осоляване: утаяване със соли на алкални, алкалоземни метали (натриев хлорид, магнезиев сулфат), амониев сулфат; в същото време първичната структура на протеина не се нарушава;
валежи: използване на обезводняващи агенти: алкохол или ацетон при ниски температури (около -20°C).
Когато се използват тези методи, протеините губят своята хидратираща обвивка и се утаяват в разтвор.
Денатурация- нарушение на пространствената структура на протеините (първичната структура на молекулата се запазва). Тя може да бъде обратима (структурата на протеина се възстановява след отстраняването на денатуриращия агент) или необратима (пространствената структура на молекулата не се възстановява, например, когато протеините се утаяват с концентрирани минерални киселини, соли на тежки метали).
Методи за разделяне на протеини Отделяне на протеини от примеси с ниско молекулно тегло
Диализа
Използва се специална полимерна мембрана, която има пори с определен размер. Малките молекули (примеси с ниско молекулно тегло) преминават през порите в мембраната, докато големите молекули (протеини) се задържат. По този начин протеините се измиват от примеси.
Разделяне на протеини по молекулно тегло
Гел хроматография
Хроматографската колона е пълна с гел гранули (Sephadex), който има пори с определен размер. Към колоната се добавя смес от протеини. Протеините, чийто размер е по-малък от размера на порите на сефадекса, се задържат в колоната, тъй като „засядат” в порите, а останалите свободно напускат колоната (фиг. 2.1). Размерът на протеина зависи от неговото молекулно тегло.
Ориз. 2.1.Разделяне на протеини чрез гел филтрация
Ултрацентрофугиране
Този метод се основава на различни скорости на утаяване (утаяване) на протеинови молекули в разтвори с различни градиенти на плътност (захарозен буфер или цезиев хлорид) (фиг. 2.2).
Ориз. 2.2.Разделяне на протеини чрез ултрацентрофугиране
електрофореза
Този метод се основава на различни скорости на миграция на протеини и пептиди в електрическо поле в зависимост от заряда.
Като носители за електрофореза могат да служат гелове, целулозен ацетат, агар. Молекулите, които трябва да бъдат разделени, се движат в гела в зависимост от техния размер: тези, които са по-големи, ще бъдат задържани, докато преминават през порите на гела. По-малките молекули ще срещнат по-малко съпротивление и следователно ще се движат по-бързо. В резултат на това след електрофореза по-големите молекули ще бъдат по-близо до началото, отколкото по-малките (фиг. 2.3).
Ориз. 2.3. Разделяне на протеини чрез гел електрофореза
Протеините могат също да бъдат разделени чрез електрофореза по молекулно тегло.За тази употреба електрофореза в PAAG в присъствието на натриев додецил сулфат (SDS-Na).
Изолиране на отделни протеини
Афинитетна хроматография
Методът се основава на способността на протеините да се свързват силно с различни молекули чрез нековалентни връзки. Използва се за изолиране и пречистване на ензими, имуноглобулини, рецепторни протеини.
Молекулите от вещества (лиганди), с които определени протеини се свързват специфично, са ковалентно комбинирани с частици от инертно вещество. Към колоната се добавя смес от протеини и желаният протеин е здраво прикрепен към лиганда. Останалите протеини свободно излизат от колоната. След това задържаният протеин може да се измие от колоната с буфер, съдържащ свободния лиганд. Този високочувствителен метод позволява да се изолират много малки количества чист протеин от клетъчен екстракт, съдържащ стотици други протеини.
Изоелектрично фокусиране
Методът се основава на различни IEP стойности на протеини. Протеините се разделят чрез електрофореза върху плоча с амфолин (това е вещество, което има предварително формиран градиент на рН в диапазона от 3 до 10). По време на електрофореза протеините се разделят според стойността на техния IEP (при IEP зарядът на протеина ще бъде нула и той няма да се движи в електрическото поле).
2D електрофореза
Това е комбинация от изоелектрично фокусиране и електрофореза с SDS-Na. Първо, електрофорезата се извършва в хоризонтална посока върху плоча с амфолин. Протеините се разделят в зависимост от заряда (CEP). След това плочата се третира с разтвор на SDS-Na и се извършва електрофореза във вертикална посока. Протеините се класифицират въз основа на молекулното тегло.
Имуноелектрофореза (Western blot)
Аналитичен метод, използван за определяне на специфични протеини в проба (Фигура 2.4).
Изолиране на протеини от биологичен материал.
Разделяне на протеини по молекулно тегло чрез електрофореза в PAAG с SDS-Na.
Прехвърляне на протеини от гела към полимерната плоча, за да се улесни по-нататъшната работа.
Обработка на плочата с неспецифичен протеинов разтвор за запълване на останалите пори.
Така след този етап се получава плоча, чиито пори съдържат отделени протеини, а пространството между тях е запълнено с неспецифичен протеин. Сега трябва да определим дали сред протеините, които търсим, са отговорни за някакъв вид заболяване. Лечението с антитела се използва за откриване. Под първични антитела се разбират антитела към желания протеин. Под вторични антитела се разбират антитела срещу първични антитела. Към състава на вторичните антитела се добавя допълнителен специален етикет (т.нар. молекулярна сонда), за да могат по-късно да се визуализират резултатите. Като етикет се използва радиоактивен фосфат или ензим, плътно свързан с вторичното антитяло. Свързването първо с първични и след това с вторични антитела има две цели: да стандартизира метода и да подобри резултатите.
Обработка с разтвор на първични антитела свързването става на мястото на плочата, където има антиген (желания протеин).
Отстраняване на несвързани антитела (измиване).
Лечение с разтвор на белязани вторични антитела за последващо развитие.
Отстраняване на несвързани вторични антитела (измиване).
Ориз. 2.4. Имуноелектрофореза (Western blot)
В случай на присъствие на желания протеин в биологичния материал, върху плочата се появява лента, която показва свързването на този протеин със съответните антитела.
заглавка
2
2
Изолирането и пречистването на протеините се извършва на етапи.
1. Хомогенизиране- това е цялостно смилане на обекти на биохимично изследване до хомогенно, тоест хомогенно състояние, тоест протеините претърпяват цялостно разпадане до разрушаване на клетъчната стена.
При това те използват:
а)Хомогенизатори с ножове от воюващ тип;
б)хомогенизатори за пестик Potter - Elveheim;
в)топкови и валцови мелници - за по-плътни обекти;
ж)методът на редуващо замразяване и размразяване, докато разкъсването на клетъчната стена става под действието на ледени кристали;
д)методът на "азотната бомба" - под високо налягане клетките се насищат с азот, след което налягането рязко се освобождава, отделя се газообразен азот, който сякаш взривява клетката отвътре;
д)Ултразвук, различни пресови методи, смилане на клетъчните стени с ензими. В повечето случаи при хомогенизирането се отделя топлина, докато много протеини могат да бъдат инактивирани, така че всички процедури се провеждат в хладилни помещения при t 0 или суровините се охлаждат с лед. В същото време обемът и времето на разрушаване на клетките, както и работното налягане се контролират внимателно. Идеален хомогенизатор е този, който може да бъде допълнително екстрахиран.
2. Екстракция на протеин, тоест прехвърлянето им в разтворено състояние; най-често екстракцията се извършва едновременно с смилане.
Извличането се извършва:
а)разтваряне в 8-10% солеви разтвори;
б)използване на буферни разтвори с рН от кисело до слабо алкално (борат, фосфат, цитрат, трис - буфер: смес от тризаминометан с NH2 - CH3 + HCl;
в)утаяване на протеини с органични разтворители (етанол, метанол, бутанол, ацетон и техните комбинации), като същевременно се разделят протеиново-липидните и протеин-протеиновите компоненти, тоест разрушаването на HSB.
3. Пречистване и фракциониране на протеини.След екстракция, сместа се отделя или фракционира на отделни протеини и допълнително се пречиства:
а) осоляване- това е процесът на утаяване на протеини от неутрални солеви разтвори на алкални и алкалоземни метали.
механизъм за изсоляване– добавените аниони и катиони разрушават хидратираната протеинова обвивка на протеините, която е един от факторите за стабилност на протеиновите разтвори. Най-често се използват разтвори на Na и амониев сулфат. Много протеини се различават по размера на хидратиращата обвивка и големината на заряда. Всеки протеин има своя собствена зона за осоляване. След отстраняване на осолителя протеинът запазва своята биологична активност и физикохимични свойства. В клиничната практика методът на осоляване се използва за разделяне на глобулини (с добавяне на 50% разтвор на амониев сулфат (NH 4) 2SO 4 се образува утайка) и албумини (с добавяне на 100% разтвор на амониев сулфат (NH 4) 2SO 4 образува се утайка).
Осоляването се влияе от:
1) естество и концентрация на сол;
2) pH среди;
3) температура.
Основна роля играят валентностите на йоните. Следователно ефектът на солта се оценява чрез йонната сила на разтвора μ:
, тоест йонната сила на разтвора (μ) е равна на произведението на ½ от концентрацията на всеки йон (C) и квадрата на неговата валентност (V).
Методът на Кон е вид осоляване. В същото време се извършва извличане и утаяване на компонентите. Чрез последователна промяна на температурата (обикновено ниско t o -0 + 8 o C), рН на разтвора и концентрирания етанол, до 18 протеинови фракции се изолират последователно от кръвната плазма.
Метод на Конизползва се във фармацевтичното производство при производството на кръвни заместители;
б) хроматографски методи. Руският учен Михаил Цвет (1903) се смята за основоположник на развитието на хроматографските методи за анализ. В момента има много разновидности от него. Методът се основава на способността на веществата да бъдат специфично адсорбирани върху адсорбент, затворен в колона или поставен върху някакъв носител. Когато това се случи, разделянето на анализираните вещества и тяхното концентриране в строго определен адсорбентен слой. След това през колоната се пропускат подходящи елуенти (разтворители), които отслабват адсорбционните сили и отмиват адсорбираните вещества от колоната. Веществата се събират във фракционния колектор.
Основно за хроматографията е коефициент на разпределение, което е равно на съотношението на концентрацията на вещество в мобилна фазана концентрацията на веществото в стационарна фаза(или стационарна фаза).
Стационарна стационарна фаза– може да бъде твърдо или течно или смес от твърдо и течно.
мобилна фаза- течен или газообразен, той протича през неподвижно, или преминава през него.
В зависимост от вида на стационарната и подвижната фаза има различни модификации на хроматографския анализ.
Адсорбция- се основава на различната степен на адсорбция на протеините от адсорбента и тяхната разтворимост в съответния разтворител.
Използваните адсорбенти са силициева киселина, Al 2 O 3 , CaCO 3 , MgO, въглен. Адсорбентът под формата на суспензия с разтворител (обикновено с буферен разтвор) се опакова в колона (стъклена вертикална тръба). Пробата се нанася върху колоната, след което през нея се пропуска разтворител или смес от разтворители.
Разделянето се основава на факта, че вещества с по-високо разпределение на К. (B) се движи по колоната с по-бърза скорост. Фракциите се събират с помощта на колектор за фракции.
Разпределителна хроматография- на базата на разпределението на смес от протеини между две течни фази. Разделянето може да се извърши върху специална хроматографска хартия, както и в колони, както при адсорбция. Твърдата фаза в този случай служи само като опора за течната неподвижна фаза. Хроматографската хартия има свойството да задържа вода между целулозните си влакна. Тази вода е неподвижна стационарна фаза. Когато неводен разтворител (подвижна фаза) се движи през хартията под действието на капилярни сили, молекулите на веществото, отложено върху хартията, се разпределят между двете фази в съответствие с техния коефициент на разпределение. Колкото по-висока е разтворимостта на веществото в подвижната фаза, толкова по-далече ще се движи по хартията заедно с разтворителя.
В случай на разпределение на хроматография върху колона, носителите са целулоза, нишесте, силикагел и др., неподвижната фаза е вода. Когато се прилагат върху колоната, веществата от сместа се движат по колоната с различни скорости, като се вземе предвид Krasp.
Rf за всяко съединение при стандартни условия е постоянна стойност.
Йонообменна хроматография - базирана на привличането на противоположно заредени частици. За това се използват различни йонообменни смоли: катионообменните смоли съдържат отрицателно заредени групи - сулфонирани стирени и CMC, които привличат положително заредени йони на изследваните вещества. Наричат се още киселинни йонообменници.
Анионобменните смоли или основните йонообменници съдържат положително заредени групи, които привличат отрицателно заредени протеинови молекули.
Триметиламиностиренът е производно на стирен и целулоза.
В зависимост от q на белтъците, които трябва да се отделят, се използват подходящи йонообменници, с които определени протеини взаимодействат, докато други свободно напускат колоната. Протеините, "утаени" върху колоната, се отстраняват с помощта на по-концентрирани физиологични разтвори или чрез промяна на рН на елуента.
Афинитетна хроматография (или афинитетна хроматография) се основава на принципа на селективно взаимодействие на протеини или други макромолекули със специфични вещества, имобилизирани върху носители - лиганди (това може да бъде коензим, ако се изолира ензим, антитяло, антиген и др. висока специфичност на протеините, имобилизираните лиганди са прикрепени към него само по един протеин на смес. Измива се с буферни смеси с променено рН или променена йонна сила.
Предимството е способността да се изолира дадено вещество с висока степен на чистота в една стъпка.
Методът на гел филтриране или методът на молекулярно сито е вид пермеационна хроматография.
Разделянето на молекулите по размер и форма се основава на свойствата на молекулярното сито, което имат много порести материали, като например органични полимери с триизмерна мрежова структура, която им придава свойствата на гелове. Гелфилтрацията е разделяне на вещества с помощта на гелове въз основа на разликите в размера на молекулите (сефароза, сефадекс, сефакрил, биогелове и др.). Под действието на епихлорхидрина полизахаридните вериги на декстрана (синтезирани от микроорганизми) се омрежват в мрежова структура, стават неразтворими във вода, но запазват висок афинитет към нея. Поради тази хидрофилност, получените зърна (наречени Sephadex) набъбват силно, за да образуват гел, който се пълни в колоната. Методът се основава на факта, че големите молекули не проникват във вътрешната водна фаза, а по-малките молекули първо проникват в порите на "ситото", сякаш са заседнали в тях и следователно се движат с по-ниска скорост. Съответно, протеини с по-висок Mr са първи, които влизат в приемника. Напоследък порьозните стъклени перли се използват все по-често като молекулярно сито в пермеационната хроматография.
Електрофоретичният метод в биохимията се основава на разликата в скоростта на движение на молекулите в електрическо поле (аминокиселини, пептиди, протеини, нуклеинови киселини).
Разликата в скоростта зависи от:
1. върху q на молекулата: колкото по-голяма е подвижността на молекулите, толкова по-голямо е общото q. Стойността q зависи от pH;
2. на размера на молекулите: колкото по-големи са молекулите, толкова по-малка е тяхната подвижност. Това се дължи на увеличаването на силите на триене и електростатичните взаимодействия на големи молекули с околната среда;
3. относно формата на молекулите: молекули с еднакъв размер, но различни форми, например фибрилите и протеиновите глобули имат различна скорост. Това се дължи на разликите в силите на триене и електростатичното взаимодействие.
Видове електрофореза
а) Изоелектрично фокусиране. Разделянето се извършва на вертикална колона в град. както pH, така и напрежение. С помощта на специални носители на амфолити се установява градушка в колоната. pH от 0 до 14. В колоната се поставя смес от вещества и се свързва електрически ток. Всеки от компонентите се придвижва до онази част на колоната, където стойността на pH съответства на нейната изоелектрична точка и спира там, тоест се фокусира.
Предимство: разделя, пречиства и идентифицира протеините в една стъпка. Методът има висока разделителна способност (0,02 pI).
б) Изотахофорезата е електрофореза върху поддържаща среда. След включване на електрическия ток йоните с най-голяма подвижност се придвижват към съответния електрод първи, а най-ниският - последният, имащ междинна подвижност - се намират в средата.
в) Дискова електрофореза – апаратът се състои от два съда с буфер – горен и долен, свързани с вертикални тръбички, съдържащи гел с различни пори. Тъй като йонизираните частици се движат под действието на електрически ток. По-висока порьозност е в горната част на гела.
г) Имуноелектрофореза - метод, съчетаващ електрофореза с имунодифузия (за откриване на антигени в сложни физиологични смеси). Смес от антигени и смес от антитела се поставят перпендикулярно един на друг върху специален носител. При включване на електрическия ток те се разделят на отделни вещества и дифундират върху гел носителя. В точката на среща на антигена със съответното антитяло се получава специфична реакция на утаяване под формата на дъга. Броят на образуваните дъги съответства на броя на антигените.
Методи за определяне на Mr протеини
При голям брой протеини химичният състав и аминокиселинната последователност не са установени (1010–1012 протеини), следователно г-н. За това се използват различни методи.
а) Метод на утаяване - определянето на Mr се извършва в специални центрофуги (първата центрофуга е предложена от шведския биохимик Сведберг), при които е възможно да се създаде центробежно ускорение, което е 200 хиляди или повече пъти по-голямо от ускорението на земната гравитация. Mr се определя от V утаяването на молекулите. Когато молекулите се движат от центъра към периферията, се образува остър интерфейс протеин-разтворител. Скоростта на утаяване се изразява чрез константата на утаяване (S):
където V е скоростта на движение на интерфейса протеин-разтворител (cm/s);
е ъгловата скорост на ротора (rad/s);
е разстоянието от центъра на ротора до средата на клетката с протеиновия разтвор (cm).
Стойността на седиментационната константа S, която е равна на 110–13 C, условно се приема за 1 и се нарича 1 Svedberg (S). S за протеини варира от 1-50 S, понякога до 100 S.
Mr на протеините се определя от уравнението на Сведберг:
където R е универсалната газова константа;
T е абсолютната температура в Келвин;
S е константата на утаяване;
D е коефициентът на дифузия;
е плътността на разтворителя;
V е частичният специфичен обем газ.
Този метод е скъп поради използването на оборудване.
По-просто и по-евтино:
б) Гел филтрация в тънък слой Sephadex.
Дължината на протеиновия път (в mm) е логаритмична на Mr.
X - Mr на желания протеин на калибровъчната графика.
в) Дискова електрофореза в полиакриламиден слой – има и връзка между логаритъма Mr на калибриращите протеини и дължината им на пътя.
Методи за определяне на хомогенността на протеините
Степента на чистота на изолирания протеин се определя от:
- ултрацентрофугиране;
- метод на дискова електрофореза;
- различни имунохимични методи;
- определянето на разтворимостта на протеина (метод на Нортроп) се основава на правилото за фазите, според което разтворимостта на чисто вещество при дадени експериментални условия зависи само от температурата, но не зависи от концентрацията на веществото в твърдата фаза.
Ако протеинът е хомогенен, тогава на графиката (a) се получава една флексия, ако има протеинови примеси (b, c), тогава ще получим няколко прегъвания на кривата на насищане. Всички протеини имат свои собствени индивидуални криви на разтворимост.
Въпроси, които се разглеждат:Методи за изолиране на органели и мембрани от тъкани, клетки.
Етапи на субклетъчно фракциониране: екстракция,
хомогенизиране и центрофугиране, техните особености.
Методи за разделяне и пречистване на субклетъчни компоненти.
Изолиране на мембранни частици.
Идентифициране на мембранни фракции, критерии за тяхното пречистване.
Мониторинг на наличието на примеси с помощта на светлина и
електронна микроскопия, липиден анализ или
определяне на активността на маркерните ензими.
Определяне на протеиновия състав в изолирана мембрана
фракции. Определяне на активността на маркерните ензими
определен тип изолирана мембранна фракция. Получаването на отделни клетъчни компоненти прави възможно изследването
тяхната биохимия и функционални характеристики. Например, можете да създадете
безклетъчна система за рибозоми, които ще синтезират протеин
според информационната РНК, дадена от експериментатора. Посветен
митохондриите при избрани условия могат да извършват синтеза на АТФ, на
изолиран хроматин с участието на подходящи ензими може
Настъпва синтез на РНК и др.
Напоследък за пресъздаване се използват системи без клетки
клетъчни супрамолекулни структури. Така че, използвайки пречистено от
гранули от жълтък, екстракти от цитоплазмата на яйца на земноводни или морски яйца
таралежи, можете да получите ядра с ядрена обвивка от въведените в това
безклетъчна система от чужда ДНК (например ДНК на бактериофага).
Такава ДНК се свързва с гастоновите протеини, които са в изобилие
такъв екстракт се образува хроматин (дезоксирибонуклеопротеин),
който е покрит с двойна мембранна обвивка, носеща равномерно
ядрени пори. Такива моделни системи помагат да се изучават фините,
интимни процеси, като транспортирането на макромолекули от цитоплазмата до
ядро и обратно. В цитоплазмените екстракти от яйца на земноводни и
При бодлокожите такива ядра могат периодично да се делят чрез митоза. Тези
моделите имат огромен принос за дешифрирането на естеството на регулацията
клетъчен цикъл. За изолиране на клетъчни органели
тестовата проба се смачква и
след това се хомогенизира в буферирана среда с
с помощта на хомогенизатор на Potter-Elwedge
(Тефлонов пестик, въртящ се в чаша
цилиндър). Това е сравнително мек метод, който
особено полезен за изолиране на лабилни
молекули и ултраструктури. Други техники за унищожаване
клетките включват ензимен лизис, който разрушава
клетъчни стени или механично разрушаване
замразени тъкани (чрез смилане или използване
въртящи се ножове; под голям натиск;
осмотичен шок; многократно редуване
замразяване и размразяване). За изолирането на непокътнати органели е важно средата, в която
се извършва хомогенизация, беше изотонична, т.е.
осмотичното налягане на буфера трябва да съответства на налягането
вътре в клетката. Ако разтворът е хипотоничен, органелите ще го направят
"попива" допълнителна вода и се спуква, и в
в хипертоничните разтвори, напротив, те се свиват.
Хомогенизирането е последвано от филтриране за отстраняване
непокътнати клетки и съединителна тъкан. Всъщност
фракционирането на клетъчните органели се извършва с помощта на
диференциално центрофугиране, т.е. центрофугиране
при различни скорости на ротора. В същото време стъпаловидно
увеличаване на центробежната сила (което обикновено се изразява
кратно на нормалното гравитационно ускорение g
= 9.81 m/s2) води до последователно отлагане на различни
органели, т.е. разделяйки ги според плътността и
размер. Един от основните методи за изолиране на клетъчни структури е
диференциално (разделително) центрофугиране. Неговият принцип
приложения в това, че времето на утаяване на частиците в хомогената зависи от тяхната
размер и плътност: колкото по-голяма е частицата или колкото е по-тежка, толкова по-бързо
ще потъне до дъното на тръбата. За да ускорите процеса на уреждане, променяйте
ускорение, генерирано от центрофугата.
При центрофугиране ядрата ще се утаят първи и при ниски ускорения
и неунищожени клетки, при 15-30 хиляди g големи частици ще се утаят,
макрозоми, състоящи се от митохондрии, малки пластиди, пероксизоми,
лизозоми и др., при 50 хил. g, микрозоми, фрагменти от вакуола
клетъчни системи.
С многократно фракционно центрофугиране на тези смесени субфракции
могат да се получат чисти фракции. И така, при разделяне на макрозомното
субфракциите получават отделно митохондрии, лизозоми, пероксизоми. В
разделяне на микрозоми, е възможно да се получи част от мембраните на апарата на Голджи,
фрагменти от плазмената мембрана, вакуоли, гранулиран ретикулум. AT
случаи на по-фино разделяне на фракциите се използва центрофугиране
градиент на плътност на захарозата, който позволява добро разделяне на компонентите,
дори леко се различават един от друг по специфично тегло. Изолирането на клетъчните органели обикновено се извършва при ниски нива
температури (0-5°C), за да се намали степента
разграждане на материала поради катализирани реакции
ензими; последните се освобождават в процес на унищожаване
тъкани. Добавянето на тиоли и хелатни агенти е необходимо за
защита на функционалните SH-групи от окисляване.
Преди изолираните фракции да се анализират биохимично
методи, е необходимо да ги проверите за чистота, като използвате
електронен микроскоп.
Получаването на отделни клетъчни компоненти го прави възможно
изучаване на тяхната биохимия и функционални характеристики. Така че е възможно
създайте безклетъчна система за рибозоми, която ще
синтезират протеин, както е посочено от експериментатора
информационна РНК. Изолираните митохондрии в съвпадащите
условия могат да извършват синтеза на АТФ, върху избрания хроматин
с участието на съответните ензими може да възникне
синтез на РНК и др. Основи на метода на центрофугиране
Частиците в разтвора се утаяват (утаяване),
когато плътността им е по-висока от плътността на разтвора, или
float (float), когато плътността им е по-ниска
плътност на разтвора. Колкото по-голяма е разликата в
плътност, толкова по-бързо се разпределят частиците.
Когато плътността на частиците и разтвора са еднакви
(изопикни условия), частиците остават
неподвижен. С малка разлика в плътността
частиците могат да се отделят само в центрофуга,
което създава центробежна сила, многократно
по-голяма от силата на гравитацията. връзка между плътността и фактора на утаяване за
различни частици в разтвор на цезиев хлорид (CsCI). Скоростта на утаяване на частиците (ν) зависи от ъгъла
скорост (ω), ефективен радиус на ротора reff (разстояние от
ос на въртене) и седиментационни свойства на частиците.
Седиментационни свойства на частица
се характеризират с коефициента на утаяване S и
се изразяват в единици на Сведберг (1S = 10-13s).
Стойността на S може да варира значително. За
сравнение на коефициентите на утаяване в различни среди
те обикновено се коригират за плътността и вискозитета на водата при
20oC (S20w).
Коефициентът на утаяване зависи от молекулното тегло
(M) частици, техните форми (коефициент на триене f),
частичен специфичен обем ΰ (реципрочен на
плътност на частиците).
Центрофугиране с градиент на плътност
Макромолекули или органели, които се различават леко по размер или плътност
могат да бъдат разделени чрез центрофугиране с градиент на плътност. За целта две
метод.
При зонално центрофугиране пробата, която трябва да бъде анализирана (напр. протеини или клетки)
наслоен на тънък слой върху буферния разтвор. По време на центрофугиране на частици
преминават през разтвора, защото тяхната плътност е по-висока от плътността на разтвора. Скорост на движение
зависи от масата и формата на частиците (вижте формулите в схема А). Спрете центрофугирането
преди частиците да достигнат дъното на епруветката за центрофуга. След това дъното се пробива и
събират редица фракции, съдържащи различни частици. Стабилност на градиента на плътност в
процесът на центрофугиране се постига чрез използване на разтвори на въглехидрати или колоиден
силикагел, чиято концентрация се увеличава от повърхността към дъното на тръбата. градиент на плътност
предотвратява образуването на конвекционни течения, които намаляват качеството на разделяне.
При изопикническо центрофугиране пробата (например ДНК, РНК или вируси) е равномерно
разпределени в целия обем на разтвора (обикновено CsCI). В този случай разделението продължава
много по-дълго, отколкото при зонално центрофугиране. Градиентът на плътност се създава в
процес на центрофугиране поради утаяване и дифузия. С течение на времето всяка частица
попада в областта, съответстваща на собствената му плаваща плътност. центрофугиране
спрете, когато се установи равновесие. Получените фракции се анализират с помощта на
подходяща техника на измерване. маркерни молекули
В процеса на фракциониране е важно
контролират чистотата на фракциите. Присъствие
в определена фракция на един или друг
органели и наличието на други компоненти
определя с помощта на маркерни молекули.
Те обикновено са специфични за органели
ензими (маркерни ензими).
Разпределение на маркерните ензими в клетката
отразява локализацията
съответните каталитични реакции. Функции и състав на биомембрани
Най-важните мембрани в животинските клетки
са плазмената мембрана, вътрешната и
външна ядрена мембрана, мембрана
ендоплазмен ретикулум и апарат на Голджи
, вътрешни и външни митохондриални
мембрани. Лизозоми, пероксизоми, различни
везикулите също са отделени от цитоплазмата с мембрани
. Растителните клетки съдържат допълнителни мембрани
хлоропласти, левкопласти и вакуоли. всичко
мембраните са полярни, т.е. има разлика в
композиции от вътрешни и външни във връзка с
слоеве цитоплазма. Биомембраните и техните компоненти изпълняват следните функции:
1. Ограничаване и изолиране на клетки и органели. Отделяне на клетки от извънклетъчни
среда се осигурява от плазмената мембрана, която предпазва клетките от
механични и химични влияния. Плазменната мембрана осигурява
също така поддържа разликата в концентрациите на метаболити и неорганични йони между
вътреклетъчна и външна среда.
2. Контролираният транспорт на метаболити и йони определя вътрешната среда, която
от съществено значение за хомеостазата, т.е. поддържане на постоянна концентрация на метаболити и
неорганични йони и други физиологични параметри. регулируеми и
селективен транспорт на метаболити и неорганични йони през пори и
чрез носители става възможно поради изолирането на клетките и
органели чрез мембранни системи.
3. Възприемане на извънклетъчни сигнали и предаването им в клетката, както и иницииране
сигнали.
4. Ензимна катализа. В мембрани на границата между липидната и водната фаза
локализирани ензими. Именно тук има реакции с неполярни
субстрати. Примери са липидната биосинтеза и метаболизма на неполярните
ксенобиотици. Най-важните енергийни реакции са локализирани в мембраните.
метаболизъм, като окислително фосфорилиране (дихателна верига) и фотосинтеза.
5. Контактно взаимодействие с междуклетъчния матрикс и взаимодействие с другите
клетки по време на клетъчно сливане и образуване на тъкан.
6. Закотвяне на цитоскелета за поддържане на формата на клетките и органели
и клетъчна подвижност. След хомогенизиране на пробата, центрофугиране на хомогената с
отделни фракции, съдържащи
клетъчни ядра, митохондрии и други органели, както и
супернатант, съдържащ разтворими
клетъчни цитозолни протеини.
Екстракция на свързани с мембраната протеини и разграждане
олигомерни протеини в протомери
Ако желаният протеин е силно свързан с някакви структури
клетки, трябва да се прехвърли в разтвор.
За прекъсване на хидрофобните взаимодействия между протеините
и мембранни липиди, детергенти се добавят към разтвора:
просто използвайте тритон Х-100 или натриев додецил сулфат.
Под действието на детергенти, хидрофобен
взаимодействия между протомери в олигомерни протеини Отстраняване на непротеиновите вещества от разтвора
Нуклеинови киселини, липиди и др
непротеиновите вещества могат да бъдат отстранени от разтвора с помощта на техния специален физико-химичен
Имоти. Така че липидите са лесни
са премахнати
от
решение
добавяне
органичен
разтворители
Например
ацетон. Въздействието обаче трябва да бъде
краткосрочен. защото ацетонът причинява
денатурация на някои протеини. нуклеинови
киселини се утаяват чрез добавяне към разтвора
стрептомицин. Изолирането на мембранните липиди се извършва веднага след получаване на мембраната
фракция, която трябва да бъде защитена от действието на протео- и липолитиците
ензими, автоокисление.
Обикновено всички процедури се извършват при ниска температура, като се поддържат определени
Стойности на pH и йонна сила. За извличане на липиди, смес от хлороформ-
метанол. За едновременно извличане на протеини и липиди от сенките на еритроцитите, техните
екстрахира се със смес бутанол-вода. В същото време повечето от протеините се превръщат в
вода и липид в бутанолния слой.
Извършва се количествен анализ на сложни смеси от фосфолипиди
хроматографски методи. За подготвителни цели те се използват главно
колонна хроматография. За успешно микроаналитични изследвания
за разделяне се използва тънкослойна хроматография
практически всички класове липиди, за да ги локализира и идентифицира при
с помощта на специални реактиви.
Разтворителите се класират според тяхната елуираща сила.
възходящ ред петролен етер, циклохексан, тетрахлорметан,
толуен, бензен, хлороформ, диетилов етер, етилацетат, ацетон, n-пропанол,
етанол, метанол, вода. След преминаване през разтворителите, плочата се изсушава за
въздух и идентифициране на липидите чрез оцветяване със специфични
реагенти. За количествено определяне на фосфолипидите се отделят
тънкослойна хроматография, използвайки спектрофотометрични методи. Мембранните изследвания са до голяма степен
мерките се основават на две основни
методически техники: това е разглобяване
нативна (тоест естествена) мембрана върху
съставните му елементи и последващи
пълно или частично сглобяване на изкуствени
мембрани, използващи всички или
части от оригиналните мембранни компоненти.
Що се отнася до мембраните, тези техники
наречена "разтворимост" и
"реконструкция". За разтваряне е по-добре да използвате детергенти с
ниска CMC, тъй като такива почистващи препарати са по-леки
вградени в мембраната и го причиняват по-бързо
разпадане до смесени мицели. В това си качество
най-ефективните йонни детергенти.
Като параметри, характеризиращи способността
детергенти за мицелизиране, обикновено
използвайте критична концентрация
мицелизация (CMC) и число на агрегиране. KKM -
е концентрацията, при която препаратът започва
образуват мицели. Преди това той е във водата
в мономерна форма в истинско състояние
решение. Обобщеното число показва колко
молекули детергент на мицел. Има четири основни метода за премахване, които най-често се използват.
детергент: диализа, гел филтрация, високо разреждане
адсорбция на разтворител и детергент върху хидрофобни полимери.
По-бърз начин се основава на премахване на препарата с
гел филтрация, когато солюбилизатът преминава през инерт
гел, чийто размер на порите е достатъчно голям, за да задържи
молекули на детергент, но малки в сравнение с получените
мембранни частици, които преминават свободно между тях
гел гранули.
С максимална пълнота, препаратът може да бъде отстранен от мембраната
чрез адсорбцията му върху хидрофобни полимери. Насам
особено добър за отстраняване на остатъци от перилни препарати
вече образувани мембранни частици. Въпреки това, за премахване
детергент от първоначалния солюбилизат, той е от малка полза, тъй като
ранни етапи на реконструкция, отстраняване на почистващ препарат може
да бъде придружено от адсорбция на значителни количества протеини и липиди
върху полимера. Следователно този метод обикновено се използва в комбинация с
с други средства на последния етап на отстраняване на почистващия препарат.
висок капацитет за съхранение, което гарантира активния им биологичен принцип.
ЛИТЕРАТУРА
1. Кличкова Г.Ю. Разработване на технология за комплексен препарат от хрущялна тъкан на калмари, сьомга и есетра // Известия на Всерос. Интернет конф. млади учени. - Владивосток: TIN-RO-Center, 2004. - С. 164-170.
2. Мецлер Д. Биохимия. Т. 2. - М., 1980. - 605 с.
3. Суховерхова Г.Ю. Биохимична характеристика на хрущялната тъкан на хидробионтите и технологията на хранителните добавки към храната: Дис. ... канд. технология Науки. - Владивосток, 2006. - 157 с.
4. Sytova M.V. Научна обосновка на комплексната обработка на амурска есетра: Реферат на дисертацията. дис. ... канд. технология Науки
М.: ВНИРО, 2005. - 24 с.
Катедра по хранителни биотехнологии
Постъпила на 07.02.07г
ИДЕНТИФИКАЦИЯ НА ПРОТЕИНОВИТЕ КОМПОНЕНТИ НА КЕРАТИНОВИЯ ЕНЗИМАТЕН ХИДРОЛИЗАТ
Ч.Ю. ШАМХАНОВ, Л.В. АНТИПОВА
Държавен нефтен институт Грозни Воронежска държавна технологична академия
Един от най-ефективните начини за преработка на вторични ресурси на месопреработвателната промишленост и птици е използването на съвременни биотехнологични методи за получаване на хранителни хидролизати. Функционалните и технологичните свойства на получените продукти зависят от биохимичния състав и молекулното тегло на неговите протеинови компоненти.
Когато се използват физикохимични методи за определяне на молекулното тегло на протеините, резултатът зависи не само от масата, но и от електрическия заряд и формата на протеиновата молекула, особено при промяна на скоростта на дифузия на протеини, скоростта на утаяване в гравитационната поле. В тази връзка при определяне на молекулните тегла на протеините е за предпочитане да се използват статистически методи, когато протеиновият разтвор е в състояние на равновесие, например при преминаването му през колона, пълна с гел.
Целта на работата е да се определи молекулното тегло М на протеиновите компоненти на кератиновия ензимен хидролизат и неговия биохимичен състав.
Методът на гел филтрация беше използван за определяне на молекулното тегло на протеиновите компоненти на кератиновия хидролизат. Sephadex v-100 (среда, диаметър на частиците 40-120 µm) беше използван с граници на фракциониране от 4000-150000 Da.
Колона с размери 46,0 х 1,9 cm се напълва със сефадекс, третиран с 0,02 М универсален буфер, рН 7,0. Върху него се нанася 1,5 cm3 разтвор на -7 mg/cm3 - кератин хидролизат и се елуира със същия универсален буфер със скорост 12 cm3/h. Събират се фракции от 3 cm3 и след това съдържанието на протеин в тях се определя спектрофотометрично върху SF-46 при 280 nm. За да се определи молекулното тегло на фракциите на кератиновия хидролизат, колоната със Sephadex беше предварително калибрирана при същите условия, като се използват няколко чисти (маркерни) протеини с известен М. Калибровъчната крива беше изградена с помощта на линейна връзка между ^M и обема
eluate Ye, освободен от колоната. В табл. 1 показва някои от физикохимичните характеристики на маркерните протеини.
маса 1
Маркер протеин M, Да 1§ m V, cm3
Лизозим 13930 4,143 54
Трипсин 25700 4,409 48
Пероксидаза 34000 4,531 45
Говежди албумин 68000 4,832 36
Син декстран 2000000 6.301 21
Водоразтворима фракция
керопептид<10000 2,845 72
Водоразтворимата фракция на кератиновия хидролизат напуска колоната в много по-малък обем от маркерния протеин лизозим с най-ниско молекулно тегло. Следователно в кератиновия хидролизат (керопептид) няма протеинови фракции с M > 13930 Da. Приблизителната маса на хидролизните продукти е под 10 000 Da, определена чрез гел филтрация върху маркерни протеини на Sephadex B-100. Линейната връзка между ^ M на протеини и обема на елуата Ye, освободен от колоната, е показана на фиг. 1. 1 (1 - син декстран; 2 - говежди албумин; 3 - пероксидаза; 4 - трипсин; 5 - лизозим; 6 - водоразтворима фракция на керопептида).
Поради отсъствието на маркерни протеини в изследвания диапазон от 10000-5000 Da, търсенето на водоразтворимата протеинова фракция е извършено с помощта на порьозни
таблица 2
M, Да Разтворими протеини и пептиди, mg/cm3 Общо пептиди и аминокиселини, µg/cm3 Тирозин, µmol/cm3 Редуциращи вещества, µg/cm3
0-10000 5,64 7337 7,835 2815
0-5000 4,21 5278 5,960 2272
% от изходното ниво 74,6 71,9 76,1 80,7
мембрани от класове UPM-100 и UAM-50 на лабораторно устройство за ултрафилтрация (CJSC NPO Tekhkon). Схемата включваше самата инсталация с 5% разтвор на керопептид, поставен върху магнитна бъркалка за постоянното му смесване. За ефективно отделяне на протеиновия разтвор в горната част на апарата под налягане се подава сгъстен въздух.Продуктите от хидролизата преминават през порести мембрани, заместени последователно в зависимост от желаното молекулно тегло на ултрафилтрата, към долната част на апарата и събрани в приемен съд. В получените ултрафилтрати се определят редица биохимични параметри, които позволяват да се оцени разпределението на хидролизните продукти по молекулно тегло (Таблица 2).
Керопептидът съдържа протеини с ниско молекулно тегло с M 5000-10000 Da. Масовата им фракция се оценява като разлика в показанията за фракции 0-10000 и 0-5000 Da и е 1,43 mg/cm3. Тази фракция също дава положителна реакция на реакцията на нинхидрин (2059 µg/cm3), тирозин (1.875 µmol/cm3) и редуциращи вещества (543 µg/cm3). Основният дял на хидролизните продукти обаче е концентриран във фракция с по-ниско молекулно тегло с М< 5000 Да, соответствующей по существующей классификации фракции пептидов. Массовая доля всех исследуемых показателей составляет более 7 0% от аналогичных значений во фракции 0-10000 Да.
По-нататъшното определяне на молекулното тегло на водоразтворимите протеинови фракции на керопептида беше извършено на Sephadex B-25 (средно, диаметър на частиците 50-150 μm), което позволява да се установи в диапазона на фракциониране от 1000-5000 да Условията на гел филтриране остават непроменени. от
Резултатите от определянето на протеина във фракциите се използват за конструиране на профил на елуиране. Във всички фракции освен протеин се определя съдържанието на нискомолекулни субстанции по нинхидриновия метод, тирозин и редуциращи вещества (RS), като се определя и количественото разпределение на протеиновите фракции. На фиг. Фигура 2 показва гел хроматограма на ензимен кератин хидролизат през Sephadex B-25 (крива 1 - протеин; 2 - нинхидрин тест; 3 - тирозин; 4 - PB).
В този случай протеинът се открива под формата на два малки пика почти в първите фракции. Масова част на протеина във фракции No 1-8 от 3-24 cm3
има доста високи стойности и възлиза на 0,12-0,18 mg/cm3 (крива 1).
По-голямата част от продукта излиза от колоната като максимален протеинов пик с обем 27 cm3 елуат (фракция № 9, по 3 cm3 елуат всяка). Масовата фракция на протеина в тази фракция е регистрирана на ниво 0,66 mg/cm3, което е 3-4 пъти по-високо в сравнение с останалите изследвани фракции.
По-нататъшното елуиране на керопептида в обемния диапазон от 36-96 cm3 разкрива три пика с намаляване на масовата фракция на протеина в тях с не повече от 0,08 mg/cm3. Пълният разтвор на керопептид се елуира в краен обем от 96 cm3.
Фракция № 9 съдържа цялото количество наличен RS, масови фракции 66 μg/cm3 (крива 4). Реакцията на нинхидрин се използва в гел хроматография за идентифициране на разпределението на продуктите на хидролизата по молекулно тегло. Установено е, че когато излишното количество нинхидрин и протеинови продукти взаимодействат със свободна MH2 група и в зависимост от броя на тези групи, е възможно да се локализира протеинът
RV, μg/cm3 175 co D 5 o l s; .7 0
100 125 X - 3 co o o. 0,5
80 § 100 2 _ п 0.4
60 1 исин, 7 sl 0,3
40 1 l 5 o - (P 2 o I- 0,2
20 25 _ 2 ai O 0.1
6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 90 96 V, см
производни чрез елуиране през Sephadex. По този начин, ниска масова фракция на нинхидрин (4–6 µg/cm3) много точно отразява количеството на свободните аминогрупи и определя наличието на високомолекулни пептиди с М 3000–5000 Da във фракции J# 1–8 (крива 2) . Известно е, че в диапазона на измерване на молекулното тегло на продуктите от хидролиза< 5000 Да входят только пептиды и аминокислоты. При больших концентрациях белка (фракция № 9) соответственно увеличивается окрашивание его свободных аминогрупп нингидрином -64 мкг/см3. Этот диапазон элюции характеризует наличие во фракциях № 8-12 среднемолекулярных пептидов с М 300-3000 Да. Определяемый с помощью маркерных белков по калибровочной кривой lg M керопептида 2,845 также указывает на его ориентировочную массу >700 Да. По-нататъшен анализ на елуиращия профил за нинхидриновата проба (фракции № 12-36) разкрива пик, който не съответства на неговата протеинова концентрация, както се наблюдава за пептидите в предишните фракции. Масовата фракция на нискомолекулните субстанции във фракция № 23 е 157 µg/cm3, което е повече от 2 пъти по-високо от това за пептидите във фракция № 9. наличието на продукти на хидролиза под формата на свободни аминокиселини в последна дроб. Принадлежността към него и аминокиселината тирозин (0,06 µmol/cm3) е още едно доказателство за изложеното положение.
По този начин, гел филтрация на кератинов хидролизат през Sephadex G-100 и G-25 показва наличието на разтворено вещество с ниско молекулно тегло в него.
моя протеин (< 10000 Да), составляющего 25% от его общего количества в гидролизате. Преобладающая часть белковых продуктов - 75% - представлена среднемолекулярными пептидами (300-3000 Да) с ориентировочной М >700 Да. В този случай протеиновите вериги съдържат 5-20 аминокиселинни остатъка. Важно е да се подчертае, че фракция № 9 едновременно дава реакции на биуретната връзка, нинхидрин, тирозин и RV. Тази характеристика предполага наличието на въглехидрати в кератиновия протеин и пряката им връзка с протеина като част от един комплекс.
ЛИТЕРАТУРА
1. Антипова Л.В., Пащенко Л.П., Шамханов Ч.Ю., Курилова Е.С. Получаване и характеризиране на хранителния кератин хидролизат // Съхранение и преработка на селскостопански суровини. - 2003. - бр.7.
2. Антипова Л.В., Шамханов Ч.Ю., Осминин О.С., Пожалова Н.А. Биохимична характеристика на процеса на ензимна хидролиза на кератинсъдържащи суровини в птицепреработвателната промишленост Изв. университети. Хранителна технология. - 2003. - бр. 5-6.
3. Антипова Л.В., Шамханов Ч.Ю., Осминин О.С. Ко -
усъвършенстване на технологията за производство на керопептид от пухови суровини // Месна промишленост. - 2004. - бр. 3. - С. 44-47.
4. Рогов И.А., Антипова Л.В., Дунченко Н.И., Жереб-цов Н.А. Химия на храната. В 2 книги. Книга. 1. Белтъчини: структура, функции, роля в храненето. - М.: Колос, 2000. - 384 с.
5. Остерман Л.А. Хроматография на протеини и нуклеинови киселини. - М.: Наука, 1985. - 536 с.
6. Кочетов G.A. Практическо ръководство по ензимология. - 2-ро изд., преработено. и допълнителни - М.: По-високо. училище, 1980. - 272 с.
Катедра Хранителни технологии Катедра Технология на месото и месните продукти
Получено 0S.02.0? г.
ТЕОРЕТИЧНО ОБОСНОВАВАНЕ НА МЕХАНИЗМА НА ЗАХРАНВАЩОТО ДЕЙСТВИЕ НА КОМПОНЕНТИТЕ НА ЕКСТРАКТИТЕ ОТ ТУШЕНЕ
С.В. ЗОЛОТОКОПОВА, И.А. ПАЛАГИНА
Астрахански държавен технически университет Астрахански клон на Саратовския държавен социално-икономически университет
Важна област на изследване през последните години е изследването на ефекта на различни хранителни добавки не само върху вкуса и аромата, но и върху увеличаването на срока на годност на хранителните продукти. От древни времена за консервиране са използвани пикантни растения, готварска сол, опушване и др. Анализът показва, че в момента димните екстракти завладяват пазара. Храните с пушен вкус са особено популярни сред населението, а традиционното пушене губи позициите си на бездимно.
Полезни за околната среда и обещаващи са екстрактите, получени при щадящи условия.
G.I. работи върху подобряването на технологията за извличане от десетилетия. Касянов - заслужил деятел на науката и технологиите на Руската федерация, заслужил изобретател на Руската федерация, доктор на техническите науки, професор, ръководител на катедрата по технология на месни и рибни продукти на Кубанския държавен технологичен университет. Научно-педагогическото училище „Теория и практика на преработката на суровини от растителен и животински произход с втечнени и сгъстени газове”, работещо при KubGTU и Краснодарския изследователски институт за съхранение и преработка на селскостопански продукти, се занимава с проблемите за повишаване на ефективността. на обработка на различни суровини, което дава възможност да се подобри качеството на продуктите, да се намалят времето за обработка и в същото време да се намалят разходите за енергия.
Протеините се идентифицират с помощта на различни системи за търсене в базите данни EMBL и Sequest, разработени в рамките на изследователските екипи. Въпреки това, търсачката Mascot се превърна в стандарт за идентифициране на протеини. Както почти всички търсачки, тя използва уеб интерфейс и самата търсачка е достъпна в Интернет, но също така може да бъде закупена и инсталирана на компютъра на потребителя.
Талисманът може да работи с различни заменяеми протеинови и геномни бази данни. Това могат да бъдат обширни публични бази данни, като NCBI или SwissProt, търговски такива, както и такива, създадени от самия потребител.
Във всички системи идентификацията се извършва според масспектрометричните данни, получени от изследователя, чрез сравняването им с известни протеинови структури.
Като се има предвид, че през последните десетилетия секвенирането на протеини по същество се свежда до секвениране на гените, които ги кодират, на практика е по-разумно протеините да се идентифицират чрез сравняване на експериментални масспектрометрични данни с известни геноми.
Съществуват различни алгоритми за идентифициране на протеини, но техните възможности са ограничени от известните към момента геноми. Въпреки че, като се има предвид, че организмите от различни видове все още имат хомоложни протеини, често е възможно да се идентифицират протеини от организми с неизвестен геном.
Различните методологични подходи към протеомичните изследвания предоставят фундаментално различни типове данни и изискват свои собствени изчислителни подходи за обработка.
Най-достъпният и високоефективен метод е методът за идентифициране чрез мас-спектрометрични пептидни карти на специфична протеолитична хидролиза. В английската литература е известен като Peptide Mass Fingerprint (PMF) Трипсинът се използва най-често като специфична протеаза. На първия етап изолираният протеин (например чрез електрофореза) се подлага на протеолитична хидролиза. В резултат на такава хидролиза се получава смес от пептиди. Като се има предвид, че се използва високо специфична протеаза, това ще бъде смес от добре дефинирани пептиди. Така че, когато използвате трипсин, протеинът ще бъде "нарязан" от аргинин и лизин.
Следващият етап е регистрацията на масовия спектър на получената смес. Резултатът е набор или списък с молекулни тегла. Той не дава никаква информация за структурата или други свойства на продуктите, методът се основава само на предположението, че това са молекулните тегла на пептидите, а тези пептиди са се образували в резултат на специфична хидролиза. Тук се крие основната идея на подхода - ако всеки протеин има собствен набор от пептиди и съответен списък с молекулни тегла, тогава е напълно възможно да се реши обратната задача - да се намери съответния протеин за получения списък с молекулни тегла. И такъв проблем наистина често е възможно да бъде решен.
По-специално, това ви позволява да направите талисман.
