uparuje druge. Te promjene prate svaki ciklus replikacije DNK, ali njihova je učestalost mnogo manja nego što bi trebala biti. To se objašnjava činjenicom da se većina promjena ove vrste eliminira djelovanjem mehanizma popravka (molekularne restauracije) izvorne sekvence nukleotida DNA.
Mehanizam popravka temelji se na prisutnosti dva komplementarna lanca u molekuli DNK. Izobličenje nukleotidnog slijeda u jednom od njih detektiraju se specifičnim enzimima. Zatim se odgovarajuće mjesto uklanja i zamjenjuje novim, sintetiziranim na drugom komplementarnom DNA lancu. Takav se popravak naziva ekscizijskim, t.j. s "rezanjem" (slika 3.15). Provodi se prije sljedećeg ciklusa replikacije, pa se tako naziva
predreplikacijski.
Riža. 3.14. Shema procesa korekcije tijekom sinteze DNA: I - uključivanje u lanac DNA nukleotida s modificiranim (tautomernim) oblikom citoeina, koji se "nezakonito" spaja s adeninom; II - brzi prijelaz
citozin u svom uobičajenom obliku remeti njegovo uparivanje s adeninom; nespareni 3"-OH-kraj sintetiziranog lanca sprječava njegovo daljnje produljenje pod djelovanjem DNA polimeraze; III - DNA polimeraza uklanja ilegalni nukleotid, uslijed čega se ponovno pojavljuje 3"-OH-kraj uparen s šablonom; IV - DNA polimeraza nastavlja graditi lanac na 3 "-OH-kraju
Obnova izvorne strukture DNK zahtijeva sudjelovanje brojnih enzima. Važna točka u pokretanju mehanizma popravka je otkrivanje greške u strukturi DNK. Često se takve greške događaju u novosintetiziranom lancu tijekom replikacije. Enzimi za popravak moraju otkriti upravo ovaj lanac. Kod mnogih vrsta živih organizama novosintetizirani lanac DNA razlikuje se od majčinog stupnja metilacije njegovih dušičnih baza, što zaostaje za sintezom. U ovom slučaju, nemetilirani lanac prolazi kroz popravak. Predmet prepoznavanja enzima za popravak također mogu biti prekidi u lancu DNK. Kod viših organizama, gdje se sinteza DNK ne odvija kontinuirano, već pojedinačnim replikonima, novosintetizirani lanac DNK ima prekide, što ga omogućuje prepoznavanje.
Obnavljanje strukture DNK u slučaju gubitka purinskih baza jednog od njegovih lanaca uključuje otkrivanje defekta pomoću enzima endonukleaze, koji prekida fosfoestersku vezu na mjestu oštećenja lanca. Zatim izmijenjeno mjesto s nekoliko nukleotida uz njega uklanja enzim egzonukleaza, a na njegovom mjestu, u skladu s redoslijedom baza komplementarnog lanca, nastaje ispravan nukleotidni slijed (slika 3.15).
Riža. 3.15. Shema ekscizijske, pre-replikacijske popravke DNK Kada se jedna od baza u lancu DNK promijeni u restauraciji izvorne
U strukturama sudjeluje oko 20 enzima DNA glikozilaze koji specifično prepoznaju oštećenja uzrokovana deaminacijom, alkilacijom i drugim strukturnim transformacijama baza. Takve modificirane baze se uklanjaju. Postoje područja bez baza, koja se popravljaju, kao s gubitkom purina. Ako se ne izvrši obnova normalne strukture, na primjer, u slučaju deaminacije dušičnih baza, neki parovi komplementarnih baza zamjenjuju se drugima - par C-G može se zamijeniti parom T-A itd. (Vidi odjeljak 3.4.2.3).
Formiranje timinskih dimera (T-T) u polinukleotidnim lancima pod djelovanjem UV zraka zahtijeva sudjelovanje enzima koji ne prepoznaju pojedinačne izmijenjene baze, već opsežnije oštećenje strukture DNK. Reparativni proces u ovom slučaju također je povezan s uklanjanjem mjesta koje nosi dimer i obnavljanjem normalnog nukleotidnog slijeda sintezom na komplementarnom lancu DNA.
U slučaju da sustav za popravak ekscizije ne ispravi promjenu koja se dogodila u jednom lancu DNK, fiksacija se događa tijekom replikacije.
ova promjena i ona postaje vlasništvo oba lanca DNK. To dovodi do zamjene jednog para komplementarnih nukleotida s drugim ili do pojave lomova (praznina) u novosintetiziranom lancu naspram izmijenjenih regija. Obnova normalne strukture DNK također se može dogoditi nakon replikacije.
Postreplikacijski popravak provodi se rekombinacijom (razmjenom fragmenata) između dvije novonastale dvostruke spirale DNK. Primjer takvog post-replikacijskog popravka je obnova normalne strukture DNK kada se pojave timinski dimeri (T-T), kada se ne eliminiraju spontano pod djelovanjem vidljive svjetlosti ( lagani popravak) ili tijekom predreplikacijskog popravka ekscizije.
Kovalentne veze koje se javljaju između susjednih ostataka timina čine ih nesposobnima za vezanje na komplementarne nukleotide. Kao rezultat toga, u novosintetiziranom lancu DNA pojavljuju se prekidi (praznine) koje prepoznaju enzimi za popravak. Obnavljanje integriteta novog polinukleotidnog lanca jedne od kćeri DNK provodi se rekombinacijom s odgovarajućim normalnim majčinskim lancem druge kćeri DNK. Praznina nastala u roditeljskom lancu tada se popunjava sintezom na komplementarnom polinukleotidnom lancu (slika 3.16). Manifestacijom takvog post-replikacijskog popravka, provedenog rekombinacijom između lanaca dviju kćerinskih molekula DNA, može se smatrati često uočena izmjena materijala između sestrinskih kromatida (slika 3.17).
Riža. 3.16. Shema postreplikativne popravke DNA: I - pojava timinskog dimera u jednom od lanaca DNA;
II - formiranje "praznine" u novosintetiziranom lancu naspram promijenjenog mjesta roditeljske molekule nakon replikacije (strelica pokazuje naknadno popunjavanje "praznine" s mjestom iz odgovarajućeg lanca druge kćeri molekule DNK) ;
III - obnavljanje integriteta lanca kćeri gornje molekule uslijed rekombinacije i u donjoj molekuli zbog sinteze na komplementarnom lancu
Riža. 3.17. Interkromatidna izmjena (označeno strelicama)
Tijekom predreplikacijskog i postreplikacijskog popravka, većina oštećenja strukture DNK se obnavlja. Međutim, ako u nasljednom materijalu stanice nastane prevelika oštećenja, a neka od njih se ne eliminiraju, uključuje se sustav inducibilnih (pobuđenih) popravnih enzima (SOS-sustav). Ovi enzimi popunjavaju praznine obnavljajući integritet sintetiziranih polinukleotidnih lanaca bez strogog poštivanja načela komplementarnosti. Zato ponekad sami procesi popravka mogu poslužiti kao izvor trajnih promjena u strukturi DNK (mutacije). Navedena reakcija vrijedi i za SOS sustav.
Ako u stanici, unatoč popravku koji je u tijeku, količina oštećenja strukture DNK ostane visoka, u njoj su blokirani procesi replikacije DNK. Takva se stanica ne dijeli, što znači da ne prenosi promjene koje su nastale na potomstvo.
Zaustavljanje staničnog ciklusa uzrokovano oštećenjem DNK, u kombinaciji s nemogućnošću molekularne popravke promijenjenog nasljednog materijala, može, uz sudjelovanje proteina čiju sintezu kontrolira gen p53, dovesti do aktivacije procesa samopouzdanja. -uništenje (apoptoza) defektne stanice kako bi se ona eliminirala iz tijela.
Dakle, opsežan skup različitih enzima za popravak provodi kontinuirano "pregled" DNK, uklanjajući oštećena područja s nje i pomaže u održavanju stabilnosti nasljednog materijala. Zajedničko djelovanje enzima replikacije (DNA polimeraza i uređujuća endonukleaza) i enzima za popravak osigurava prilično nisku stopu pogreške u molekulama DNA, koja se održava na razini od 1 × 10–9 parova promijenjenih nukleotida po genomu. Uz veličinu ljudskog genoma od 3 × 109 parova baza, to znači pojavu oko 3 pogreške po replicirajućem genomu. Istovremeno, čak je i ova razina dovoljna za formiranje značajne genetske raznolikosti u obliku genskih mutacija tijekom postojanja života na Zemlji.
3.4.2.3. Promjene u nukleotidnim sekvencama DNK. Genske mutacije
Neprilagođene promjene kemijska struktura geni koji se reproduciraju u uzastopnim ciklusima replikacije i pojavljuju u potomstvu u obliku novih varijanti osobina nazivaju se mutacije gena.
Promjene u strukturi DNK koja čini gen mogu se podijeliti u tri skupine. Mutacije prve skupine sastoje se u zamjeni nekih baza drugim. Oni čine oko 20% spontano nastalih promjena gena. Druga skupina mutacija uzrokovana je pomakom okvira koji nastaje kada se promijeni broj parova nukleotida u genu. Konačno, treću skupinu predstavljaju mutacije povezane s promjenom redoslijeda nukleotidnih sekvenci unutar gena (inverzija).
Mutacije prema vrsti zamjene dušičnih baza. Te se mutacije javljaju iz više specifičnih razloga. Jedna od njih može biti promjena u strukturi baze koja je već uključena u spiralu DNA, koja se događa slučajno ili pod utjecajem specifičnih kemijskih sredstava. Ako takav izmijenjeni oblik baze ostane neprimijećen od strane enzima za popravak, tada tijekom sljedećeg ciklusa replikacije može na sebe vezati još jedan nukleotid. Primjer je deaminacija citozina, koji se spontano ili pod utjecajem dušična kiselina(slika 3.18). Rezultirajući uracil, nije primjećen od strane enzimaDNA glikozilaza,tijekom replikacije spaja se s adeninom, koji naknadno veže timidil nukleotid. Kao rezultat, par C-G je u DNK zamijenjen parom T-A (slika 3.19, I ). Deaminacija metiliranog citozina pretvara ga u timin (vidi sliku 3.18). Timidil nukleotid, koji je prirodna komponenta DNA, ne otkriva se kao promjena enzimima za popravak i dodaje adenil nukleotid tijekom sljedeće replikacije. Kao rezultat toga, umjesto para C-G par se pojavljuje i u molekuli DNK T-A (slika 3.19, II).
Riža. 3.18. Spontana deaminacija citozina
Drugi razlog za supstituciju baza može biti pogrešno uključivanje u sintetizirani lanac DNA nukleotida koji nosi kemijski modificirani oblik baze ili njezinog analoga. Ako ova greška ostane neprimijećena enzimima replikacije i popravljanja, promijenjena baza uključuje se u proces replikacije, što često dovodi do zamjene jednog para drugim. Primjer za to je dodavanje nukleotida s 5-bromuracilom (5-BU), sličnom timidil nukleotidu, adeninu majčinog lanca tijekom replikacije. Tijekom naknadne replikacije, 5-BU se lakše veže za sebe ne adenin, već guanin. Gvanin tijekom daljnjeg udvostručenja tvori komplementarni par s citozinom. Eventualno par A-T zamijenjen u molekuli DNK par H-C(slika 3.20).
Riža. 3. 19. Mutacije po vrsti supstitucije baza (deaminacija dušičnih baza u lancu DNK):
I - pretvorba citozina u uracil, zamjena C-G-para s T-A-parom;
II - konverzija metilcitozina u timin, zamjena C-G para s T-A parom
Iz gornjih primjera može se vidjeti da se promjene u strukturi molekule DNA prema vrsti supstitucije baze događaju prije ili tijekom replikacije, u početku u jednom polinukleotidnom lancu. Ako se takve promjene ne isprave tijekom popravka, tada tijekom naknadne replikacije one postaju vlasništvo oba lanca DNA.
Riža. 3.20. Mutacije zamjene baze
(Uključivanje analoga dušične baze u replikaciju DNA)
Posljedica zamjene jednog para komplementarnih nukleotida drugim je stvaranje novog tripleta u nukleotidnoj sekvenci DNA koja kodira aminokiselinsku sekvencu u peptidnom lancu. To možda neće utjecati na strukturu peptida ako je novi triplet "sinonim" prethodnog, t.j. će kodirati istu aminokiselinu. Na primjer, aminokiselina valin je šifrirana s četiri tripleta: CAA, CAG, CAT, CAC. Zamjena treće baze u bilo kojoj od ovih trojki neće promijeniti njezino značenje (degeneracija genetskog koda).
NA u slučaju kada novonastali triplet kodira drugu aminokiselinu, mijenja se struktura peptidnog lanca i svojstva odgovarajućeg proteina. Ovisno o prirodi i mjestu zamjene, specifična svojstva proteina se mijenjaju u različitim stupnjevima. Poznati su slučajevi kada zamjena samo jedne aminokiseline u peptidu značajno utječe na svojstva proteina, što se očituje u promjeni složenijih značajki. Primjer je promjena svojstava ljudskog hemoglobina kada anemija srpastih stanica (slika 3.21). U takvom hemoglobinu-(HbS) (za razliku od normalnog HbA) - u p-globinskim lancima na šestoj poziciji glutaminska kiselina je zamijenjena valinom. To je posljedica zamjene jedne od baza u tripletu koji kodira glutaminsku kiselinu (CTT ili CTC). Kao rezultat, pojavljuje se valin za šifriranje tripleta (CAT ili CAC). U ovom slučaju, zamjena jedne aminokiseline u peptidu značajno mijenja svojstva globina, koji je dio hemoglobina (smanjuje se njegova sposobnost vezanja za 02), osoba razvija znakove anemije srpastih stanica.
NA u nekim slučajevima, zamjena jedne baze s drugom može dovesti do pojave jednog od besmislene trojke (ATT, ATC, ACT) koje ne kodiraju nijednu aminokiselinu. Posljedica takve zamjene bit će prekid sinteze peptidnog lanca. Procjenjuje se da zamjene nukleotida u jednom tripletu dovode u 25% slučajeva do stvaranja sinonimnih tripleta; u 2-3 besmislene trojke, u 70-75% - do pojave pravih genskih mutacija.
Dakle, mutacije supstitucije baze mogu nastati kako kao rezultat spontanih promjena u strukturi baze u jednom od lanaca već postojeće dvostruke spirale DNA, tako i tijekom replikacije u novosintetiziranom lancu. Ako se te promjene ne isprave tijekom reparacije (ili se, obrnuto, dogode tijekom popravke), one su fiksirane u oba lanca i potom će se reproducirati u sljedećim ciklusima replikacije. Stoga su važan izvor takvih mutacija kršenja procesa replikacije i popravka.
Mutacije s pomakom u okviru čitanja. Ova vrsta mutacije čini značajan udio spontanih mutacija. Nastaju zbog gubitka ili umetanja jednog ili više parova komplementarnih nukleotida u nukleotidni slijed DNA. Većina proučavanih mutacija koje uzrokuju
POPRAVAK DNK
Reparacijski sustavi
2 Ekscizijski popravak. Primjeri i vrste
3 Popravak pogrešaka replikacije DNK
4 Rekombinantni (post-replikacijski) popravak u bakterijama
5 SOS reparacija
Sustavi za popravak DNK prilično su konzervativni u evoluciji od bakterija do ljudi i najbolje su proučavani kod E. coli.
Postoje dvije vrste reparacije:ravno i eksciziono
Izravna reparacija
Izravni popravak je najjednostavniji način uklanjanja oštećenja u DNK, što obično uključuje specifične enzime koji mogu brzo (obično u jednoj fazi) eliminirati odgovarajuća oštećenja, obnavljajući izvornu strukturu nukleotida.
1. Ovo radi, npr.O6-metilgvanin-DNA-metiltransferaza
(suicidalni enzim) koji uklanja metilnu skupinu iz dušične baze u jedan od vlastitih cisteinskih ostataka
U E. coli, do 100 molekula ovog proteina može se sintetizirati u 1 minuti. Protein viših eukariota, slične funkcije, očito ima važnu ulogu u zaštiti od raka uzrokovanog unutarnjim i vanjskim alkilirajućim čimbenicima.
DNA insertaza
2. DNA insertaze
fotoliaza
3. Dimeri timina su "vezeni" po izravna reparacija glumećifotoliaza, koji provode odgovarajuću fotokemijsku transformaciju. DNA fotoliaze su skupina svjetlosno aktiviranih enzima valne duljine 300 - 600 nm (vidljiva regija), za koje u svojoj strukturi imaju posebno središte osjetljivo na svjetlost.
Široko su rasprostranjeni u prirodi i nalaze se u bakterijama, kvascima, kukcima, gmazovima, vodozemcima i ljudima. Ovi enzimi zahtijevaju razne kofaktore (FADH, tetrahidrofolna kiselina, itd.) uključene u fotokemijsku aktivaciju enzima. E. coli fotoliaza je protein od 35 kDa koji je čvrsto vezan za oligoribonukleotid dužine 10-15 nukleotida potrebno za aktivnost enzima.
Primjeri izravne reparacije
1. Metilirana baza O 6-mG dimetiliran enzimom metiltransferazomO6-metilgvanin-DNA-metiltransferaza (suicidni enzim) koji prenosi metilnu skupinu na jedan od svojih ostataka
cistein
2. AP mjesta mogu se popraviti izravnim umetanjem purina uz pomoć enzima tzvDNA insertaze(od engleskog insert- insert).
SHEMA PRIMJERA IZRAVNE POPRAVKE OŠTEĆENJA U DNK - metilirana baza O6- mgdemetiliran enzimom metiltransferazom, koji prenosi metilnu skupinu na jedan od njegovih cisteinskih aminokiselinskih ostataka.
3. Fotoliaza se veže na timin dimer, a nakon zračenja ovog kompleksa vidljivom svjetlošću (300-600 nm), dimer se širi
SHEMA PRIMJERA DIREKTNE POPRAVKE OŠTEĆENJA U DNA – Fotoliaza
veže se na timin dimer i nakon ozračivanja vidljivom svjetlošću taj se dimer širi
Popravak ekscizije
(od engleskog excision - rezanje).
DEFINICIJA
Ekscizijski popravak uključuje uklanjanje oštećene dušične baze iz DNA i naknadni oporavak normalna molekularna struktura.
MEHANIZAM
U popravku ekscizije obično sudjeluje nekoliko enzima, a sam proces utječe
ne samo oštećena ,
ali i susjedni nukleotidi .
UVJETI
Za popravak ekscizijom potreban je drugi (komplementarni) lanac DNK. Opća pojednostavljena shema ekscizijskog popravka prikazana je na sl. 171.
FAZE
Prvi korak u popravku ekscizije je izrezivanje abnormalnih dušičnih baza. Katalizuje ga grupaDNK-N-glikozilaza- enzimi koji cijepaju glikozidnu vezu između deoksiriboze i dušične baze.
VAŽNA NOTA:
NaljudskiDNK-N-glikozilazaimaju visoku supstratnu specifičnost: različiti enzimi ove obitelji prepoznaju i akcizuju razne anomalne baze(8-oksoguanin, uracil, metilpurini, itd.).
NabakterijeDNK-N-glikozilazanema takvu specifičnost supstrata.
ENZIMI ZA OPĆE ISKLJUČIVANJE
| TITULA | FUNKCIJA | MEHANIZAM |
| DNK-N-glikozilaza | ekscizija abnormalnih dušičnih baza | cijepa glikozidnu vezu između deoksiriboze i dušične baze |
| AP endonukleaza | stvara uvjete za rad sljedećeg enzima - egzonukleaze | razbija šećerno-fosfatnu okosnicu molekule DNA na mjestu AP |
| egzonukleaza | cijepa nekoliko nukleotida | uzastopno cijepa nekoliko nukleotida s oštećenog dijela jednog lanca DNA |
POSEBNI SEKVENCIJALNI KORACI OVE MEHANIZE:
Kao rezultat djelovanja DNK- N-glikozilazanastaje AP mjesto koje enzim napada AR-endonukleaza. Razbija šećerno-fosfatnu okosnicu DNK molekule na mjestu AP i time stvara uvjete za rad sljedećeg enzima - egzonukleaze, koji uzastopno cijepa nekoliko nukleotida s oštećenog dijela jednog lanca DNA.
U bakterijskim stanicama oslobođeni prostor popunjava se odgovarajućim nukleotidima uz sudjelovanje DNA polimeraza I orijentiran na drugi (komplementarni) lanac DNK.
Budući da je DNA polimeraza I sposobna produžiti 3' kraj jednog od lanaca pri prekidu dvolančane DNK i ukloniti nukleotide s 5' kraja istog prekida,
oni. shvatiti “nick-broadcast” , ovaj enzim igra ključnu ulogu u popravku DNK. Izvodi se završno šivanje popravljenih područja DNA ligaza.
U stanicama eukariota (sisavaca).
Popravak izrezivanja DNA u stanicama sisavaca popraćen je naglim porastom aktivnosti drugog enzima,poli ADP-riboza polimeraza . U isto vrijeme, događa se ADP-ribozilacija proteina kromatina(histoni i nehistonski proteini), što dovodi do slabljenja njihove veze s DNA i otvara pristup enzimima za popravak.
Donator ADP-ribozau ovim reakcijamaNAD+, čije su rezerve uvelike iscrpljene tijekom ekscizijske sanacije oštećenja uzrokovanih rendgenskim zračenjem:
Negativno nabijeni ostaci ADP-riboza iz unutarnjeg sastava molekule NAD+ pridružiti se preko radikalaglutamin kiseline ili fosfoserinna proteine kromatina, što dovodi do neutralizacije pozitivnih naboja tih proteina i slabljenja njihovog kontakta s DNA.
ŠTO JE SKUPINA ENZIMA
DNA – glikozilaze
cijepa glikozidnu vezu između deoksiriboze i dušične baze
što dovodi do ekscizije abnormalnih dušičnih baza
DNA – glikozilaze , uključen u eliminaciju oksidativnih oštećenja DNK u stanicama prokariota i eukariota, vrlo su raznoliki i razlikuju se po specifičnosti supstrata, prostornoj strukturi i načinima interakcije s DNK.
Najviše proučavane DNA glikozilaze uključuju:
endonukleaza III(EndoIII),
tvori amidopirimidin-DNA-glikozilazu (fpg)
Mut T i
Mut Ycoli.
Endonukleaza IIIE. coli prepoznaje i specifično se cijepa od DNK oksidirani pirimidinske baze.
Ovaj enzim je monomerni globularni protein koji se sastoji od 211 aminokiselina ostaci (mol. masa 23,4 kDa). Gen koji kodira Endo III je sekvencioniran i utvrđen je njegov nukleotidni slijed. Endo III je protein željezo-sumpor [(4 Fe-4S )2+-protein], koji ima element iznad sekundarna struktura tip "grčki ključ" (spirala - ukosnica - spirala), služe za vezanje za DNK. Izolirani su i enzimi sa sličnom specifičnošću supstrata i sličnim sekvencama aminokiselina goveđe i ljudske stanice.
Formirajte amidopiridin-DNA-glikozilazu E. coli "prepoznaje" i cijepa oksidirani heterocikl baze purinskog niza .
SHEMA POPRAVKA ISKLJUČIVANJA 1. FAZA
DNKN
SHEMA POPRAVKA ISKLJUČIVANJA
1 DNKNglikozidaza uklanja oštećenu bazu
AR endonukleaza razbija DNK
2 Egzonukleaza uklanja određeni broj nukleotida
3 DNA polimeraza ispunjava upražnjeno mjesto komplementarnim
Mononukleotidi
DNA ligaza umrežava popravljeni lanac DNK
Mut T- mali protein molekularne težine 15 kDa, koji ima aktivnost nukleozid trifosfataze, koja je pretežno hidrolizira dGTP u dGMP i pirofosfat.
Biološka uloga Mut T je spriječiti stvaranje nekanonskih parova tijekom replikacijeO: G i A: 8-okso-G.
Takvi se parovi mogu pojaviti kada oksidirani oblik
dGTP (8-okso-dGTP) postaje supstrat DNA polimeraza.
Mut T hidrolizira 8-okso-dGTP10 puta brži od dGTP-a.
To radi 8-okso-dGTPnajpoželjniji supstratMutTte objašnjava njegovu funkcionalnu ulogu.
Mut Yje specifična adenin-DNA glikozilaza koja cijepa N-glikozidnu vezu između adenina i deoksiriboze adenozin, tvoreći nekanonski par s gvaninom.
Funkcionalna uloga ovog enzima je spriječiti mutaciju
T:A - G:A od cijepanje netaknutog ostatka adeniniz baznog para A: 8-okso-G.
Popravak ekscizijom nukleotida
(Mehanizam uklanjanja oštećenja DNK ovisan o ATP-u)
U posljednje vrijeme, u ekscizijskom popravku, posebna se pozornost posvećuje ATP-ovisnom mehanizmu za uklanjanje oštećenja iz DNK. Ova vrsta ekscizijskog popravka naziva se nukleotidna ekscizijska popravka (NER).
Uključuje DVIJE FAZE :
1. uklanjanje iz DNKoligonukleotidni fragmenti koji sadrže štetu, i
Ekscinukleaza
2. naknadna rekonstrukcija lanca DNA uz sudjelovanje kompleksa enzima (nukleaze, DNA polimeraze, DNA ligaze itd.).
Dolazi do uklanjanja fragmenta DNK s obje strane oštećenog nukleotida. Duljina uklonjenih fragmenata oligonukleotida razlikuje se između prokariota i eukariota.
Uklanjanje fragmenta DNA iz prokariota
Dakle, u E. coli, B. subtilus, Micrococcus luteus, fragment duljine 12-13 nukleotidi
Uklanjanje fragmenta DNK iz eukariota
a kod kvasca, vodozemaca i ljudi, fragment koji se sastoji od 24-32 nukleotidi.
Ekscinukleaza- enzim koji uklanja fragmente DNK
DNK fragment cijepa enzimekscinukleaza(eksinukleaza). U E. coli, ovaj enzim se sastoji od 3 različita protomera -
uvra
uvr B
uvr C
od kojih svaki obavlja specifičnu funkciju tijekom ekscizijskog cijepanja fragmenta DNA. Naziv ovih proteina dat je prvim slovima riječi"ultraljubičasti popravak".
Protomer uvr Aima aktivnost ATPaze, veže se na DNA u obliku dimera, provodeći
primarno prepoznavanje štete i
obvezujućiuvr B
Protomer uvr B ima:
jedan . Latentan Aktivnost ATPaze i latentne helikaze potrebne za promjenu konformacija i odmotavanje dvostruke spirale DNK;
2. Endonukleaza aktivnost, cijepanje internukleotidne (fosfodiesterske) veze sa straneZ"-krajrascijepljeni ulomak.
Protomer uvr Cdjeluje kao endonukleaza, uvodeći prekid u popravljenom lancu DNK sa5"-krajizrezani ulomak.
Dakle, protomeriuvr A, uvr B, uvr Cstupaju u interakciju s DNA u određenom slijedu, provodeći ATP-ovisnu reakcijucijepanje oligonukleotidnog fragmenta iz lanca DNK koji se popravlja.
Nastali jaz u molekuli DNA popravlja se uz sudjelovanje DNA polimeraze I i DNA ligaze. Model ekscizijskog popravka uz sudjelovanje navedenih enzima prikazan je na sl. 172.
Ekscizijski popravci kod ljudi
Ljudski ekscizijski popravci također ovise o ATP-u i uključujutri glavna koraka :
prepoznavanje štete,
dvostruko rezanje lanca DNK,
reduktivna sinteza i
podvezivanje popravljene niti.
Međutim, popravak ekscizije ljudske DNK uključuje
25 različitih polipeptida ,
16 od kojih su uključeni u cijepanje oligonukleotidnog fragmenta, budući da su protomeriekscinukleaze,
a ostalo 9 provesti sintezu popravljenog dijela molekule.
U sustavu za popravak DNK kod ljudi, vrlo je bitnu ulogu provode transkripciju proteina
RNA polimeraza II i
TF ponjedan od šest glavnih faktora transkripcije eukariota.
Treba napomenuti da popravak ekscizije kod prokariota, kao i kod eukariota, ovisi o funkcionalnom stanju DNK:
transkribirana DNK se brže popravlja
nego transkripcijski neaktivan.
Ovaj fenomen se objašnjava sljedećim čimbenicima:
struktura kromatina,
homologija lanaca transkribiranih DNK regija,
učinak oštećenja lanca i njegov učinak na RNA polimerazu.
VAŽNA NOTA:
DNA LANCA KODIRANJA (lanac pohrane informacija)
MATRIČNI LANAC DNK (iz njega se otpisuju informacije)
Poznato je da tako velike štete kao stvaranje dimera timina, blokiraju transkripciju i kod bakterija i kod ljudi ako se pojave na matrični sklop DNK (oštećenje kodiranje lanci ne utječu na transkripcijski kompleks). RNA polimeraza zaustavlja se na mjestu oštećenja DNK i blokira rad transkripcionog kompleksa.
Faktor povezivanja transkripcije i popravke (TRCF) .
U E. coli, poboljšanje transkripcijskog popravka je posredovano jednim posebnim proteinom -faktor povezivanja transkripcije i popravke (TRCF) .
Ovaj protein doprinosi :
1. odvajanje RNA polimeraze od DNA
2. istovremeno potiče stvaranje proteinskog kompleksa,
Izvođenje popravka oštećenog područja.
Na kraju popravka, RNA polimeraza dolazi na svoje mjesto i transkripcija se nastavlja (vidi sliku).
Tako opća shema popravak ekscizije
1. DNK-N -glikozilaza uklanja oštećenu bazu
2. AR-endonukleaza uvodi prekid u lancu DNK
3. Egzonukleaza uklanja brojne nukleotide
4. DNA polimeraza ispunjava oslobođeno područje
Komplementarni nukleotidi
5. DNA ligaza poprečno povezuje popravljeni lanac DNK
Popravak pogrešaka replikacije DNK
metilacijom
Pogreške u sparivanju dušičnih baza tijekom replikacije DNK javljaju se prilično često (u bakterijama jednom na 10 tisuća nukleotida), zbog čegau lanac kćeri DNK Uključeni su nukleotidi koji nisu komplementarni nukleotidima majčinog lanca -nepodudarnosti(Englesko nepodudaranje n e utakmica).
Usprkos činjenici daDNA polimeraza Iprokariot ima sposobnost samoispravljanja, njegovi napori da eliminiraju pogrešno pričvršćene nukleotide ponekad nije dovoljno, a onda u DNK ostaju neki krivi (nekomplementarni) parovi.
U ovom slučaju, reparacija se događa korištenjem specifičnog sustava povezanog sDNA metilacija . Djelovanje ovog sustava popravka temelji se na činjenici da nakon replikacije, nakon određenog vremena (nekoliko minuta), DNK prolazi metilaciju.
E coli metilirani prvenstveno adenin s obrazovanjem
N6-metil-adenin (N6-mA).
Do ove točke, novosintetizirani(podružnica)lanac ostaje nemetiliran.
Ako u takvom lancu postoje nespareni nukleotidi, on se podvrgava popravku: Daklemetilacijske oznake DNA i
uključuje sustav za ispravljanje pogrešaka replikacija.
U ovom sustavu reparacije prepoznaju se posebne strukture:
podslijedG-N6-mA-T-Ci Sljedeći iza njega deformacija
u dvostrukoj spirali na mjestu nedostatka komplementarnosti (slika ispod).
u eliminaciji nesparenih nukleotida u polumetilirani u molekuli DNK sudjeluje prilično složen kompleks enzima za popravak, koji skenira površinu molekule DNK,reže dio dječjeg lanca pribjegavajući mismatcham, a zatim stvara uvjete za izgradnju
njegove željene (komplementarne) nukleotide.
Različite komponente ovog kompleksa imaju različite aktivnosti.nukleaza,
helikaza,
ATPaznoy,
potrebno za uvođenje lomova u DNA i cijepanje nukleotida, odmotavanje dvostruke spirale DNA i osiguravanje energije za kretanje kompleksa duž popravljenog dijela molekule.
Kompleks popravnih enzima sličnih po strukturi i funkcijama također je pronađen u ljudi.
Rekombinantni (post-replikacijski) popravak
U onim slučajevima kada su, iz ovog ili onog razloga, gore navedeni sustavi popravka poremećeni, u lancima DNK mogu nastati praznine (nedovoljno popravljena područja). ponekad prilično značajno, što je ispunjeno poremećajem sustava replikacije i može dovesti do smrti stanice.
U tom slučaju, stanica je sposobna koristiti za popravak jedne molekule DNA drugu molekulu DNA dobivenu nakon replikacije, tj. uključiti u tu svrhu mehanizamrekombinacija.
U bakterijama
U bakterijama sudjeluje rekombinantna popravkaRec A protein. Veže se na jednolančanu DNA regiju i uključuje je u rekombinaciju shomologne regije netaknutih lanaca druge molekule DNA .
Kao rezultat, ispada da su i slomljeni (koji sadrže praznine) i netaknuti lanci molekule DNK koja se popravlja uparen s netaknutim komplementarnim DNK regijama, što otvara mogućnost popravka gore opisanim sustavima.
U isto vrijeme, može postojati rezanje određeni fragment i
punjenjeuz njegovu pomoć praznine u neispravnom lancu.
Nastale praznine i prekidi u lancima DNK popunjavaju se sudjelovanjemDNA polimeraza I i DNA ligaza .
SOS reparacija
Postojanje ovog sustava prvi je pretpostavio M. Radman 1974. On je i dao ime ovom mehanizmu uključivši u njega međunarodni signal za pomoć "SOS" (spasi naše duše).
Doista, ovaj sustav se uključuje kada oštećenje DNK postaje toliko veliko da prijeti životu stanice. U ovom slučaju se inducira aktivnost različite skupine gena uključenih u različite stanične procese povezane s popravkom DNA.
Uključivanje određenih gena, određeno količinom oštećenja u DNK, dovodi do staničnih odgovora različitog značaja (počevši od standardnih popravak oštećenih nukleotidi i završetak suzbijanje dijeljenje stanica).
Većina proučavanihSOS reparacijau E. coli, čiji su glavni sudionici kodirani proteini gena Rec AiLex A.
Prvi je višenamjenskiRec A protein sudjelujući
u DNK rekombinacija, kao i
u regulacija transkripcije gena fag lambdakoji inficira E. coli,
i drugo (Lex A protein)je represor transkripcija velike skupine gena namijenjena za popravak DNK bakterije. Kada je inhibirana ili riješena popravak je aktiviran.
Uvezivanje Rec A s Lexom Avodi do cijepanja potonjeg i prema tome na aktivacija gena za popravak.
Zauzvrat, indukcija bakterijskog SOS sustava služi zafag lambda signal za opasnost i uzrokuje prelazak profaga iz pasivni na aktivni (litički) put postojanje, na taj način uzrokujući smrt stanice domaćina.
Sustav SOS popravka pronađen je ne samo u bakterijama, već i kod životinja i ljudi.
Geni uključeni u popravak oštećenja SOS DNK
| Geni | Posljedice aktivacije gena |
| uvr A, B, C, D | Popravak oštećenja sekundarne strukture DNK |
| Rec A | Postreplikacijski popravak, indukcije SOS sustava |
| lex A | Isključivanje SOS sustava |
| rec N, ruv | Popravak prekida dvostrukih niti |
| Osiguravanje popravka rekombinacije |
|
| umu C, D | Mutageneza uzrokovana promjenama svojstava DNA polimeraze |
| sul A | Potiskivanje diobe stanica |
Zaključak
Popravak oštećenja DNK usko je povezan s drugim temeljnim molekularno genetskim procesima: replikacija, transkripcija i rekombinacija. Svi ti procesi su isprepleteno u zajednički sustav interakcije, kojima služi veliki broj različitih proteina, od kojih su mnoge polifunkcionalne molekule uključene u kontrola provedbe genetske informacije u pro- i eukariotskim stanicama. Pritom je jasno da priroda "nemoj štedjeti" na kontrolnim elementima, stvarajući najsloženije sustave za ispravljanje onih oštećenja u DNK koja su opasni za organizam a posebno za njegovo potomstvo. S druge strane, u onim slučajevima kada reparativni kapacitet nije dovoljan za održavanje genetskog statusa organizma, postoji potreba za programiranom staničnom smrću -apoptoza..
SHEMA POPRAVKE EKCIZIJE NUKLEOTIDA U E. COLIUZ SUDJELOVANJE EXINUCLEASE-a
1. TRANSKRIPCIJSKI NEOVISAN MEHANIZAM
2. MEHANIZAM OVISAN O TRANSKRIPCIJI
3. OPĆA FAZA POPRAVKA
SIMBOLI
A - proteinuvr ALI
B - proteinuvr NA
C - proteinuvr S
mali crni trokut - znak označava mjesto oštećenja
SHEMA POPRAVKA POVEZANA S METILANJEM DNA
reparacije
naziva sposobnošću molekule DNK da "ispravi" promjene koje se događaju u njezinim lancima. Najmanje 20 proteina sudjeluje u obnovi izvorne strukture: prepoznaju izmijenjene dijelove DNA i uklanjaju ih iz lanca, obnavljaju ispravan slijed nukleotida i poprečno povezuju obnovljeni fragment s ostatkom molekule DNA.
Navedene značajke kemijske strukture i svojstva DNK određuju funkcije koje ona obavlja. DNK bilježi, pohranjuje, reproducira genetske informacije, sudjeluje u procesima njihove provedbe između novih generacija stanica i organizama.
ribonukleinske kiseline - RNA -
predstavljaju molekule različitih veličina, strukture i obavljanja funkcija. Sve RNA molekule su kopije određenih dijelova molekule DNA i, uz već naznačene razlike, kraće su od nje i sastoje se od jednog lanca. Između odvojenih dijelova jednog RNA lanca koji su međusobno komplementarni, moguće je uparivanje baza (A s U, G s C) i stvaranje spiralnih presjeka. Kao rezultat toga, molekule dobivaju specifičnu konformaciju.
Matrična, ili informacijska, RNA (mRNA, mRNA) sintetizira se u jezgri pod kontrolom enzima RNA polimeraze, komplementarno informacijskim sekvencama DNA, prenosi tu informaciju na ribosome, gdje postaje matrica za sintezu proteinske molekule. Ovisno o količini informacija koje se kopiraju, molekula mRNA može imati različitu duljinu i čini oko 5% sve stanične RNA.
Ribospecifična RNA (rRNA) sintetizira se uglavnom u nukleolu, u području gena rRNA, a predstavljena je molekulama različite molekularne težine koje su dio velikih i malih subčestica ribosoma. rRNA čini 85% sve stanične RNA.
Transfer RNA (tRNA) čini oko 10% stanične RNA. Postoji preko 40 tipova tRNA. Tijekom implementacije genetske informacije, svaka tRNA veže određenu aminokiselinu i transportira je do mjesta sklapanja polipentida. Kod eukariota tRNA su dugačke 70-90 nukleotida.
Stanična struktura
Vrste stanične organizacije.
Među raznolikošću organizama koji trenutno postoje na Zemlji, razlikuju se dvije skupine: virusi i fagi koji nemaju staničnu strukturu; svi ostali organizmi predstavljeni su raznim staničnim oblicima života. Postoje dvije vrste stanične organizacije: prokariotski
i eukariotski (
vidi sl.1 ).
Stanice prokariotskog tipa su relativno jednostavne. Nemaju morfološki izoliranu jezgru, jedini kromosom tvori kružna DNA i nalazi se u citoplazmi; membranske organele su odsutne (njihovu funkciju obavljaju različite invaginacije plazma membrane); u citoplazmi se nalaze brojni mali ribosomi; mikrotubule nema, pa je citoplazma nepokretna, a trepetljike i flagele imaju posebnu građu. Bakterije se klasificiraju kao prokarioti.
Većina modernih živih organizama pripada jednom od tri kraljevstva - biljke, gljive ili životinje, ujedinjene u nadkraljevstvo eukariota.
Ovisno o broju sastavljenih organizama, potonji se dijele na jednostanične i višestanične. Jednostanični organizmi sastoje se od jedne stanice koja obavlja sve funkcije. Mnoge od tih stanica su mnogo složenije od stanica višestaničnih organizama. Svi prokarioti su jednostanični, kao i protozoe, neke zelene alge i gljive.
Sadržaj predmeta "Genetski elementi bakterija. Mutacije u bakterijama. Transdukcija.":1. Migrirajući genetski elementi bakterija. Transpozoni. Bakteriofagi kao migrirajući genetski elementi.
2. Mutacija. mutacije u bakterijama. Mutageni. spontane mutacije. Povratne mutacije (reverzije).
3. Inducirane mutacije bakterija. kemijska mutageneza. mutageneza zračenja. Vrste mutacija.
4. Popravak DNK bakterija. Sustavi za popravak DNK. Kompenzacija funkcija poremećenih kao rezultat mutacija. Intragena supresija. Ekstragena supresija.
5. Prijenos bakterijske DNK. bakterijska konjugacija. F-faktor bakterija.
6. Transformacija bakterija. Faze bakterijske transformacije. Mapiranje bakterijskih kromosoma.
7. Transdukcija. Nespecifična transdukcija. specifična transdukcija. Abortivna transdukcija. Fenomen lizogenije.
8. Svojstva bakterija. Nenasljedne promjene u svojstvima bakterija. S - kolonije. R - kolonije. M - kolonije. D - kolonije bakterija.
Popravak bakterijske DNK. Sustavi za popravak DNK. Kompenzacija funkcija poremećenih kao rezultat mutacija. Intragena supresija. Ekstragena supresija.
U stanici postoje mehanizmi koji mogu u potpunosti ili djelomično obnoviti izvornu strukturu promijenjene DNK. Mutacije uzrokovane zračenjem kemikalije i drugi čimbenici, teoretski bi mogli dovesti do izumiranja bakterijske populacije ako bi potonjoj bila lišena sposobnosti da popravak DNK. Skup enzima koji kataliziraju korekciju oštećenja DNK kombinira se u takozvane popravne sustave, koji se bitno razlikuju po biokemijskim mehanizmima "iscjeljivanja" oštećenja. Postoje tri glavna smjera za ispravljanje DNK defekata.
1. Izravna reverzija iz oštećena DNK na izvornu strukturu kada promjene u DNK korigirano jednom enzimskom reakcijom. Na primjer, uklanjanje netočno vezane metilne skupine na šestom kisikovom atomu gvanina pomoću metiltransferaze; ili cijepanje ozračenog timinskog dimera fotoliazom ( rekombinacijski popravak).
2. Oštećenja od "rezanja". nakon čega slijedi restauracija izvorne strukture (ekscizijski popravak).
3. Aktiviranje posebnih mehanizama koji osiguravaju opstanak u slučaju oštećenja DNK(obnova izvorne strukture DNK kao rezultat rekombinacije; korekcija neusklađenosti baze; translacijska sinteza na oštećenoj matrici DNK). Ovi mehanizmi ne dovode uvijek do potpune obnove izvorne strukture DNK.
Kompenzacija funkcija poremećenih kao rezultat mutacija
primarna mutacija može se nadoknaditi sekundarnom mutacijom koja se dogodila unutar mutiranog gena (intragenski) ili u drugom genu (ekstragenski). Promjene koje uklanjaju manifestacije mutacije bez ispravljanja izvornog poremećaja u DNK, nazvao suzbijanje.
intragenska supresija uzrokovano sekundarnom mutacijom koja ispravlja učinke primarne mutacije. Na primjer, točkasta mutacija koja rezultira sintezom defektnog proteina s izgubljenom biološkom aktivnošću može se ispraviti ako sekundarna točkasta mutacija rezultira kodiranjem aminokiseline koja zadržava konfiguraciju i aktivnost proteina. Točna obnova izvorne strukture gena naziva se prava stražnja mutacija ( istinska reverzija). Ako je učinak prve mutacije nadoknađen mutacijom u drugom dijelu gena, takve se mutacije nazivaju sekundarne reverzije.
Ekstragena supresija- potiskivanje manifestacije mutacije koja se dogodila u jednom genu, zbog mutacije u drugom genu.
