18 mm) i frekvencijom (koja ovisi o brzini rotacije motora i mjenjača) .

Dozatori. Svrha dozatora je prijenos uzorka pri atmosferskom tlaku do ulaza u kolonu pri tlakovima do nekoliko atmosfera. Važno je da u dozatoru nema “mrtvih” volumena koje mobilna faza ne može isprati i da se uzorak ne ispere tijekom doziranja. Isprva su dispenzeri u LC-u bili slični plinskim dozatorima s membranskom punkcijom. Međutim, membrane ne drže više od 50-100 atm, njihova kemijska otpornost je nedovoljna, njihovi komadići onečišćuju filtre stupca i kapilare.

U tekućoj fazi brzina difuzije je mnogo niža nego u plinovitoj fazi. Stoga je moguće dozirati sa zaustavljanjem protoka - uzorak se nema vremena zamutiti u dozatoru. Tijekom ubrizgavanja uzorka u dozator, posebna slavina zatvara protok otapala. Tlak na ulazu u kolonu brzo se smanjuje, nakon nekoliko sekundi uzorak se može ubrizgati u komoru za doziranje konvencionalnom mikrošpricom. Zatim se dozator zaključava, uključuje se protok otapala i dolazi do odvajanja.

Tlak koji ovaj ventil drži je do 500-800 atm. Ali kada se protok zaustavi, ravnoteža u stupcu je poremećena, što može dovesti do pojave "praznih" dodatnih vrhova.

Loop dozatori su najčešće korišteni. Prilikom punjenja dozatora pod visokim tlakom, postoje ulazi 1,2 i kanal između njih. Ulazi 3-6, kanali između njih i petlje za doziranje su pod atmosferskim tlakom, što vam omogućuje punjenje petlje štrcaljkom ili pumpom. Kako se dozator rotira, protok mobilne faze tjera uzorak u kolonu. Kako bi se smanjila pogreška, petlja se ispere s 5-10 puta većim volumenom uzorka. Ako je uzorak mali, onda se može ubrizgati u petlju mikrošpricom. Volumen petlje je obično 5-50 μl.

NA. Voinov, T.G. Volova

U tekućinskoj kromatografiji visoke učinkovitosti (HPLC), priroda procesa koji se odvijaju u kromatografskoj koloni općenito je identična procesima u plinskoj kromatografiji. Razlika je samo u korištenju tekućine kao stacionarne faze. Zbog velike gustoće tekućih mobilnih faza i velikog otpora kolona, ​​plinska i tekućinska kromatografija uvelike se razlikuju u instrumentaciji.

U HPLC, čista otapala ili njihove smjese obično se koriste kao mobilne faze.

Za stvaranje struje čistog otapala (ili mješavine otapala), koji se u tekućinskoj kromatografiji naziva eluent, koriste se pumpe koje su dio hidrauličkog sustava kromatografa.

Adsorpcijska kromatografija provodi se kao rezultat interakcije tvari s adsorbensima, kao što su silikagel ili aluminijev oksid, koji imaju aktivna središta na površini. Razlika u sposobnosti interakcije s adsorpcijskim centrima različitih molekula uzorka dovodi do njihovog razdvajanja u zone u procesu kretanja s mobilnom fazom kroz kolonu. Podjela komponentnih zona postignuta u ovom slučaju ovisi o interakciji i s otapalom i s adsorbensom.

Silika gel adsorbenti s različitim volumenima, površinama i promjerima pora nalaze najveću primjenu u HPLC-u. Aluminijev oksid i drugi adsorbenti koriste se mnogo rjeđe. Glavni razlog za to:

nedovoljna mehanička čvrstoća, koja ne dopušta pakiranje i korištenje pri povišenim tlakovima tipičnim za HPLC;

silika gel u usporedbi s aluminijevim oksidom ima širi raspon poroznosti, površine i promjera pora; značajno veća katalitička aktivnost aluminijevog oksida dovodi do izobličenja rezultata analize zbog razgradnje komponenti uzorka ili njihove ireverzibilne kemisorpcije.

HPLC detektori

Tekućinska kromatografija visoke učinkovitosti (HPLC) koristi se za otkrivanje polarnih nehlapljivih tvari, koje se iz nekog razloga ne mogu pretvoriti u oblik pogodan za plinsku kromatografiju, čak ni u obliku derivata. Takve tvari posebno uključuju sulfonske kiseline, boje topive u vodi i neke pesticide, kao što su derivati ​​fenil-uree.

detektori:

UV - diodni niz detektora. "Matrica" ​​fotodioda (ima ih više od dvjesto) neprestano registrira signale u UV i vidljivom području spektra, čime se osigurava snimanje UV-B spektra u načinu skeniranja. To omogućuje kontinuirano snimanje, uz visoku osjetljivost, neiskrivljenih spektra komponenti koje brzo prolaze kroz posebnu ćeliju.

U usporedbi s detekcijom na jednoj valnoj duljini, koja ne daje informacije o "čistoći" vrha, sposobnost usporedbe cijelog spektra niza dioda daje rezultat identifikacije s mnogo većim stupnjem sigurnosti.

Fluorescentni detektor. Velika popularnost fluorescentnih detektora posljedica je vrlo visoke selektivnosti i osjetljivosti te činjenice da mnogi zagađivači okoliša fluoresciraju (na primjer, poliaromatski ugljikovodici).

Elektrokemijski detektor služe za otkrivanje tvari koje se lako oksidiraju ili reduciraju: fenoli, merkaptani, amini, aromatični nitro i halogeni derivati, aldehidi, ketoni, benzidini.

Kromatografsko odvajanje smjese na koloni zbog sporog napredovanja PF traje dugo. Kako bi se ubrzao proces, kromatografija se provodi pod pritiskom. Ova metoda se naziva tekućinska kromatografija visoke učinkovitosti (HPLC).

Modernizacija opreme koja se koristi u klasičnoj tekućinskoj kolonskoj kromatografiji učinila ju je jednom od perspektivnih i modernih metoda analize. Tekućinska kromatografija visoke učinkovitosti prikladna je metoda za odvajanje, preparativno izoliranje i izvođenje kvalitativne i kvantitativne analize nehlapljivih, termolabilnih spojeva niske i visoke molekularne težine.

Ovisno o vrsti sorbenta koji se koristi u ovoj metodi, koriste se 2 varijante kromatografije: na polarnom sorbentu koji koristi nepolarni eluent (opcija izravne faze) i na nepolarnom sorbentu pomoću polarnog eluenta - tzv. reverzni sorbent -fazna tekućinska kromatografija visoke učinkovitosti (RPHLC).

Kada eluens prijeđe u eluent, ravnoteža u uvjetima RPHLC se uspostavlja mnogo puta brže nego u uvjetima polarnih sorbenata i nevodenih PF-a. Kao rezultat toga, kao i praktičnosti rada s vodom i vodeno-alkoholnim eluentima, RPHLC je sada stekao veliku popularnost. Većina HPLC analiza provodi se ovom metodom.

Detektori. Registriranje izlaza iz stupca zasebne komponente vrši se pomoću detektora. Za registraciju možete koristiti promjenu bilo kojeg analitičkog signala koji dolazi iz mobilne faze i koji se odnosi na prirodu i količinu komponente smjese. Tekuća kromatografija koristi analitičke signale kao što su apsorpcija svjetlosti ili emisija svjetlosti izlazne otopine (fotometrijski i fluorimetrijski detektori), indeks loma (refraktometrijski detektori), potencijal i električna vodljivost (elektrokemijski detektori) itd.

Rekorder bilježi kontinuirano detektirani signal. Kromatogram je slijed detektorskih signala snimljenih na vrpci snimača, generiranih kada pojedine komponente smjese izađu iz kolone. U slučaju odvajanja smjese, na vanjskom kromatogramu vidljivi su pojedinačni vrhovi. Položaj vrha na kromatogramu koristi se u svrhu identifikacije tvari, visina ili površina vrha - u svrhu kvantitativnog određivanja.

Uvod.

Brzi razvoj tekućinske kromatografije u posljednjih 10 godina uglavnom je posljedica intenzivnog razvoja teoretskih temelja i praktične uporabe njezine visoko učinkovite inačice, kao i stvaranja i industrijske proizvodnje potrebnih sorbenata i opreme.

Posebnost tekućinske kromatografije visokih performansi (HPLC) je uporaba sorbenata s veličinom zrna od 3-10 µm, koji osigurava brz prijenos mase uz vrlo visoku učinkovitost odvajanja.

Trenutno je HPLC zauzeo prvo mjesto među instrumentalnim metodama po brzini razvoja, nadmašujući čak i plinsku kromatografiju. Najvažnija prednost HPLC-a u usporedbi s plinskom kromatografijom je mogućnost proučavanja gotovo bilo kojeg objekta bez ikakvih ograničenja na njihova fizikalno-kemijska svojstva, na primjer, na vrelište ili molekularnu težinu.

Danas je HPLC dobro oblikovana instrumentalna metoda koja se široko koristi u raznim područjima znanosti i tehnologije. Njegova je važnost posebno velika u važnim područjima kao što su biokemija, molekularna biologija, kontrola onečišćenja okoliša, kao i u kemijskoj, petrokemijskoj, prehrambenoj i farmaceutskoj industriji.

budući da je potrebno uzeti u obzir niz vrlo specifičnih zahtjeva zbog sljedećih značajki metodologije.

a. Kolone za HPLC napunjene su nosačem s vrlo malim promjerom čestica. Kao rezultat, na stupcu se stvaraju visoki tlakovi pri brzinama u prostoru otapala koje su potrebne za brzo odvajanje uzoraka.

b. Detektori koji se koriste u HPLC-u osjetljivi su na fluktuacije protoka i tlaka eluensa (šum). Štoviše, kada se koriste detektori koncentracije, potrebna je još veća stabilnost volumne brzine eluensa.

u. Proces kromatografskog odvajanja popraćen je nizom antagonističkih učinaka, na primjer, disperzija uzorka u mobilnoj fazi dovodi do miješanja odvojenih komponenti i smanjuje maksimalnu koncentraciju tvari u eluirajućem vrhu (u detektoru). Disperzija se opaža u svim dijelovima sustava od točke ubrizgavanja uzorka do detektora.

d. Otapala koja djeluju kao mobilna faza često su sposobna korodirati opremu. To se prvenstveno odnosi na otapala koja se koriste u kromatografiji reverzne faze, što se preferira u biokemijskim HPLC aplikacijama.

Specifičnosti HPLC-a kao instrumentalne tehnike moraju se uzeti u obzir u procesu razvoja, stvaranja i rada ovih sustava. Bilo je potrebno više od deset godina pretraživanja i istraživanja kako bi se stvorili komercijalni uzorci kromatografskih sustava i njihovih komponenti koji su dovoljno pouzdani, jednostavni i sigurni za rad s prihvatljivim omjerom cijene i tehničkih karakteristika. Nedavni trendovi prema smanjenju jezgri (i duljine i promjera) tjeraju nas da postavljamo nove zahtjeve za instrumente.

1.1. UČINKOVITOSTISELEKTIVNOST

Kromatografija je metoda odvajanja komponenti smjese na temelju razlike u njihovoj ravnotežnoj distribuciji između dviju "faza koje se ne miješaju, od kojih je jedna stacionarna, a druga pokretna. Komponente uzorka kreću se kroz kolonu kada su u mobilnoj fazi i ostaju na mjestu kada su veći afinitet komponente za stacionarnu fazu, a manji za mobilnu fazu, to se sporije kreće kroz stup i duže se zadržava u njemu. Zbog razlike u afinitetu komponente smjese za stacionarne i pokretne prihvatljivo vrijeme smjesu u pojedinačne trake (vrhove) komponenti dok se kreću kroz kolonu s mobilnom fazom.

Iz ovih općih ideja jasno je da je kromatografsko odvajanje moguće samo ako će komponente uzorka, koje ulaze u kolonu tijekom ubrizgavanja uzorka, prvo biti otopljene u mobilnoj fazi i, kao drugo, interagirati (zadržati) s stacionarnom fazom. Ako bilo koja komponenta nije u otopini kada se uzorak ubrizgava, bit će filtrirana i neće sudjelovati u kromatografskom procesu. Slično, komponente koje ne stupaju u interakciju sa stacionarnom fazom proći će kroz kolonu s mobilnom fazom bez razdvajanja na komponente.

Prihvatimo uvjet da su neke dvije komponente topive u mobilnoj fazi i da stupaju u interakciju sa stacionarnom fazom, tj. da se kromatografski proces može odvijati bez smetnji. U tom slučaju, nakon prolaska smjese kroz kolonu, mogu se dobiti kromatogrami oblika a, b ili u(slika 1.1). Ovi kromatogrami ilustriraju kromatografska odvajanja koja se razlikuju po učinkovitosti (a i b) s jednakom selektivnošću i selektivnošću (b i u) s jednakom učinkovitošću.

Učinkovitost kolone je veća što je uži vrh postignut uz isto vrijeme zadržavanja. Učinkovitost kolone mjeri se brojem teoretskih ploča (NPP) N: što je veći ef-

Riža. 1.2. Parametri kromatografskog pika i izračun broja teoretskih ploča:

t R - vrijeme vršnog zadržavanja; h - visina vrha; Wj/j - širina vrha na polovici njegove visine

Riža. 1.1. Vrsta kromatograma ovisno o učinkovitosti i selektivnosti kolone:

a- konvencionalna selektivnost, smanjena učinkovitost (manje teorijskih ploča); b - konvencionalna selektivnost i učinkovitost; u - konvencionalna učinkovitost, povećana selektivnost (veći omjer vremena zadržavanja komponenti)

učinkovitost, što je veći FTT, što je manja ekspanzija vršne širine početno uskog pojasa dok prolazi kroz stupac, to je uži vrh na izlazu kolone. NTT karakterizira broj koraka za uspostavljanje ravnoteže između mobilne i stacionarne faze.

Poznavanje broja teoretskih ploča po stupcu i duljine stupa L (µm), kao i prosječni promjer zrna sorbenta dc (µm), lako je dobiti vrijednosti teorijske ekvivalentne visine ploče (HETP), kao i smanjene teorijske ekvivalentne visine ploče (PHETP):

HETT = L/ N

PVETT \u003d B3TT / d c .

Uz vrijednosti NTT, HETP i PVETP, lako se može usporediti učinkovitost kolona različitih tipova, različitih duljina, ispunjenih sorbentima različite prirode i granulacije. Uspoređujući NTT dva stupca iste duljine, usporedite njihovu učinkovitost. Kada se uspoređuje HETP, stupci se uspoređuju sa sorbentima iste veličine zrna, različitih duljina. Konačno, vrijednost PVETT omogućuje za bilo koje dvije kolone procjenu kvalitete sorbenta, prvo, i kvalitetu punjenja kolona, ​​i drugo, bez obzira na duljinu kolona, ​​zrnastost prema sorbentima njegove prirode.

Selektivnost kolone igra veliku ulogu u postizanju kromatografskog odvajanja.

Selektivnost kolone ovisi o velikom broju čimbenika, a vještina eksperimentatora uvelike je određena sposobnošću utjecaja na selektivnost razdvajanja. Za to, kromatograf ima tri vrlo važna čimbenika u svojim rukama: izbor kemijske prirode sorbenta, izbor sastava otapala i njegovih modifikatora, te razmatranje kemijske strukture i svojstava komponenti za biti odvojeni. Ponekad zamjetan učinak na selektivnost ima promjena temperature kolone, koja mijenja koeficijente raspodjele tvari između pokretne i stacionarne faze.

Kada se razmatra razdvajanje dviju komponenti u kromatogramu i ocjenjuje ga, rezolucija je važan parametar. Rs, koji povezuje vrijeme izlaska i širine vrhova obje odvojene komponente

Rezolucija kao parametar koji karakterizira razdvajanje vrhova raste kako raste selektivnost, što se odražava povećanjem brojnika, a povećava se učinkovitost, koja se odražava smanjenjem vrijednosti nazivnika zbog smanjenja širine vrhova. Stoga je brzi napredak tekućinske kromatografije doveo do promjene koncepta "tekućinske kromatografije visokog tlaka" - zamijenjena je "tekućinskom kromatografijom visokog učinka" (dok je skraćena oznaka pojma na engleskom jeziku sačuvana HPLC kao najispravnija karakterizacija smjera razvoja moderne tekućinske kromatografije).

Dakle, ispiranje kolone se smanjuje, a učinkovitost povećava kada se koriste finiji, ujednačeniji (uski rez) sorbent, gušće i ujednačenije pakirane u koloni, tanje vezane faze, manje viskozna otapala i optimalne brzine protoka.

Međutim, uz razmazivanje trake kromatografske zone tijekom odvajanja u koloni, ona se može razmazati i u uređaju za ubrizgavanje uzorka, u kapilare za spajanje injektor-kolona i kolona-detektor, u detektorsku ćeliju i u neke pomoćne uređaje ( mikrofilteri za hvatanje mehaničkih čestica iz uzoraka instaliranih nakon injektora, predkolona, ​​reaktorskih zavojnica itd.) - Zamućenje je veće, veći je volumen ekstra-kolone u odnosu na zadržani volumen vrha. Također je važno gdje se nalazi mrtvi volumen: što je kromatografski poziv uži, mrtvi volumen će biti zamućeniji. Stoga posebnu pozornost treba obratiti na dizajn onog dijela kromatografa gdje je kromatografska zona najuža (injektor i uređaji od injektora do kolone) – ovdje je razmazivanje izvan kolone najopasnije i utječe na najviše. Iako se smatra da u dobro dizajniranim kromatografima izvore dodatnog razmazivanja izvan kolone treba minimizirati, ipak svaki novi uređaj, svaka izmjena kromatografa, nužno mora završiti ispitivanjem na koloni i usporedbom dobivenog kromatograma s onaj za putovnicu. Ako se primijeti vršno izobličenje, oštar pad učinkovitosti, potrebno je pažljivo pregledati kapilare i druge uređaje koji su tek uvedeni u sustav.

Razmazivanje izvan kolone i njegova pogrešna procjena može dovesti do značajnog (preko 50%) gubitka učinkovitosti, posebno kada se pokušavaju koristiti relativno stari kromatografi za HPLC velike brzine, HPLC na mikro kolonama i druge moderne HPLC aplikacije koje zahtijevaju mikroinjektore , spojne kapilare s unutarnjim promjerom 0,05-0,15 mm minimalne duljine, kolone kapaciteta 10-1000 µl, detektori s mikrokivetama kapaciteta 0,03-1 µl i s velikom brzinom, brzi snimači i integratori.

1.2. ZADRŽAVANJE I ČVRSTOĆA OTAPALA

Kako bi se analiti razdvojili na stupcu, kao što je gore spomenuto, faktor kapaciteta k" mora biti veći od 0, tj. tvari moraju biti zadržane stacionarnom fazom, sorbentom. Međutim, faktor kapacitivnosti ne smije biti prevelik za postizanje prihvatljivog vremena eluiranja. Ako se za danu smjesu tvari odabere stacionarna faza koja ih drži, tada se daljnji rad na razvoju analitičkog postupka sastoji u odabiru otapala koje bi u idealnom slučaju omogućilo različito za sve komponente, ali prihvatljivo ne jako. velika k". To se postiže promjenom jačine eluiranja otapala.

U slučaju adsorpcijske kromatografije na silika gelu ili aluminijevom oksidu, u pravilu se jačina dvokomponentnog otapala (na primjer, heksana s dodatkom izopropanola) povećava povećanjem sadržaja polarne komponente (izopropanola) u njemu. , ili smanjen smanjenjem sadržaja izopropanola. Ako sadržaj polarne komponente postane prenizak (manje od 0,1%), treba je zamijeniti slabijom snagom eluiranja. Isto se radi, zamjenjujući ili polarnu ili nepolarnu komponentu s drugima, čak i ako dati sustav ne pruža željenu selektivnost u odnosu na komponente mješavine od interesa. Prilikom odabira sustava otapala uzimaju se u obzir i topljivost komponenti smjese i eluotropni niz otapala koje su sastavili različiti autori.

Približno na isti način odabire se jačina otapala u slučaju korištenja cijepljenih polarnih faza (nitril, amino, diol, nitro itd.), uzimajući u obzir moguće kemijske reakcije i isključujući otapala opasna za fazu (npr. , ketoni za amino fazu).

U slučaju kromatografije reverzne faze, jačina otapala se povećava povećanjem sadržaja organske komponente (metanol, acetonitril ili THF) u eluensu i smanjuje dodavanjem više vode. Ako se ne može postići željena selektivnost, koristi se druga organska komponenta ili se pokušava promijeniti uz pomoć raznih aditiva (kiseline, reagensi ion-par itd.).

Kod odvajanja ionsko-izmjenjivačkom kromatografijom jačina otapala se mijenja povećanjem ili smanjenjem koncentracije puferske otopine ili promjenom pH, u nekim slučajevima se koristi modifikacija organskim tvarima.

Međutim, osobito u slučaju složenih prirodnih i bioloških smjesa, često nije moguće odabrati jačinu otapala na način da se sve komponente uzorka eluiraju u prihvatljivom vremenu. Tada je potrebno pribjeći gradijentnom eluiranju, odnosno upotrijebiti otapalo čija se snaga eluiranja tijekom analize mijenja tako da se stalno povećava prema unaprijed određenom programu. Ovom tehnikom moguće je postići eluiranje svih komponenti složenih smjesa u relativno kratkom vremenskom razdoblju i njihovo razdvajanje na komponente u obliku uskih vrhova.

1.3. VELIČINA SORBENTNIH ČESTICA, PROPUSNOST I UČINKOVITOST

S obzirom na ispiranje kolone, istaknuli smo da učinkovitost kolone (HETP) ovisi o veličini čestica sorbenta. U velikoj mjeri, brzi razvoj HPLC-a u posljednjih 10-12 godina bio je posljedica, prije svega, razvoja metoda za dobivanje sorbenata veličine čestica od 3 do 10 μm i uskog frakcijskog sastava, koji osiguravaju visoku učinkovitost s dobra propusnost, i drugo, razvoj metoda punjenja kolona ovim sorbentima i, treće, razvoj i serijska proizvodnja tekućinskih kromatografa s pumpama za visoke tlakove, injektorima i detektorima s kivetama malog volumena koji mogu registrirati male volumne pikove.

Za dobro nabijene stupce suspenzije, teoretska visina ekvivalenta ploče (REHP) može biti 2 bez obzira na to jesu li za pakiranje korištene čestice od 3, 5, 10 ili 20 µm. U ovom slučaju dobit ćemo stupove (standardne duljine od 250 mm) s učinkovitošću od 41670, 25000, 12500 i 6250 tona. Čini se prirodnim odabrati najučinkovitiji stupac napunjen česticama od 3 µm. Međutim, ova učinkovitost dolazi po cijenu rada pri vrlo visokim tlakovima i relativno sporoj stopi odvajanja, budući da je dostupna pumpa vjerojatno sposobna pumpati otapalo kroz takav stupac velikom brzinom u prostoru. Ovdje smo suočeni s pitanjem odnosa između veličine čestica sorbenta, učinkovitosti i propusnosti stupaca.

Ako odavde izrazimo faktor otpora stupa - bezdimenzijsku vrijednost, dobivamo sljedeću jednadžbu:

Faktor otpora za stupove napunjene mikročesticama iste vrste istom metodom mijenja se neznatno i iznosi sljedeće vrijednosti:

Particle View"....Nepravilna sferna

oblik oblika

Suho pakiranje. . . . . 1000-2000 800-1200

suspenzijsko pakiranje. . . 700-1500 500-700

Ulazni tlak u koloni proporcionalan je linearnoj brzini protoka, faktoru otpora kolone, viskoznosti otapala i duljini kolone i obrnuto proporcionalan kvadratu promjera čestica.

Primjenom ove ovisnosti za gore navedene stupce s česticama promjera 3, 5, 10 i 20 μm i uz pretpostavku konstantne linearne brzine strujanja, faktora otpora kolone i viskoziteta otapala, dobivamo omjer ulaznog tlaka od 44:16:4:1 za stupovi jednake duljine. Dakle, ako se za sorbent reverzne faze s veličinom čestica od 10 mikrona pri korištenju sustava otapala metanol - . voda (70:30) je obično na standardnoj koloni pri brzini protoka otapala od 1 ml/min, tlak na ulazu u kolonu je 5 MPa, zatim za čestice od 5 mikrona - 20 MPa i za 3 mikrona - 55 MPa. Pri korištenju silika gela i manje viskoznog sustava otapala heksan - izopropanol (100:2), vrijednosti će biti znatno niže: 1, 4 i 11 MPa, respektivno. Ako je u slučaju sorbenta obrnute faze vrlo problematično korištenje čestica veličine 3 µm, a moguće je i 5 µm, ali ne na svim uređajima, tada za sorbent normalne faze nema problema s tlakom. Treba napomenuti da moderni HPLC velike brzine obično koristi veće brzine protoka otapala nego u gornjem primjeru, tako da se zahtjevi za tlakom još više povećavaju.

Međutim, u onim slučajevima kada je za odvajanje potreban određeni broj teoretskih ploča i poželjno je napraviti brzinsku analizu, slika se donekle mijenja. Budući da će duljina stupaca sa sorbentima veličine zrna od 3, 5, 10 mikrona, s jednakom učinkovitošću, biti 7,5, respektivno; 12,5 i 25 cm, tada će se omjer tlaka na ulazu u kolonu promijeniti na 3,3:2:1. Sukladno tome, trajanje analize na takvim stupcima jednake učinkovitosti bit će povezano kao 0,3:0,5:1, tj. pri pomicanju s 10 na 5 i 3 μm, trajanje analize će se smanjiti za 2 i 3,3 puta. Ova brža analiza dolazi po cijeni proporcionalno većeg ulaznog tlaka u koloni.

Navedeni podaci vrijede za one slučajeve kada sorbenti različite granulacije imaju iste krivulje raspodjele veličine čestica, kolone su pakirane na isti način i imaju isti faktor otpora stupca. Treba imati na umu da se poteškoća dobivanja uskih frakcija sorbenta povećava kako se veličina čestica smanjuje i to. frakcije različitih proizvođača imaju različit frakcijski sastav. Stoga će faktor otpora stupca varirati ovisno o veličini zrna, vrsti sorbenta, načinu pakiranja kolone itd.

KLASIFIKACIJA HPLC METODA PREMA MEHANIZMU SEPARACIJE

Većina odvajanja koje se provodi HPLC temelji se na mješovitom mehanizmu interakcije tvari sa sorbentom, koji osigurava veće ili manje zadržavanje komponenti u koloni. Mehanizmi razdvajanja u više ili manje čistom obliku su u praksi prilično rijetki, na primjer, adsorpcijski kada se za odvajanje aromatskih ugljikovodika koriste apsolutno bezvodni silika gel i bezvodni heksan.

S mješovitim mehanizmom zadržavanja za tvari različite strukture i molekularne težine, moguće je procijeniti doprinos adsorpcije, distribucije, isključivanja i drugih mehanizama zadržavanju. Međutim, za bolje razumijevanje i razumijevanje mehanizama razdvajanja u HPLC-u, preporučljivo je uzeti u obzir separacije s prevladavanjem jednog ili drugog mehanizma kao povezane s određenom vrstom kromatografije, na primjer kromatografijom ionske izmjene.

2.1.1 ADSORPCIJSKA KROMATOGRAFIJA

Odvajanje adsorpcijskom kromatografijom provodi se kao rezultat interakcije tvari s adsorbensima, kao što su silikagel ili aluminijev oksid, koji imaju aktivna središta na površini. Razlika u sposobnosti interakcije s adsorpcijskim centrima različitih molekula uzorka dovodi do njihovog razdvajanja u zone u procesu kretanja s mobilnom fazom kroz kolonu. Razdvajanje komponentnih zona postignuto u ovom slučaju ovisi o interakciji i s otapalom i s adsorbensom.

Sorpcija na površini adsorbenta koji ima hidroksilne skupine temelji se na specifičnoj interakciji između polarne površine adsorbenta i polarnih (ili polarizabilnih) skupina ili područja molekula. Takve interakcije uključuju dipol-dipol interakciju između stalnih ili induciranih dipola, stvaranje vodikove veze do stvaranja n-kompleksa ili kompleksa za prijenos naboja. Moguća i prilično česta u praktičnom radu je manifestacija kemisorpcije, što može dovesti do značajnog povećanja vremena zadržavanja, oštrog smanjenja učinkovitosti, pojave produkata raspadanja ili nepovratne sorpcije tvari.

Izoterme adsorpcije tvari imaju linearan, konveksan ili konkavni oblik. Uz linearnu izotermu adsorpcije, vrh tvari je simetričan i vrijeme zadržavanja ne ovisi o veličini uzorka. Najčešće su izoterme adsorpcije tvari nelinearne i imaju konveksan oblik, što dovodi do neke asimetrije vrha s formiranjem repa.

Silika gel adsorbenti s različitim volumenima pora, površinama i promjerima pora nalaze najveću primjenu u HPLC. Aluminijev oksid se koristi mnogo rjeđe i, iznimno rijetko, drugi adsorbenti koji se široko koriste u klasičnoj kolonskoj i tankoslojnoj kromatografiji. Glavni razlog tome je nedovoljna mehanička čvrstoća većine drugih adsorbenata, što ne dopušta njihovo pakiranje i korištenje pri povišenim tlakovima tipičnim za visokotlačne tekućine.

Polarne skupine odgovorne za adsorpciju i smještene na površini silikagela i aluminijevog oksida slične su po svojstvima. Stoga su obično redoslijed eluiranja smjesa tvari i eluotropni niz otapala za njih isti. Međutim, razlika u kemijskoj strukturi silikagela i aluminijevog oksida ponekad dovodi do razlika u selektivnosti - tada se prednost daje jednom ili drugom adsorbentu koji je prikladniji za ovaj konkretni zadatak. Na primjer, aluminij osigurava veću selektivnost u odvajanju određenih policikličkih aromatskih ugljikovodika.

Prednost se obično daje silika gelu u odnosu na aluminij zbog šireg izbora silika gela u smislu poroznosti, površine i promjera pora, kao i značajno veće katalitičke aktivnosti glinice, što često dovodi do izobličenja rezultata analize. zbog razgradnje komponenti uzorka ili njihove nepovratne kemisorpcije.

2.1.2 Nedostaci adsorpcijske kromatografije koji ograničavaju njezinu upotrebu

Popularnost adsorpcijske kromatografije postupno je opadala kako se HPLC metoda razvijala, sve je više zamjenjivana i nastavlja se zamjenjivati ​​drugim opcijama, kao što su HPLC s reverznom fazom i HPLC normalne faze na sorbentima vezane faze. Koji su nedostaci adsorpcijske kromatografije doveli do toga?

Prije svega, to je dugo trajanje procesa balansiranja adsorbenata s otapalima koja sadrže vodu u tragovima, teškoća pripreme takvih otapala s određenim i ponovljivim sadržajem vlage. To rezultira slabom ponovljivošću parametara zadržavanja, rezolucije i selektivnosti. Iz istog razloga nemoguće je koristiti gradijentno eluiranje – povratak u početno stanje je toliko dug da značajno premašuje dobitak u vremenu zbog korištenja gradijenta.

Značajni nedostaci adsorbenata, posebice aluminijevog oksida, povezani s čestim preraspodjelama spojeva osjetljivih na katalizu, njihovom razgradnjom, ireverzibilnom sorpcijom, također su dobro poznati i više puta su zabilježeni u literaturi. Nepovratno adsorbirajuće tvari, nakupljajući se u početnom dijelu kolone, mijenjaju prirodu sorbenta, mogu dovesti do povećanja otpora stupca ili čak do njegovog potpunog začepljenja. Posljednji nedostatak može se otkloniti korištenjem predstupca, koji na- kako se otpornost i začepljenje povećavaju, zamjenjuje se novim * ili se ponovno puni novim sorbentom. Međutim, ireverzibilna sorpcija, koja se također događa u ovom slučaju, dovodi do kromatograma u kojem komponente uzorka osjetljive na sorpciju ili katalitičku razgradnju potpuno ili djelomično odsutne.

2.2. DISTRIBUCIJSKA KROMATOGRAFIJA

Razdjelna kromatografija je varijanta HPLC u kojoj se razdvajanje smjese na komponente provodi zbog razlike u njihovim koeficijentima raspodjele između dviju faza koje se ne miješaju: otapala (mobilna faza) i faze na sorbentu (stacionarna faza). Povijesno gledano, prvi su bili sorbenti ovog tipa, koji su se dobivali nanošenjem tekućih faza (oksidipropionitrila, parafinskog ulja i dr.) na porozne nosače, slično kao što su se pripremali i pripremali sorbenti za plinsko-tekućinsku kromatografiju (GLC). Međutim, odmah su se otkrili nedostaci takvih sorbenata, od kojih je glavni bio relativno brzo ispiranje faze s nosača. Zbog toga se količina faze u koloni postupno smanjivala, smanjivala su se i vremena retencije, a adsorpcijski centri koji nisu pokriveni fazom su se pojavili u početnom dijelu kolone, što je uzrokovalo stvaranje vršnih repova. Ovaj nedostatak je prevladan zasićenjem otapala s podržanom fazom čak i prije nego što je ušlo u kolonu. Prijenos se također smanjio kada su se koristile viskoznije i manje topive polimerne faze, međutim, u ovom slučaju, zbog poteškoće difuzije iz debelih polimernih filmova, učinkovitost kolona je značajno smanjena.

Pokazalo se logičnim cijepiti tekuću fazu na nosač kemijskim vezama na način da njezino uvlačenje postane fizički nemoguće, odnosno pretvoriti nosač i fazu u jedinstvenu cjelinu - u tzv. sorbent.

U budućnosti su napori istraživača bili usmjereni na potragu za reagensima čije bi cijepljenje išlo prilično brzo i potpuno, a nastale veze bile što stabilnije. Ti su reagensi bili alkilklorosilani i njihovi derivati, što je omogućilo dobivanje sorbenata u fazi cijepljene različite vrste i s različitim polarnim i nepolarnim skupinama na površini pomoću slične tehnologije.

Uspješna uporaba potonjeg tipa sorbenata za HPLC pridonijela je rastu njihove proizvodnje od strane raznih proizvođača. Svaka tvrtka proizvodi takve sorbente, u pravilu, na temelju vlastite vrste silika gela i prema vlastitoj tehnologiji, što obično predstavlja "know-how" proizvodnje. Kao rezultat toga, veliki broj sorbenata koji su kemijski nazvani potpuno istim (na primjer, silika gel s cijepljenim oktadecilsilanom) imaju vrlo različite kromatografske karakteristike. To je zbog činjenice da silikagel može imati šire ili uže pore, različitu površinu, poroznost, njegova površina prije cijepljenja može biti hidroksilirana ili ne, mono-, di- ili triklorosilani se mogu cijepiti, uvjeti cijepljenja mogu dati monomerne, polimerne ili sloj mješovite faze, koriste se različite metode uklanjanja zaostalih reagensa, dodatna deaktivacija silanola i drugih aktivnih skupina može se koristiti, ali i ne mora.

Složenost tehnologije cijepljenja reagensa i pripreme sirovina i materijala, njezina višestupanjska priroda dovode do činjenice da čak i serije sorbenata dobivene istom tehnologijom od istog proizvođača mogu imati neznatno različite kromatografske karakteristike. To posebno vrijedi za one slučajeve kada se takvi sorbenti koriste za analizu višekomponentnih smjesa koje sadrže tvari koje se značajno razlikuju po broju i položaju funkcionalnih skupina, te po vrsti funkcionalnosti.

S obzirom na navedeno, uvijek treba nastojati * da se pri korištenju metode analize koja je opisana u literaturi koristi potpuno isti sorbent i isti radni uvjeti. U ovom slučaju, vjerojatnost da se djelo ne može reproducirati je minimalna. Ako to nije moguće, a uzima se sorbent druge tvrtke sa sličnom vezanom fazom, morate biti spremni na činjenicu da će biti potreban dugotrajan rad na preradi tehnike. Istodobno, postoji mogućnost (i to treba uzeti u obzir) da se na ovom sorbentu ne može postići potrebno odvajanje ni nakon dugog razvoja. Prisutnost u literaturi brojnih opisanih postupaka separacije na dugo proizvedenim starim sorbentima iz tog razloga potiče njihovu daljnju proizvodnju i korištenje. Međutim, u onim slučajevima kada je potrebno pristupiti razvoju originalnih metoda, posebno u odnosu na tvari sklone razgradnji, kemisorpciji i preraspodjelu, preporučljivo je započeti s radom na sorbentima koji su nedavno razvijeni, a proizvode ih novi. , poboljšane verzije tehnologije. Novi sorbenti imaju ujednačeniji frakcijski sastav, ujednačeniju i potpuniju pokrivenost površine vezanom fazom te naprednije završne faze obrade sorbenta.

2.3. IONIZMJENJSKA KROMATOGRAFIJA

U kromatografiji s ionskom izmjenom, razdvajanje komponenti smjese postiže se reverzibilnom interakcijom tvari koje se ioniziraju s ionskim skupinama sorbenta. Očuvanje električne neutralnosti sorbenta osigurava prisutnost protuiona sposobnih za ionsku izmjenu koji se nalaze u neposrednoj blizini površine. Ion unesenog uzorka, u interakciji s fiksnim nabojem sorbenta, izmjenjuje se s protuionom. Tvari koje imaju različite afinitete za fiksne naboje odvajaju se na anionskim izmjenjivačima ili na kationskim izmjenjivačima. Anionski izmjenjivači imaju pozitivno nabijene skupine na površini i sorbiraju anione iz mobilne faze. Kationski izmjenjivači, odnosno, sadrže skupine s negativnim nabojem koje međusobno djeluju s kationima. .

Kao mobilna faza koriste se vodene otopine soli kiselina, baza i otapala kao što je tekući amonijak, tj. sustavi otapala visoke dielektrične konstante e i visoke sklonosti ionizaciji spojeva. Obično rade s puferskim otopinama koje vam omogućuju podešavanje pH vrijednost.

Tijekom kromatografskog odvajanja, ioni analita se natječu s ionima sadržanim u eluensu, nastojeći stupiti u interakciju sa suprotno nabijenim skupinama sorbenta. Slijedi da se kromatografija ionske izmjene može koristiti za odvajanje svih spojeva koji se mogu ionizirati na bilo koji način. Moguće je analizirati čak i neutralne molekule šećera u obliku njihovih kompleksa s boratnim ionom:

Šećer + IN 3 2 - \u003d Šećer - IN 3 2 -.

Iono-izmjenjivačka kromatografija neophodna je za odvajanje visoko polarnih tvari koje se ne mogu analizirati GLC-om bez pretvorbe u derivate. Ovi spojevi uključuju aminokiseline, peptide, šećere.

Iono-izmjenjivačka kromatografija ima široku primjenu u medicini, biologiji, biokemiji, za kontrolu okoliša, u analizi sadržaja lijekova i njihovih metabolita u krvi i urinu, pesticida u prehrambenim sirovinama, kao i za odvajanje anorganskih spojeva, uključujući radioizotope, lantanoide, aktinide itd. Analiza biopolimera (proteina, nukleinskih kiselina itd.), koja je obično trajala satima ili danima, pomoću ionsko-izmjenjivačke kromatografije provodi se za 20-40 minuta uz bolje odvajanje. Korištenje ionsko-izmjenjivačke kromatografije u biologiji omogućilo je izravno promatranje uzoraka u biološkim medijima, smanjujući mogućnost preuređivanja ili izomerizacije, što može dovesti do pogrešne interpretacije konačnog rezultata. Zanimljivo je koristiti ovu metodu za kontrolu promjena u biološkim tekućinama. Upotreba slabih anionskih izmjenjivača na bazi poroznog silikagela omogućila je odvajanje peptida. V

Mehanizam ionske izmjene može se predstaviti kao sljedeće jednadžbe:

za anionsku izmjenu

X-+R+Y- h ->■ Y-+R+X-.

za kationsku izmjenu |

X++ + R-Y+ h=* Y++R-X+.

U prvom slučaju, ion uzorka X~ natječe se s ionom mobilne faze Y~ za ionske centre R+ ionskog izmjenjivača, au drugom slučaju, kationi uzorka X+ natječu se s ionima mobilne faze Y+ za R~ ion centrima.

Naravno, ioni uzorka koji slabo djeluju s ionskim izmjenjivačem će se tijekom ovog natjecanja slabo zadržati na koloni i prvi će biti isprani iz nje, i obrnuto, jače zadržani ioni će posljednji eluirati iz kolone. Obično BTqpH4Hbie interakcije neionske prirode nastaju zbog adsorpcije ili vodikove veze uzorka s neionskim dijelom matrice ili zbog ograničene topljivosti uzorka u mobilnoj fazi. Teško je razlikovati "klasičnu" kromatografiju s ionskom izmjenom u njenom "čistom" obliku, te stoga neki kromatografi polaze od empirijskih, a ne teorijskih obrazaca u kromatografiji ionske izmjene.

Odvajanje specifičnih tvari prvenstveno ovisi o izboru najprikladnijeg sorbenta i mobilne faze. Kao stacionarne faze u ionsko-izmjenjivačkoj kromatografiji koriste se ionsko-izmjenjivačke smole i silika gelovi s cijepljenim ionogenim skupinama.

2.4. KROMATOGRAFIJA VELIČINA

Skluzijska kromatografija je opcija! tekućinska kromatografija, u kojoj se razdvajanje događa zbog raspodjele molekula između otapala unutar pora sorbenta i otapala koje teče " između njegovih čestica.

Za razliku od drugih HPLC opcija, gdje je odvajanje ide zbog različite interakcije komponenti s površinom sorbenta, uloga krutog punila u ekskluzijskoj kromatografiji sastoji se samo u stvaranju pora određene veličine, a stacionarna faza je otapalo koje ispunjava te pore. Stoga je uporaba pojma "sorbent" za ova punila donekle uvjetna.

Osnovna značajka metode je mogućnost odvajanja molekula prema njihovoj veličini u otopini u rasponu gotovo bilo koje molekularne mase - od 10 2 do 10 8 , što je čini nezamjenjivom za proučavanje sintetičkih i biopolimera.

Tradicionalno se proces koji se provodi u organskim otapalima još uvijek često naziva gel permeacijska kromatografija, a u vodenim sustavima gel filtracijska kromatografija. U ovoj knjizi, za obje opcije, usvojen je jedan izraz, koji dolazi od engleskog "Size Exclusion" - iznimka po veličini - i najpotpunije odražava mehanizam procesa.

U monografijama je provedena detaljna analiza postojećih ideja o vrlo složenoj teoriji procesa ekskluzijske kromatografije.

Ukupni volumen otapala u koloni Vt (često se naziva ukupnim volumenom stupca, budući da Vd ne sudjeluje u kromatografskom procesu) je zbroj volumena pokretne i stacionarne faze.

Zadržavanje molekula u okluzivnom stupcu određeno je vjerojatnošću njihove difuzije u pore i ovisi o omjeru veličina molekula i pora, što je shematski prikazano na Sl. 2.15. Koeficijent raspodjele ka, kao i u drugim varijantama kromatografije, to je omjer koncentracija tvari u stacionarnoj i pokretnoj fazi.

Budući da mobilna i stacionarna faza imaju isti sastav, onda kd tvar, kojoj su obje faze jednako dostupne, jednaka je jedinici. Ova situacija se ostvaruje za molekule C najmanjih veličina (uključujući molekule otapala), koje prodiru u sve pore (vidi sliku 2.15) i stoga se najsporije kreću kroz stupac. Njihov zadržani volumen jednak je ukupnom volumenu otapala Vt-

Riža. 2.15. Model odvajanja molekula mjerenjem u ekskluzijskoj kromatografiji

Sve molekule veće od veličine pora sorbenta ne mogu ući u njih (potpuno isključenje) i proći kroz kanale između čestica. One eluiraju iz kolone s istim retencijskim volumenom jednakim volumenu mobilne faze V 0 - Koeficijent raspodjele za ove molekule je nula.

Molekule srednje veličine, sposobne prodrijeti samo u neke pore, zadržavaju se u stupcu prema njihovoj veličini. Koeficijent raspodjele ovih molekula varira od nule do jedan i karakterizira udio volumena pora koji je dostupan za molekule određene veličine.Njihov zadržani volumen određen je zbrojem Y o i dostupnog dijela volumena pora.

KVALITATIVNA ANALIZA

Kromatograf koji počinje raditi u području tekućinske kromatografije visokih performansi trebao bi biti upoznat s osnovama kvalitativne analize. Kvalitativna analiza koristi se za identifikaciju poznatog proizvoda dobivenog na nov način ili pomiješanog s drugim proizvodima. neki medicinski kemijski proizvodi i njihovi metaboliti u bioml.terijalima... „. "Upoznavanje s osnovama kvalitativne" analize pomoći će u izbjegavanju uobičajenih pogreške, na primjer / razlikovati nečistoće u uzorku od nečistoća u otapalu ili provjeriti čistoću tvari na više od jednog spektrofotometra valne duljine, ali na različitim, itd.

Prije nastavka analize potrebno je utvrditi je li cijeli uzorak eluiran iz kolone ovim sustavom otapala ili ne. Kako bi se osiguralo potpuno eluiranje, potrebno je prikupiti svu tekućinu koja teče iz kolone, ispariti otapalo, izvagati ostatak i pronaći oporavak uzorka.

Identifikacija komponenti u HPLC-u može se izvršiti na tri načina: 1) korištenje informacija o zadržavanju; 2) istražiti zone dobivene odvajanjem u koloni tekućinske kromatografa korištenjem metoda spektralne ili kemijske analize; 3) izravno spojiti analizator spektra na kolonu.

Retencijski volumen se koristi za registraciju pikova u kromatografiji V R ili vrijeme zadržavanja t R. Obje vrijednosti su karakteristika tvari u danom kromatografskom sustavu. Budući da se vrijeme zadržavanja tvari koju treba odvojiti sastoji od vremena interakcije u stupcu i vremena prolaska kroz prazne dijelove cijevi, ono se razlikuje od instrumenta do instrumenta. Prikladno je imati tvar koju ovaj stupac ne zadržava, uzimajući je kao standard, čije vrijeme zadržavanja i volumen t 0 , V o. Kromatografija tvari i standarda moraju se provesti pod istim uvjetima (tlak i brzina protoka). U identifikaciji po retencijskim podacima, poznate pojedinačne tvari koje mogu biti prisutne u uzorcima odvajaju se u istom kromatografskom sustavu i za njih se dobivaju vrijednosti. t R. Uspoređujući ove vrijednosti t R s vremenom zadržavanja nepoznatog vrha, može se otkriti da se oni ili podudaraju, u kojem slučaju će vrhovi vjerojatno odgovarati istoj tvari, ili t R poznata tvar ne odgovara t R nepoznata zona. Tada je još moguće procijeniti vrijednosti t R tvari koje nisu dostupne za izravno mjerenje njihovog zadržavanja. Razmotrimo obje opcije.

U prvom slučaju, očito, potrebno je prethodno proučavanje uzorka kako bi se pretpostavilo prisutnost specifičnih tvari u njemu. Pri radu s jednostavnim smjesama lako je odrediti podudara li se stupanj zadržavanja zona uzorka i poznatih tvari ili ne, tj. vrijednosti t B su isti ili različiti. U slučaju složenih smjesa, nekoliko tvari može se eluirati sa sličnim vrijednostima odjednom. t R, a zone stvarno dobivene kromatografskim odvajanjem se preklapaju. Kao rezultat, dobivanje točnih vrijednosti t R za različite zone postaje nemoguće. Pouzdanost identifikacije raste s povećanjem rezolucije, pažljivijom kontrolom uvjeta odvajanja, ponovnim mjerenjem vrijednosti t R i usrednjavanje pronađenih vrijednosti. U tom slučaju treba se izmjenjivati ​​kromatografsko razdvajanje poznatih i nepoznatih tvari. Prilikom odvajanja složenih smjesa, vrijednost t R tvari se mogu mijenjati pod utjecajem matrice samog uzorka. Takav je učinak moguć na početku kromatograma i kada se vrhovi preklapaju; moguće je i zonsko zatezanje, kao što je već spomenuto.

U takvim slučajevima uzorku treba dodati standard u omjeru 1: 1. Ako su tvari identične, vrijednost t R početni materijal se ne mijenja, a na kromatogramu se dobiva samo jedan vrh. Ako postoji uređaj sa sustavom cikličke kromatografije, tada je za pouzdanu identifikaciju poželjno smjesu proći kroz kolonu nekoliko puta.

Podaci o stupnju zadržavanja mogu se pronaći i u literaturi, ali je vrijednost tih podataka ograničena. Budući da stupci čak i jedne serije daju lošu ponovljivost, književne vrijednosti ne odgovaraju uvijek pravoj vrijednosti. t R na ovoj kolumni. Za adsorpcijsku kromatografiju, međutim, moguće je predvidjeti t R na temelju literaturnih podataka. Još jedna poteškoća povezana s korištenjem književnih značenja t R, - poteškoće u pronalaženju u stručnoj literaturi, iako bibliografski pregledi objavljeni u Journal of Chromatography imaju ažurirani indeks vrsta tvari.

U drugom slučaju, kada se vremena zadržavanja poznatih spojeva i zona uzorka ne podudaraju, moguće je predvidjeti vrijeme zadržavanja nepoznate komponente. Predviđanja relativne retencije temeljena na podacima o strukturi u 3D kromatografiji prilično su pouzdana. Manje su točni u adsorpcijskoj, particijskoj kromatografiji, a posebno pri radu na kemijski vezanoj fazi. Za ionsku i ion-parnu kromatografiju tvari s poznatim str Ka moguće su samo približne vrijednosti tR. Uvijek je lakše predvidjeti relativno zadržavanje ili vrijednost *x nego apsolutne vrijednosti. k". Relativne vrijednosti t R lakše procijeniti za srodne spojeve ili derivate, kao što su supstituirane alkil karboksilne kiseline ili derivati ​​benzena.

Kod izokratskog odvajanja homologa ili oligomera, ponekad se opaža sljedeći obrazac:

\ gk" = A + bn,

gdje ALI i NA- konstante za veći broj odabranih uzoraka i za zadani kromatografski sustav (na istoj koloni, s istim pokretnim i stacionarnim fazama); P je broj identičnih strukturnih jedinica u molekuli uzorka.

Uvođenje funkcionalne skupine / u molekulu uzorka dovest će do promjene k" u prvoj jednadžbi nekim konstantnim koeficijentom a/ u danom kromatografskom sustavu. Moguće je dobiti grupne konstante a/ za različite supstituentske skupine /, čije će vrijednosti rasti s povećanjem polariteta funkcionalnih skupina u svim vrstama kromatografije, osim obrnute faze, gdje će se vrijednosti konstanti smanjivati s povećanjem polariteta.

Neke grupne konstante a/ za različite supstituentske skupine / date su u tablici. 9.1.

U adsorpcijskoj kromatografiji prva jednadžba nije uvijek primjenjiva, jer vrijedi pod uvjetom da svi izomeri imaju istu vrijednost k", što se ne slijedi uvijek. Međutim, moguće je nacrtati lgfe" istih spojeva na jednoj koloni naspram lgfe" istih spojeva na drugoj koloni ili naspram odgovarajućih karakteristika u tankoslojnoj kromatografiji, na primjer, lg[(l- RF) IRf].

Kada uspoređujete podatke o zadržavanju, možete koristiti vrijednosti faktora kapacitivnosti k", budući da na njemu, za razliku od t R ne utječu na brzinu pokretne faze i geometrijske značajke stupa.

Odvajanje na kemijski vezanoj fazi slično je razdvajanju particijskom kromatografijom sa sličnim fazama, pa se stoga podaci ekstrakcije u ravnoteži mogu koristiti za predviđanje vremena zadržavanja.

U kromatografiji ionske izmjene na retenciju utječu tri čimbenika: stupanj ionizacije kiselina i baza, naboj ionizirane molekule i sposobnost tvari iz vodene mobilne faze koja se koristi u kromatografiji ionske izmjene da migrira u organsku fazu. . Potonje ovisi o molekularnoj težini spoja i njegovoj hidrofobnosti. Stoga se jače kiseline ili baze jače zadržavaju u separaciji anionske ili kationske izmjene. Uz smanjenje RK a pojedine kiseline uključene u uzorak, zadržavanje se povećava tijekom odvajanja niza kiselina zbog anionske izmjene, a povećanjem p / C o povećava se zadržavanje baza tijekom njihovog odvajanja zbog kationske izmjene.

Dakle, podudarnost vrijednosti vremena zadržavanja poznate tvari s promatranom omogućuje pretpostaviti njihov identitet. Pouzdanost identifikacije se povećava ako se kromatogrami poznate tvari i nepoznate komponente uspoređuju u različitim uvjetima. Ako se tvari u adsorpcijskoj i kromatografiji obrnute faze ili ionskoj izmjeni i kromatografiji s isključenjem veličine ponašaju na isti način, povećava se pouzdanost identifikacije. Ako je pouzdanost identifikacije s jednakim relativnim zadržavanjem 90%, onda kada se proučava ponašanje istih tvari u uvjetima koji se značajno razlikuju, pouzdanost identifikacije je već 99%.

Vrijedna karakteristika tvari koja se koristi u identifikaciji je omjer signala dobivenih za danu tvar na dva različita detektora. Nakon izlaska iz kolone, analit prvo prolazi kroz prvi detektor, zatim kroz drugi, a signali koji dolaze iz detektora bilježe se istovremeno pomoću multi-pen rekordera ili na dva snimača. Obično se koristi serijski spoj ultraljubičastog detektora (osjetljivijeg, ali selektivnog) s refraktometrom, ili ultraljubičastog s fluorescentnim detektorom, ili dva ultraljubičasta detektora koja rade na različitim valnim duljinama. Relativni odziv, tj. omjer signala refraktometra i signala fotometra, karakteristika je tvari, pod uvjetom da oba detektora rade u svom linearnom rasponu; to se provjerava uvođenjem različitih količina iste tvari. Kvalitativne informacije mogu se dobiti radom na fotometrijskim detektorima opremljenim uređajem za zaustavljanje protoka i koji vam omogućuju snimanje spektra vrha koji napušta kolonu dok je u protočnoj ćeliji, uspoređujući ga sa spektrom poznatog spoja.

Značajan interes za identifikaciju su moderni, ali skupi spektrofotometri s nizom dioda.

Potpuno nepoznata tvar ne može se identificirati samo tekućinskom kromatografijom visoke učinkovitosti, potrebne su druge metode.

KVANTITATIVNA ANALIZA

Kvantitativna tekućinska kromatografija je dobro razvijena analitička metoda koja nije inferiorna po točnosti kvantitativnoj plinskoj kromatografiji i značajno premašuje točnost TLC-a ili elektroforeze. Nažalost, u HPLC-u ne postoji detektor koji bi imao sličnu osjetljivost za spojeve različite kemijske strukture ( poput katarometra u Stoga je za dobivanje kvantitativnih rezultata potrebna kalibracija instrumenta.

Kvantitativna analiza sastoji se od sljedećih koraka: 1) kromatografsko odvajanje; 2) mjerenje vršnih površina ili visina; 3) proračun kvantitativnog sastava smjese na temelju kromatografskih podataka; 4) interpretacija dobivenih rezultata, odnosno statistička obrada. Razmotrimo sve ove faze.

4.1. KROMATOGRAFSKO ODJELJAVANJE

Tijekom uzorkovanja mogu se napraviti pogreške. Posebno je važno izbjeći pogreške i uzeti odgovarajući reprezentativni uzorak heterogenih čvrstih uzoraka, hlapljivih ili nestabilnih tvari te poljoprivrednih proizvoda i biomaterijala. Nehomogeni uzorci, kao što su namirnice, temeljito se miješaju i razrežu na četvrtine. Provodeći ovu operaciju uzastopno, postiže se homogenost uzorka.

Pogreške i gubici tvari mogu se dopustiti u fazi ekstrakcije, izolacije, pročišćavanja itd.

Uzorci moraju biti potpuno otopljeni i pripremljene njihove otopine s točnošću od ±0,1%. Uzorak je poželjno otopiti u mobilnoj fazi, što će isključiti mogućnost njegovog taloženja nakon unošenja u kromatograf. Ako otapanje u mobilnoj fazi nije moguće, tada treba upotrijebiti otapalo koje se s njim miješa i u kromatograf ubrizgati volumene uzorka (manje od 25 µl).

Tijekom ubrizgavanja uzorka mogu se pojaviti značajne pogreške zbog frakcioniranja, curenja i vršnog razmazivanja. Razmazivanje vrhova uzrokuje stvaranje repova, što dovodi do djelomičnog preklapanja vrhova i, kao posljedicu, do pogrešaka u detekciji. Uređaji s ventilom s petljom su poželjniji u odnosu na štrcaljke za ubrizgavanje uzorka u kvantitaciji zbog veće točnosti i manje ovisnosti o operateru.

Kod kromatografskog odvajanja tvari mogu nastati i komplikacije koje dovode do izobličenja podataka: kvantitativna analiza. Moguća razgradnja ili transformacija uzorka tijekom kromatografskog procesa ili ireverzibilna adsorpcija tvari na ovoj koloni. Važno je osigurati da te nepoželjne pojave ne postoje i, ako je potrebno, regenerirati stupac ili ga zamijeniti. Preklapanje vrhova i zaostajanje također se mogu smanjiti promjenom uvjeta kromatografije.

Vrhovi koji su lažni ili nejasnog oblika, ili vrhovi čije je vrijeme oslobađanja blizu do, jer možda neće biti dovoljno segregacije. Obično se koriste vrhovi s vrijednošću d" > 0,5. Najveća učinkovitost kolone postiže se uvođenjem 10~5 -10~6 g otopljene tvari po 1 g sorbenta. Prilikom unošenja velikih količina uzorka, ovisnost o visina vrha pri opterećenju može se pokazati nelinearnom i potrebna je kvantitativna procjena prema površini vrha.

Pogreške povezane s detekcijom ili pojačavanjem dovode do značajnog izobličenja rezultata kromatografskog odvajanja. Svaki detektor karakterizira specifičnost, linearnost i osjetljivost. Posebno je važno provjeriti selektivnost u analizi mikronečistoća. Odziv UV detektora može se promijeniti na tvari sa sličnim funkcionalnim skupinama za faktor 104. Potrebno je kalibrirati odziv detektora za svaki analit. Naravno, tvari koje ne apsorbiraju u UV području neće dati signal snimaču kada se koristi kao detektor fotometra. Kada koristite refraktometar, mogu se pojaviti negativni vrhovi. Osim toga, ovaj detektor mora biti termostatiran, što nije potrebno za UV detektor.

Linearnost detektora određuje veličinu ubrizganog uzorka. Mora se imati na umu da brzina protoka kroz kolonu, temperatura kolone i detektora te njegov dizajn utječu na točnost kvantitativne analize. Pogreške u prijenosu električnog signala na izlazni uređaj (snimač), integrator ili računalo mogu nastati zbog podizanja šuma, nedostatka uzemljenja, fluktuacija napona u mreži itd.

4.2. MJERENJE POVRŠINE ILI VISINE VRHOVA

visina vrha h (Sl. 10.1) nazovite udaljenost od vrha vrha do osnovne linije, ona se mjeri linearno ili se broji broj podjela na snimaču. Neki elektronički integratori i računala pružaju informacije o vršnoj visini. Položaj osnovne linije pomaknutih vrhova nalazi se interpolacijom ordinatnih vrijednosti koje odgovaraju početku i kraju vrha (vrh 1 i 3 vidi sl. 10.1). Za poboljšanje točnosti potrebno je imati ravnu, stabilnu osnovnu liniju. U slučaju neodvojenih vrhova, osnovna crta se povlači između početka i kraja vrha i ne zamjenjuje se nultom linijom. Budući da visina vrha manje ovisi o utjecaju susjednih vrhova koji se preklapaju, procjena visine vrha je točnija i gotovo se uvijek koristi u analizi tragova.

Područje vrha može se odrediti na različite načine. Razmotrimo neke od njih.

1. Planimetrijska metoda se sastoji u tome da se vrh prati ručnim planimetrom, koji je uređaj koji mehanički određuje površinu vrha. Metoda je točna, ali naporna i slabo ponovljiva. Ova metoda se ne preporučuje.

2. Metoda siluete papira - vrh se izrezuje i važe. Metoda je dobro reproducibilna, ali naporna, a kromatogram je uništen. Njegova primjenjivost ovisi o homogenosti trake grafikona. Metoda se također ne može široko preporučiti.

4. Metoda triangulacije sastoji se u konstruiranju trokuta povlačenjem tangenti na stranice vrha. Vrh trokuta je viši od vrha vrha. Povećanje površine koju formira ovaj prošireni vrh bit će dosljedno u cijelom kromatogramu i neće previše utjecati na točnost. Osim toga, neka površina izgubljena prilikom crtanja tangenti bit će nadoknađena. Osnovica trokuta određena je presjekom tangenti s baznom linijom, a površina je određena umnoškom 7g osnovice na visinu. Za određivanje područja asimetričnih vrhova ova metoda je najbolja. Međutim, ponovljivost u konstrukciji tangenti od strane različitih operatora je različita i stoga; nisko.

5. Metoda integratora diska temelji se na elektromehaničkom učvršćenju pričvršćenom na snimač. Olovka pričvršćena na integrator pomiče se duž trake na dnu vrpce brzinom proporcionalnom kretanju olovke rekordera.

Kao i kod ručnih mjerenja, vrh bi trebao ostati na ljestvici rekordera, međutim prilagodbe radi kompenzacije pomaka osnovne linije i nepotpunog odvajanja susjednih vrhova smanjuju pouzdanost i povećavaju vrijeme analize.

Metoda je točnija od ručnih metoda mjerenja, osobito s asimetričnim vrhovima, i nudi prednost u brzini. Osim toga, pruža trajni kvantitativni zapis analize.

6. Metode koje koriste elektroničke integratore koji određuju područje vrhova i ispisuju informacije o ovom području i vremenima zadržavanja, mogu uključivati ​​korekciju za pomak osnovne linije i odrediti područje samo djelomično odvojenih vrhova. Glavne prednosti su točnost, brzina, neovisnost djelovanja od rada rekordera. Integratori imaju memoriju i mogu se programirati za određenu analizu korištenjem unaprijed učitanog programa. Prednosti integratora uključuju njegovu sposobnost korištenja korekcijskih faktora za odziv detektora pri ponovnom izračunavanju početnih podataka o površinama vrhova, kompenzirajući razliku u osjetljivosti detektora na različite tvari. Takvi sustavi štede vrijeme, poboljšavaju analitičku točnost i korisni su za rutinsku analitičku analizu.

7. Računala koja mjere vršne površine široko se koriste u tekućinskoj kromatografiji. Oni ispisuju potpunu poruku, uključujući nazive tvari, područja vrhova, vremena zadržavanja, faktore korekcije odziva detektora i sadržaj (u težinskim %) za različite komponente uzorka.

OPĆE FARMAKOPSKO ODOBRENJE

Umjesto čl. GF XI

Tekućinska kromatografija visoke učinkovitosti (visokotlačna tekućinska kromatografija) je metoda kolonske kromatografije u kojoj je mobilna faza tekućina koja se kreće kroz kromatografsku kolonu ispunjenu stacionarnom fazom (sorbentom). Kolone za tekućinsku kromatografiju visoke učinkovitosti karakteriziraju visoki hidraulični otpori na ulazu.

Ovisno o mehanizmu odvajanja tvari, razlikuju se sljedeće varijante tekućinske kromatografije visoke učinkovitosti: adsorpcijska, particijska, ionska izmjena, isključivanje, kiralna itd., u skladu s prirodom glavnih manifestiranih međumolekularnih interakcija. U adsorpcijskoj kromatografiji dolazi do odvajanja tvari zbog njihove različite sposobnosti da se adsorbiraju i desorbiraju s površine sorbenta s razvijenom površinom, na primjer, silika gela. U razdjelnoj tekućinskoj kromatografiji visoke učinkovitosti do odvajanja dolazi zbog razlike u koeficijentima raspodjele tvari koje se odvajaju između stacionarne (u pravilu kemijski cijepljene na površinu stacionarnog nosača) i mobilne faze.

Ovisno o vrsti pokretne i stacionarne faze, razlikuje se kromatografija normalne faze i kromatografija obrnute faze. U tekućinskoj kromatografiji visoke učinkovitosti normalne faze stacionarna faza je polarna (najčešće silika gel ili silika gel s cijepljenim NH 2 - ili CN skupinama itd.), a mobilna faza je nepolarna (heksan ili mješavine heksan s polarnijim organskim otapalima – kloroformom, alkoholima itd.). Zadržavanje tvari povećava se s povećanjem polariteta. U kromatografiji normalne faze, eluirajuća moć mobilne faze raste s povećanjem polariteta.

U kromatografiji reverzne faze stacionarna faza je nepolarna (hidrofobni silika gelovi s cijepljenim skupinama C4, C8, C18 itd.); mobilna faza je polarna (mješavine vode i polarnih otapala: acetonitril, metanol, tetrahidrofuran itd.). Zadržavanje tvari raste s povećanjem njihove hidrofobnosti (nepolarnost). Što je veći sadržaj organskog otapala, to je veća moć eluiranja mobilne faze.

U ionsko-izmjenjivačkoj kromatografiji, molekule smjese tvari, disocirane u otopini na katione i anione, odvajaju se pri kretanju kroz sorbent (kationski izmjenjivač ili anionski izmjenjivač) zbog različitih sila interakcije između iona koji se određuju i ionskog izmjenjivača. skupine sorbenta.

U kromatografiji s isključivanjem veličine (sito, gel-penetrirajuća, gel-filtracijska) kromatografija molekule tvari se razdvajaju po veličini zbog njihove različite sposobnosti prodiranja u pore stacionarne faze. U ovom slučaju, najveće molekule koje mogu prodrijeti u minimalni broj pora stacionarne faze prve napuštaju stupac, a tvari male molekularne veličine posljednje napuštaju.

U kiralnoj kromatografiji optički aktivni spojevi se razdvajaju na pojedinačne enantiomere. Odvajanje se može provesti na kiralnim stacionarnim fazama ili na akiralnim stacionarnim fazama korištenjem kiralnih mobilnih faza.

Postoje i druge mogućnosti za tekućinsku kromatografiju visoke učinkovitosti.

često se razdvajanje odvija ne jednim, već nekoliko mehanizama istovremeno, ovisno o vrsti pokretne i stacionarne faze, kao i o prirodi spoja koji se utvrđuje.

Područje primjene

Tekućinska kromatografija visoke učinkovitosti uspješno se koristi i za kvalitativnu i za kvantitativnu analizu lijekova u testovima "Identitet", "Strane nečistoće", "Otapanje", "Ujednačenost doziranja", "Kvantitativno određivanje". Treba napomenuti da kromatografija omogućuje kombiniranje nekoliko testova u jednom uzorku, uključujući "Identitet" i "Kvantitativno određivanje".

Oprema

Za analizu se koriste odgovarajući instrumenti – tekući kromatografi.

Sastav tekućeg kromatografa obično uključuje sljedeće glavne komponente:

- jedinica za pripremu mobilne faze, uključujući spremnik s mobilnom fazom (ili posude s pojedinačnim otapalima koja su dio mobilne faze) i sustav za otplinjavanje mobilne faze;

— crpni sustav;

– mješalica mobilne faze (ako je potrebno);

– sustav za ubrizgavanje uzorka (injektor), može biti ručni ili automatski (autosampler);

— kromatografski stupac (može se ugraditi u termostat);

— detektor (jedan ili više s različitim metodama detekcije);

— sustav upravljanja kromatografom, prikupljanje i obrada podataka.

Osim toga, kromatograf može uključivati: sustav za pripremu uzorka i reaktor za predkolone, sustav za prebacivanje stupca, reaktor nakon kolone i drugu opremu.

Sustav za pumpanje

Crpke opskrbljuju mobilnu fazu koloni unaprijed određenom brzinom. Sastav mobilne faze i brzina protoka mogu biti konstantni ili se mijenjati tijekom analize. U slučaju konstantnog sastava mobilne faze, proces se naziva izokratskim, au drugom - gradijentom. Suvremeni crpni sustav tekućinske kromatografije sastoji se od jedne ili više kompjuterski upravljanih pumpi. To vam omogućuje promjenu sastava mobilne faze prema specifičnom programu tijekom gradijentnog eluiranja. Analitičke pumpe za tekućinsku kromatografiju visokih performansi omogućuju održavanje brzine protoka mobilne faze u koloni u rasponu od 0,1 do 10 ml/min pri ulaznom tlaku u koloni do 40 MPa. Pulsacije tlaka su minimalizirane posebnim prigušnim sustavima uključenim u dizajn crpki. Radni dijelovi crpki izrađeni su od materijala otpornih na koroziju, što omogućuje korištenje agresivnih komponenti u sastavu mobilne faze.

Slavine

U mješalici se od pojedinačnih otapala dostavljenih pumpama formira jedna mobilna faza, ako potrebna smjesa nije unaprijed pripremljena. Miješanje komponenti mobilne faze u mješalici može se odvijati i pri niskom tlaku (prije pumpi) i pri visokom tlaku (nakon pumpi). Mješalica se može koristiti za pripremu mobilne faze i izokratsko eluiranje.

Volumen mješalice može utjecati na vrijeme zadržavanja komponenti u gradijentnom eluiranju.

Injektori

Injektori mogu biti univerzalni, s mogućnošću promjene volumena ubrizganog uzorka, ili diskretni za unošenje uzorka samo određenog volumena. Obje vrste injektora mogu biti automatske ("auto-injektori" ili "auto-sampleri"). Injektor uzorka (otopina) nalazi se neposredno ispred kromatografske kolone. Dizajn injektora omogućuje promjenu smjera protoka mobilne faze i prethodno uvođenje uzorka u dozirnu petlju određenog volumena (obično od 10 do 100 μl) ili u poseban uređaj za doziranje promjenjivog volumena. Volumen petlje je naznačen na njegovoj oznaci. Dizajn diskretnog injektora, u pravilu, omogućuje zamjenu petlje. Suvremeni automatski injektori mogu imati niz dodatnih funkcija, na primjer, mogu poslužiti kao stanica za pripremu uzoraka: miješanje i razrjeđivanje uzoraka, te izvođenje reakcije derivatizacije prije kolone.

Kromatografska kolona

Kromatografske kolone su obično cijevi od nehrđajućeg čelika, stakla ili plastike napunjene sorbentom i zatvorene s obje strane filterima s promjerom pora od 2-5 µm. Duljina analitičke kolone može biti u rasponu od 5 do 60 cm ili više, unutarnji promjer je od 2 do 10 mm. U mikrokolumnoj kromatografiji koriste se kolone s unutarnjim promjerom manjim od 2 mm. Postoje i kapilarni stupovi s unutarnjim promjerom od oko 0,3-0,7 mm. Kolone za preparativnu kromatografiju mogu imati unutarnji promjer od 50 mm ili više.

Prije analitičke kolone mogu se ugraditi kratke kolone (predkolone) koje obavljaju različite pomoćne funkcije od kojih je glavna zaštita analitičke kolone. Obično se analiza provodi na sobnoj temperaturi, međutim, kako bi se povećala učinkovitost odvajanja i smanjilo trajanje analize, može se koristiti termostatiranje kolona na temperaturama do 80-100 °C. Mogućnost korištenja povišene temperature tijekom odvajanja ograničena je stabilnošću stacionarne faze, budući da je njezino uništavanje moguće pri povišenim temperaturama.

Stacionarna faza (sorbent)

Uobičajeni sorbenti su:

• silika gel, aluminij, koriste se u kromatografiji normalne faze. Mehanizam zadržavanja u ovom slučaju obično je adsorpcija;
• silika gel, smole ili polimeri s cijepljenim kiselim ili bazičnim skupinama. Opseg - ion-izmjenjivačka i ionska kromatografija;
• silika gel ili polimeri s danom raspodjelom veličine pora (kromatografija isključenja veličine);
• kemijski modificirani sorbenti (bonded phase sorbenti), najčešće pripremljeni na bazi silikagela. Mehanizam zadržavanja je adsorpcija ili distribucija između mobilne i stacionarne faze. Opseg ovisi o vrsti cijepljenih funkcionalnih skupina. Neke vrste sorbenata mogu se koristiti i u kromatografiji obrnute i normalne faze;
• kemijski modificirani kiralni sorbenti, na primjer, derivati ​​celuloze i amiloze, proteini i peptidi, ciklodekstrini, kitozani koji se koriste za odvajanje enantiomera (kiralna kromatografija).

Sorbenti vezane faze mogu imati različite stupnjeve kemijske modifikacije. Najčešće korištene vezane faze su:

– oktadecil skupine (sorbent oktadecilsilan (ODS) ili C 18);

– oktilne skupine (sorbent oktilsilan ili C 8);

– fenilne skupine (fenilsilan sorbent);

– cijanopropilne skupine (CN sorbent);

– aminopropilne skupine (NH 2 sorbent);

– diolne skupine (sorbent diol).

Najčešće se analiza provodi na nepolarnim vezanim fazama u reverznom faznom načinu pomoću C 18 sorbenta.

Sorbenti vezane faze na bazi silika gela su kemijski stabilni pri pH vrijednostima od 2,0 do 7,0, osim ako proizvođač nije drugačije odredio. Čestice sorbenta mogu imati sferni ili nepravilni oblik i raznoliku poroznost. Veličina čestica sorbenta u analitičkoj tekućinskoj kromatografiji visoke učinkovitosti obično je 3-10 µm, u preparativnoj visokoučinkovitoj tekućinskoj kromatografiji 50 µm ili više. Postoje i monolitni stupovi u kojima je sorbent monolit s prolaznim porama koji ispunjava cijeli volumen kolone.

Visoku učinkovitost odvajanja osigurava velika površina čestica sorbenta (što je posljedica njihove mikroskopske veličine i prisutnosti pora), kao i ujednačenost sastava sorbenta i njegovo gusto i jednolično pakiranje.

Detektori

U tekućinskoj kromatografiji visoke učinkovitosti koriste se različite metode detekcije. U općem slučaju mobilna faza s otopljenim komponentama nakon kromatografske kolone ulazi u detektorsku ćeliju, gdje se kontinuirano mjere jedno ili drugo njezino svojstvo (apsorpcija u ultraljubičastom ili vidljivom području spektra, fluorescencija, lom indeks, električna vodljivost itd.). Rezultirajući kromatogram je graf ovisnosti nekog fizičkog ili fizikalno-kemijskog parametra mobilne faze o vremenu.

Najčešći detektori u tekućinskoj kromatografiji visoke učinkovitosti su spektrofotometrijski. Tijekom eluiranja tvari u posebno dizajniranoj mikroćeliji, optička gustoća eluata se mjeri na unaprijed odabranoj valnoj duljini. Širok raspon linearnosti detektora omogućuje analizu i nečistoća i glavnih komponenti smjese na jednom kromatogramu. Spektrofotometrijski detektor omogućuje detekciju na bilo kojoj valnoj duljini unutar svog radnog raspona (obično 190-600 nm). Koriste se i viševalni detektori koji omogućuju detekciju na nekoliko valnih duljina istovremeno i detektori diodnog niza koji omogućuju istovremeno snimanje optičke gustoće u cijelom radnom rasponu valnih duljina (obično 190–950 nm). To omogućuje snimanje spektra apsorpcije komponenti koje prolaze kroz detektorsku stanicu.

Fluorimetrijski detektor se koristi za detekciju fluorescentnih spojeva ili nefluorescentnih spojeva u obliku njihovih fluorescentnih derivata. Princip rada fluorimetrijskog detektora temelji se na mjerenju fluorescentne emisije apsorbirane svjetlosti. Apsorpcija se obično provodi u ultraljubičastom području spektra, valne duljine fluorescentnog zračenja premašuju valne duljine apsorbirane svjetlosti. Fluorometrijski detektori imaju vrlo visoku osjetljivost i selektivnost. Osjetljivost fluorescentnih detektora je približno 1000 puta veća od one spektrofotometrijskih. Suvremeni fluorescentni detektori omogućuju ne samo dobivanje kromatograma, već i snimanje spektra ekscitacije i fluorescencije analiziranih spojeva.

Za određivanje spojeva koji slabo apsorbiraju u ultraljubičastim i vidljivim područjima spektra (na primjer, ugljikohidrati), upotrijebite refraktometrijski detektori (refraktometri). Nedostaci ovih detektora su niska (u usporedbi sa spektrofotometrijskim detektorima) osjetljivost i značajna temperaturna ovisnost intenziteta signala (detektor mora biti termostatiran), kao i nemogućnost korištenja u načinu gradijentnog eluiranja.

Princip rada evaporativni detektori laserskog raspršivanja svjetla temelji se na razlici tlakova pare kromatografskih otapala koja čine mobilnu fazu i analiziranih tvari. Mobilna faza na izlazu iz kolone uvodi se u raspršivač, miješa se s dušikom ili CO 2 i u obliku fino raspršenog aerosola ulazi u zagrijanu cijev isparivača s temperaturom od 30-160 °C, u kojoj se mobilna faza isparava. Aerosol nehlapljivih čestica analiziranih tvari raspršuje svjetlosni tok u disperzijskoj komori. Po stupnju disperzije svjetlosnog toka može se suditi o količini određenog spoja. Detektor je osjetljiviji od refraktometrijskog, njegov signal ne ovisi o optičkim svojstvima uzorka, o vrsti funkcionalnih skupina u analitima, o sastavu mobilne faze i može se koristiti u načinu gradijentnog eluiranja. .

Elektrokemijski detektori (konduktometrijski, amperometrijski, kulometrijski itd.). Amperometrijski detektor koristi se za detekciju elektroaktivnih spojeva koji se mogu oksidirati ili reducirati na površini čvrste elektrode. Analitički signal je veličina struje oksidacije ili redukcije. Detektorska ćelija ima najmanje dvije elektrode - radnu elektrodu i referentnu elektrodu (srebrni klorid ili čelik). Na elektrode se primjenjuje radni potencijal čija vrijednost ovisi o prirodi spojeva koji se određuju. Mjerenja se mogu provoditi i pri konstantnom potencijalu i u impulsnom načinu, kada se profil promjene potencijala radne elektrode postavlja tijekom jednog ciklusa snimanja signala. Amperometrijski detektor koristi radne elektrode izrađene od ugljičnih materijala (najčešće staklastog ugljika ili grafita), te metala: platine, zlata, bakra, nikla.

Konduktometrijski detektor koristi se za detekciju aniona i kationa u ionskoj kromatografiji. Princip njegova rada temelji se na mjerenju električne vodljivosti mobilne faze tijekom eluiranja tvari.

Iznimno informativan je maseni spektrometrijski detektor visoke osjetljivosti i selektivnosti. Najnoviji modeli masenih spektrometara za tekućinsku kromatografiju rade u rasponu mase m/z od 20 do 4000 amu.

Tekućinska kromatografija visokih performansi također koristi Fourier-IR detektore, radioaktivnost i neke druge.

Sustav prikupljanja i obrade podataka

Suvremeni sustav za obradu podataka osobno je računalo povezano s kromatografom s instaliranim softverom koji vam omogućuje registraciju i obradu kromatograma, kao i kontrolu rada kromatografa i praćenje glavnih parametara kromatografskog sustava.

mobilna faza

Mobilna faza u tekućinskoj kromatografiji visoke učinkovitosti ima dvojaku funkciju: osigurava prijenos desorbiranih molekula duž kolone i regulira konstante ravnoteže, a posljedično i zadržavanje kao rezultat interakcije sa stacionarnom fazom (ssorbira se na površini). ) i s molekulama tvari koje se odvajaju. Dakle, promjenom sastava mobilne faze u tekućinskoj kromatografiji visoke učinkovitosti može se utjecati na vrijeme zadržavanja spojeva, selektivnost i učinkovitost njihovog odvajanja.

Mobilna faza može se sastojati od jednog otapala, često dva, ako je potrebno, tri ili više. Sastav mobilne faze je naznačen kao volumni omjer njezinih sastavnih otapala. U nekim slučajevima može biti naznačen omjer mase, što je potrebno posebno navesti. Kao komponente mobilne faze mogu se koristiti puferske otopine određene pH vrijednosti, razne soli, kiseline i baze te drugi modifikatori.

Normalna fazna kromatografija obično koristi tekuće ugljikovodike (heksan, cikloheksan, heptan) i druga relativno nepolarna otapala s malim dodacima polarnih organskih spojeva koji kontroliraju snagu eluiranja mobilne faze.

U kromatografiji reverzne faze, voda ili vodeno-organske smjese koriste se kao mobilna faza. Organski aditivi su obično polarna organska otapala (acetonitril i metanol). Za optimizaciju odvajanja mogu se koristiti vodene otopine određene pH vrijednosti, posebno puferske otopine, kao i različiti dodaci pokretnoj fazi: fosforna i octena kiselina u odvajanju kiselih spojeva; amonijak i alifatski amini u odvajanju bazičnih spojeva i drugi modifikatori.

Čistoća pokretne faze uvelike utječe na kromatografsku analizu, pa je poželjno koristiti otapala koja su puštena posebno za tekućinsku kromatografiju (uključujući vodu).

Kada se koristi UV spektrofotometrijski detektor, mobilna faza ne bi trebala imati izraženu apsorpciju na valnoj duljini odabranoj za detekciju. Granica prozirnosti ili optičke gustoće na određenoj valnoj duljini otapala određenog proizvođača često je naznačena na pakiranju.

Mobilna faza i analizirane otopine moraju biti bez neotopljenih čestica i mjehurića plina. Voda dobivena u laboratorijskim uvjetima, vodene otopine, organska otapala prethodno pomiješana s vodom, kao i analizirane otopine moraju se podvrgnuti finoj filtraciji i otplinjavanju. U te svrhe obično se koristi vakuumska filtracija kroz membranski filter veličine pora od 0,45 μm, koji je inertan u odnosu na dano otapalo ili otopinu.

Popis kromatografskih uvjeta koje treba navesti

Monografija treba sadržavati: puni komercijalni naziv kolone, s naznakom proizvođača i kataloški broj, dimenzije stupca (dužina i unutarnji promjer), vrstu sorbenta, navodeći veličinu čestica, veličinu pora, temperaturu kolone (ako je potrebna kontrola temperature) , volumen ubrizganog uzorka (volumenske petlje), sastav mobilne faze i način njezine pripreme, brzina dodavanja mobilne faze, tip detektora i uvjeti detekcije (ako je potrebno, parametri korištene detektorske ćelije), opis načina gradijenta (ako je korišteni), uključujući fazu ponovne ekvilibracije u početne uvjete, vrijeme kromatografije, detaljan opis metodologije i proračunskih formula, opise pripreme standardnih i ispitnih otopina.

Ako se u autosampleru koristi derivatizacija prije stupca, daju se informacije o programu za automatsko uzorkovanje. U slučaju korištenja derivatizacije nakon kolone, naznačena je brzina dodavanja reagensa za derivatizaciju, volumen petlje za miješanje i njena temperatura.

Modificirana tekućinska kromatografija visokih performansi

Ionska parna kromatografija

Jedna od varijanti tekućinske kromatografije visoke učinkovitosti reverzne faze je kromatografija ionskog para - koja vam omogućuje određivanje ioniziranih spojeva. Da bi se to postiglo, hidrofobni organski spojevi s ionogenim skupinama (reagensi ionskog para) dodaju se tradicionalnoj tekućinskoj kromatografiji visoke učinkovitosti reverzne faze mobilne faze. Natrijevi alkil sulfati se obično koriste za odvajanje baza; tetraalkilamonijeve soli (tetrabutilamonijev fosfat, cetiltrimetilamonijev bromid, itd.) koriste se za odvajanje kiselina. U načinu ionskog para, selektivnost razdvajanja neionskih komponenti bit će ograničena mehanizmom zadržavanja obrnute faze, dok se zadržavanje baza i kiselina značajno povećava, dok se oblik kromatografskih vrhova poboljšava.

Zadržavanje u režimu ionskog para posljedica je prilično složenih procesa ravnoteže koji se međusobno natječu. S jedne strane, zbog hidrofobnih interakcija i efekta pomaka polarnog medija mobilne faze, moguća je sorpcija hidrofobnih iona na površini alkil silikagela na način da nabijene skupine budu okrenute prema mobilnoj fazi. U tom slučaju površina poprima svojstva ionske izmjene, a zadržavanje se pokorava zakonima ionsko-izmjenjivačke kromatografije. S druge strane, moguće je formiranje ionskog para izravno u volumenu eluensa, nakon čega slijedi njegova sorpcija na sorbentu mehanizmom obrnute faze.

Hidrofilna interakcijska kromatografija ( HILIĆ kromatografija)

Hidrofilna interakcijska kromatografija koristi se za odvajanje polarnih spojeva koji se slabo zadržavaju u tekućinskoj kromatografiji visoke učinkovitosti reverzne faze. Kao mobilna faza u ovoj varijanti kromatografije koriste se mješavine vode i acetonitrila s dodatkom soli, kiselina ili baza. Stacionarne faze, u pravilu, su silika gelovi modificirani polarnim skupinama (amino, diol, cijanopropil skupine itd.). Polarniji spojevi se drže jačim. Snaga eluiranja mobilne faze raste s povećanjem polariteta.

Ionska izmjena i ionska visokoučinkovita tekućinska kromatografija

Ionska izmjenjivačka kromatografija koristi se za analizu i organskih (heterocikličke baze, aminokiseline, proteini itd.) i anorganskih (razni kationi i anioni) spojeva. Odvajanje komponenti analizirane smjese u ionsko-izmjenjivačkoj kromatografiji temelji se na reverzibilnoj interakciji iona analiziranih tvari s ionsko-izmjenjivačkim skupinama sorbenta. Ovi sorbenti su uglavnom ili polimerne smole za ionsku izmjenu (obično kopolimeri stirena i divinilbenzena s cijepljenim ionizmjenjivačkim skupinama) ili silika gelovi s cijepljenim skupinama za ionsku izmjenu. Za odvajanje aniona (anionski izmjenjivači) koriste se sorbenti sa skupinama: -NH 3 +, -R 3 N +, -R 2 HN +, -RH 2 N + i dr., a sorbenti sa skupinama: -SO 3 -, - RSO 3 -, -COOH, -PO 3 - i drugi za odvajanje kationa (kationski izmjenjivači).

Kao mobilna faza u ionsko-izmjenjivačkoj kromatografiji koriste se vodene otopine kiselina, baza i soli. Obično se puferske otopine koriste za održavanje određenih pH vrijednosti. Također je moguće koristiti male dodatke organskih otapala koja se miješaju s vodom - acetonitril, metanol, etanol, tetrahidrofuran.

Ionska kromatografija - varijanta ionsko-izmjenjivačke kromatografije, u kojoj se konduktometrijski detektor koristi za detekciju analita (iona). Za visoko osjetljivo određivanje promjena u vodljivosti mobilne faze koja prolazi kroz detektor, pozadinska vodljivost mobilne faze mora biti niska.

Postoje dvije glavne varijante ionske kromatografije.

Prva od njih, ionska kromatografija s dvije kolone, temelji se na supresiji električne vodljivosti elektrolita mobilne faze pomoću druge kolone za ionsku izmjenu ili posebnog membranskog supresijskog sustava koji se nalazi između analitičke kolone i detektora. Prilikom prolaska kroz sustav smanjuje se električna vodljivost mobilne faze.

Druga varijanta ionske kromatografije je ionska kromatografija na jednoj koloni. Ova varijanta koristi mobilnu fazu s vrlo niskom električnom vodljivošću. Kao elektroliti naširoko se koriste slabe organske kiseline: benzojeva, salicilna ili izoftalna.

Tekuća kromatografija visoke učinkovitosti bez veličine

Kromatografija isključenja veličine (gel kromatografija) posebna je verzija tekućinske kromatografije visoke učinkovitosti koja se temelji na razdvajanju molekula prema njihovoj veličini. Raspodjela molekula između stacionarne i pokretne faze temelji se na veličini molekula i dijelom na njihovom obliku i polaritetu.

Moguća su dva ograničavajuća tipa interakcije molekula s poroznom stacionarnom fazom. Molekule veće od maksimalnog promjera pora uopće se ne zadržavaju i prvo se eluiraju, krećući se zajedno s mobilnom fazom. Molekule s veličinama manjim od minimalnog promjera pora sorbenta slobodno prodiru u pore i posljednje se eluiraju iz kolone. Preostale molekule, koje imaju srednje veličine, djelomično se zadržavaju u porama i tijekom eluiranja se razdvajaju na frakcije u skladu sa svojom veličinom i, djelomično, oblikom, prodiru u pore sorbenta, ovisno o veličini i djelomično , ovisno o njihovom obliku. Kao rezultat toga, tvari se eluiraju s različitim vremenima zadržavanja.

Ionska ekskluzijska kromatografija

Mehanizam ionske ekskluzijske kromatografije temelji se na učinku, uslijed kojeg se spojevi u ioniziranom obliku ne zadržavaju na ionsko izmjenjivačkom sorbentu, dok se spojevi u molekularnom obliku raspoređuju između stacionarne i vodene faze unutar pora. sorbenta za ionsku izmjenu i pokretne faze koja migrira u prostoru između čestica sorbenta. Razdvajanje se temelji na elektrostatičkom odbijanju, polarnim i hidrofobnim interakcijama između otopljenih spojeva i sorbenta.

Anionske skupine na površini sorbenta djeluju kao polupropusna "membrana" između stacionarne i mobilne faze. Negativno nabijene komponente ne dospijevaju u stacionarnu mobilnu fazu, jer se odbijaju od slično nabijenih funkcionalnih skupina i eluiraju u "mrtvom" (slobodnom) volumenu kolone. Komponente u molekularnom obliku ne "odbacuju" sorbent za kationsku izmjenu i raspoređuju se između stacionarne i mobilne faze. Razlika u stupnju zadržavanja neionskih komponenti smjese diktira kombinacija polarnih interakcija neionskih komponenti s funkcionalnim skupinama sorbenta za kationsku izmjenu i hidrofobnih interakcija neionskih komponenti s neionskim komponentama. -polarna sorbentna matrica.

Kiralna kromatografija

Cilj kiralne kromatografije je odvajanje optičkih izomera. Odvajanje se provodi na kiralnim stacionarnim fazama ili na konvencionalnim akiralnim stacionarnim fazama korištenjem kiralnih mobilnih faza. Kao kiralne stacionarne faze koriste se sorbenti s modificiranom površinom, skupinama ili tvarima s kiralnim središtima (hitozani, ciklodekstrini, polisaharidi, proteini itd. (kiralni selektori). U ovom slučaju se kao mobilne faze mogu koristiti iste faze kao u kromatografija normalne faze ili kromatografije obrnute faze. Kada se koriste akiralne stacionarne faze kako bi se osiguralo odvajanje enantiomera, mobilnim fazama se dodaju kiralni modifikatori: kiralni metalni kompleksi, neutralni kiralni ligandi, kiralni reagensi ionskog para itd.

Ultraučinkovita tekućinska kromatografija

Tekućinska kromatografija ultra učinkovite varijante je tekućinske kromatografije koja je učinkovitija od klasične tekućinske kromatografije visokih performansi.

Značajka tekućinske kromatografije ultra učinkovite je uporaba sorbenata s veličinom čestica od 1,5 do 2 µm. Kromatografske kolone su tipično duge 50 do 150 mm i promjera 1 do 4 mm. Volumen ubrizganog uzorka može biti od 1 do 50 µl. Korištenje takvih kromatografskih kolona može značajno smanjiti vrijeme analize i poboljšati učinkovitost kromatografskog odvajanja. Međutim, u ovom slučaju, tlak na koloni može doseći 80-120 MPa, potrebna frekvencija prikupljanja podataka detektora može se povećati do 40-100 Hz, a volumen izvan kolone kromatografskog sustava mora biti minimiziran. Oprema za kromatografiju i kolone koje se koriste u tekućinskoj kromatografiji ultra učinkovite posebno su prilagođene zahtjevima ove vrste kromatografije.

Oprema dizajnirana za ultraučinkovitu tekućinsku kromatografiju također se može koristiti u klasičnoj tekućinskoj kromatografiji visokih performansi.

(uglavnom intermolekularne) na sučelju. Kao metoda analize, HPLC je dio skupine metoda, koja zbog složenosti proučavanih objekata uključuje prethodno razdvajanje početne složene smjese na relativno jednostavne. Dobivene jednostavne smjese zatim se analiziraju uobičajenim fizikalno-kemijskim metodama ili posebnim metodama razvijenim za kromatografiju.

HPLC metoda ima široku primjenu u područjima kao što su kemija, petrokemija, biologija, biotehnologija, medicina, prerada hrane, zaštita okoliša, proizvodnja lijekova i mnogim drugim.

Prema mehanizmu odvajanja analiziranih ili izdvojenih tvari, HPLC se dijeli na adsorpcijsku, distribucijsku, ionsko-izmjenjivačku, ekskluzijsku, ligand-izmjenjivačku i druge.

Treba imati na umu da se u praktičnom radu razdvajanje često odvija ne jednim, već nekoliko mehanizama istovremeno. Dakle, odvajanje isključenja može biti komplicirano adsorpcijskim učincima, adsorpcijom – distribucijom i obrnuto. Istodobno, što je veća razlika u tvarima u uzorku u pogledu stupnja ionizacije, bazičnosti ili kiselosti, u smislu molekularne mase, polarizabilnosti i drugih parametara, to je vjerojatnije da će drugačiji mehanizam razdvajanja pojavljuju za takve tvari.

HPLC normalne faze

Stacionarna faza je polarnija od mobilne faze, pa u sastavu eluensa prevladava nepolarno otapalo:

• Heksan:izopropanol = 95:5 (za niskopolarne tvari)
• Kloroform:metanol = 95:5 (za srednje polarne tvari)
• Kloroform:metanol = 80:20 (za visoko polarne tvari)

HPLC reverzne faze

Stacionarna faza je manje polarna od mobilne faze, tako da je voda gotovo uvijek prisutna u eluensu. U ovom slučaju uvijek je moguće osigurati potpuno otapanje BAS-a u mobilnoj fazi, gotovo uvijek je moguće koristiti UV detekciju, gotovo sve mobilne faze se međusobno miješaju, može se koristiti gradijentno eluiranje, kolona se može brzo ponovno -uravnotežen, stupac se može regenerirati.

Uobičajeni eluensi za HPLC reverzne faze su:

• Acetonitril: voda
• metanol: voda
• Izopropanol: voda

Matrice za HPLC

Matrice koje se koriste u HPLC-u su anorganski spojevi kao što je silika gel (silika gel) ili aluminij, ili organski polimeri kao što je polistiren (poprečno povezan s divinilbenzenom) ili polimetakrilat. Silika gel je, naravno, sada općeprihvaćen.

Glavne karakteristike matrice:

• Veličina čestica (µm);
• Unutarnja veličina pora (Å, nm).

Dobivanje silika gela za HPLC:

1. Formiranje mikrosfera polisilicijeve kiseline;
2. Sušenje čestica silikagela;
3. Odvajanje zraka.

Sorbentne čestice:

• Regularni (sferični): veća otpornost na pritisak, veći trošak;
• Nesferični: niži otpor na pritisak.

Veličina pora u HPLC-u jedan je od najvažnijih parametara. Što je veličina pora manja, to je lošija njihova propusnost za molekule eluiranih tvari. I posljedično, lošiji je sorpcijski kapacitet sorbenata. Što su pore veće, to je, prvo, manja mehanička stabilnost čestica sorbenta, a drugo, manja je površina sorpcije, stoga je učinkovitost lošija.

Graftovi stacionarne faze

HPLC normalne faze:

• Stacionarna faza cijepljena propilnitrilom (nitrilom);
• Stacionarna faza s cijepljenjem propilamina (amin).

HPLC reverzne faze:

• Stacionarna faza s alkilnim cijepljenjem;
• Stacionarna faza s alkilsilil graftom.

End-capping - zaštita necijepljenih područja sorbenta dodatnim cijepljenjem s "malim" molekulama. Hidrofobno zatvaranje na kraju (C1, C2): veća selektivnost, lošija sposobnost vlaženja; hidrofilno zatvaranje (diol): niža selektivnost, veća sposobnost vlaženja.

HPLC detektori

• UV
• diodni niz
• Fluorescentno
• Elektrokemijski
• Refraktometrijski
• masovno selektivno

Linkovi

Zaklada Wikimedia. 2010 .

Pogledajte što je "High Performance Liquid Chromatography" u drugim rječnicima:

tekuća kromatografija visokog učinka- - [A.S. Goldberg. Engleski ruski energetski rječnik. 2006] Teme energija općenito EN tekućinska kromatografija visoke učinkovitostiHPLC … Priručnik tehničkog prevoditelja

Pojam tekućinska kromatografija visoke učinkovitosti Engleski izraz tekućinska kromatografija visoke učinkovitosti Sinonimi Skraćenice HPLC, HPLC Povezani pojmovi adsorpcija, oligopeptid, proteomika, sorbent, fuleren, endohedral, kromatografija… …

Tekućom kromatografijom, kako bi se povećala učinkovitost odvajanja, otapalo (eluens) pod tlakom (više od 3x107 Pa) pumpa se kroz kolone napunjene sorbentom s česticama malog promjera (do 1 μm) i perfuzijom ... ...

Vrsta kromatografije u kojoj tekućina (eluent) služi kao mobilna faza, a ona je stacionarna faza. sorbent, tv. nosač s tekućinom ili gelom nanesenim na njegovu površinu. Izvodi se u koloni ispunjenoj sorbentom (kolona kromatografija), na ravnom ... ... Prirodna znanost. enciklopedijski rječnik

- [κρώμα (υroma) boja] proces koji se temelji na nejednakoj sposobnosti pojedinačnih komponenti smjese (tekućih ili plinovitih) da se zadrže na površini adsorbenta i kada se apsorbiraju iz struje nosača i kada .. .... Geološka enciklopedija

- (s drugog grčkog ... Wikipedia

Pojam kromatografija engleski izraz kromatografija Sinonimi Skraćenice Povezani pojmovi tekućinska kromatografija visoke učinkovitosti, klatrat, laboratorij na čipu, porozimetrija, proteom, proteomika, sorbent, enzim, fuleren, endohedral… … Enciklopedijski rječnik nanotehnologije

Tekuća kromatografija na temelju razg. sposobnost odvojenih iona za ionsku izmjenu s fiksnim. ioni sorbenta nastali kao rezultat disocijacije ionogenih skupina potonjih. Kationski izmjenjivači se koriste za odvajanje kationa, za ... ... Kemijska enciklopedija

HPLC- tekuća kromatografija visokog učinka ... Rječnik skraćenica ruskog jezika

Tekućinska kromatografija visoke učinkovitosti (HPLC) jedna je od učinkovitih metoda za odvajanje složenih smjesa tvari, koja se široko koristi kako u analitičkoj kemiji tako i u kemijskoj tehnologiji. Temelj kromatografskog odvajanja je sudjelovanje ... Wikipedia

knjige

• Praktična tekućinska kromatografija visokih performansi, Veronica R. Mayer. Čitatelju predstavljamo 5. izdanje knjige, koje je prošireno suvremenim metodama i opremom. U knjizi je mnogo toga poboljšano i dodan je veliki broj referenci. Mjesta u tekstu na kojima...