Курсова робота: Високоефективна рідинна хроматографія забруднювачів природних та стічних вод. Рідкова хроматографія Вежх хроматографія для аналізу

9885 0

ВЕРХ - це рідинна колонкова хроматографія, механізми сорбції в якій можуть використовуватися різні. Фактично, ВЕРХ - це сучасна форма реалізації класичної рідинної колонкової хроматографії. Нижче перераховані деякі найбільш суттєві якісні характеристики ВЕРК:
- висока швидкість процесу, що дозволила скоротити тривалість поділу від кількох годин та доби до хвилин;
- мінімальний ступінь розмивання хроматографічних зон, що дає можливість розділяти сполуки, які лише незначно відрізняються за константами сорбції;
- високий ступінь механізації та автоматизації поділу та обробки інформації, завдяки чому колонкова рідинна хроматографія досягла нового рівня відтворюваності та точності.

Інтенсивні дослідження останніх десятиліть, величезний обсяг накопичених експериментальних даних дозволяють сьогодні говорити про класифікацію варіантів у рамках методу високоефективної рідинної хроматографії. Звичайно, при цьому залишається в силі класифікація механізму сорбції, наведена вище.

Поширена класифікація, заснована на порівняльній полярності рухомої та нерухомої фаз. При цьому розрізняють нормально-і обернено-фазову хроматографію.

Нормально-фазова хроматографія (НФХ) - такий варіант ВЕРХ, коли рухома фаза менш полярна, ніж нерухома, і є підстави вважати, що основний фактор, що визначає утримання, - це взаємодія сорбатів безпосередньо з поверхнею або обсягом сорбенту.

Зворотно-фазова хроматографія (ОФГ) - такий варіант ВЕРХ, коли рухома фаза більш полярна, ніж нерухома, і утримання визначається безпосереднім контактом молекул сорбату з поверхнею або об'ємом сорбенту; при цьому іонізовані сорбати не обмінюються на іони рухомої фази, сорбовані на поверхні.

Іонообмінна хроматографія - варіант, при якому сорбція здійснюється шляхом обміну сорбованих іонів рухомої фази на іони хроматографованих речовин; Цілком аналогічно можна визначити лігандообмінну хроматографію.

Хроматографія на динамічно модифікованих сорбентах - варіант ВЕРХ, при якому сорбат не взаємодіє безпосередньо з поверхнею сорбенту, а вступає в асоціацію з молекулами поверхневих шарів елюентів.
Іон-парна хроматографія - такий варіант звернено-фазової хроматографії іонізованих сполук, при якому в рухому фазу додається гідрофобний протиіон, що якісно змінює сорбційні характеристики системи.

Ексклюзивна хроматографія - спосіб поділу сполук за їх молекулярними масами, заснований на відмінності швидкості дифузії в порах нерухомої фази молекул різних розмірів.

Для ВЕРК дуже важливою характеристикою є величина сорбентів, зазвичай 3-5 мкм, зараз до 18 мкм. Це дозволяє розділяти складні суміші речовин швидко та повно (середній час аналізу від 3 до 30 хв).

Завдання поділу вирішується за допомогою хроматографічної колонки, яка є трубкою, заповненою сорбентом. При проведенні аналізу через хроматографічну колонку подають рідину (елюенти) певного складу з постійною швидкістю. У цей потік вводять відміряну дозу проби. Компоненти проби, введеної в хроматографічну колонку, через їхню різну спорідненість до сорбенту колонки рухаються по ній з різними швидкостями і досягають детектора послідовно в різні моменти часу.

Таким чином, хроматографічна колонка відповідає за селективність та ефективність поділу компонентів. Підбираючи різні типи колонок, можна керувати ступенем поділу аналізованих речовин. Ідентифікація з'єднань здійснюється за їхнім часом утримування. Кількісне визначення кожного компонента розраховують, виходячи з величини аналітичного сигналу, виміряного за допомогою детектора, підключеного до виходу хроматографічної колонки.

Сорбенти. Становлення ВЕРХ значною мірою пов'язане зі створенням нових поколінь сорбентів з добрими кінетичними властивостями та різноманітними термодинамічними властивостями. Основний матеріал для сорбентів у ВЕРХ-силікагель. Він механічно міцний, має значну пористість, що дає велику обмінну ємність при невеликих розмірах колонки. Найбільш ходовий розмір часток 5-10 мкм. Чим ближче до кулястої форми частинок, тим менший опір потоку, вища ефективність, особливо, якщо відсіяна дуже вузька фракція (наприклад, 7+1 мкм).

Питома поверхня силікагелю 10-600 м/р. Силікагель може бути модифікований різними хімічними групами, щепленими до поверхні (С-18, CN, NH2, SO3H), що дозволяє використовувати сорбенти на його основі для поділу різних класів сполук. Основний недолік силікагелю – мала хімічна стійкість при рН< 2 и рН >9 (кремнезем розчиняється в лугах та кислотах). Тому в даний час відбувається інтенсивний пошук сорбентів на базі полімерів, стійких при рН від 1 до 14, наприклад, на основі поліметилметакрилату, полістиролу і т.д.

Сорбенти для іонообмінної хроматографії. В силу особливостей поділу (у кислому або лужному середовищі) основний матеріал сорбентів полістирол з дивінілбензолом різного ступеня зшивки з щепленими до їх поверхні групами SO3 -H+ (сильнокислі катіонообмінники) або -СОО-Naf (слабокислі катіонообмінники), -H2N 3Cl-(сильноосновні аніонообмінники) або -N+HR2Cl-(слабоосновні аніонообмінники).

Сорбенти для гель-проникної хроматографії. Основний тип – стирол-ДВБ. Використовуються також макропористе скло, метилметакрилат, силікагель. Для іоно-ексклюзивної хроматографії використовуються самі сорбенти.
Насоси. Для забезпечення витрати рухомої фази (ПФ) через колонку із зазначеними параметрами використовуються насоси високого тиску. До найважливіших технічних характеристик насосів для ЖХ відносяться: діапазон витрати; максимальний робочий тиск; відтворюваність витрати; діапазон пульсацій подачі розчинника.

За характером подачі розчинника насоси можуть бути постійної подачі (витрати) та постійного тиску. В основному при аналітичній роботі використовується режим постійної витрати, заповнення колонок - постійного тиску. За принципом дії насоси діляться на шприцеві і плунжерні зворотно поступальні.

Шприцеві насоси Для насосів цього характерна практично повна відсутність пульсацій потоку рухомий фази під час роботи. Недоліки насоса: а) велика витрата часу та розчинника на промивання при зміні розчинника; б) припинення поділу під час заповнення насоса; в) великі габарити та вага при забезпеченні великої витрати та тиску (потрібний потужний двигун і велике зусилля поршня з його великою площею).

Плунжерні зворотно-поступальні насоси. Насоси цього типу забезпечують постійне об'ємне подання рухомої фази тривалий час. Максимальний робочий тиск 300-500 атм, витрата 0,01-10 мл/хв. Відтворюваність об'ємної подачі – 0,5 %. Основний недолік-розчинник подається в систему у вигляді серії послідовних імпульсів, тому існують пульсації тиску та потоку.

Це є основною причиною підвищеного шуму та зниження чутливості майже всіх детекторів, що застосовуються у РХ, особливо електрохімічного. Способи боротьби з пульсаціями: з використанням здвоєних насосів або двоплунжерного насоса Баг-Лаю, застосуванням демпфуючих пристроїв та електронних пристроїв.

Величина об'ємної подачі визначається трьома параметрами: діаметром плунжера (зазвичай 3,13; 5,0; 7,0 мм), його амплітудою (12-18 мм) та частотою (що залежить від швидкості обертання двигуна та редуктора).

Дозатори. Призначення дозатора полягає в перенесенні проби, що знаходиться при атмосферному тиску, на вхід колонки, що знаходиться при тиску до декількох атмосфер. Важливо, щоб у дозаторі були відсутні промивні рухомою фазою «мертві» обсяги та розмивання проби в ході дозування. Спочатку дозатори в ЖХ були аналогічні газовим з проколом мембрани. Однак більше 50-100 атм мембрани не тримають, хімічна стійкість їх недостатня, їх шматочки забруднюють фільтри колонок та капіляри.

У рідкій фазі набагато менше швидкості дифузії, ніж у газовій. Тому можна дозувати із зупинкою потоку – проба не встигає розмитися в дозаторі. На час введення дозатор проби спеціальний кран перекриває потік розчинника. Тиск на вході в стовпчик швидко знижується, через кілька секунд пробу можна вводити в камеру дозатора звичайним мікрошприцом. Далі дозатор замикається, включається потік розчинника, йде розподіл.

Тиск, який утримує цей кран, до 500-800 атм. Але при зупинці потоку порушується рівновага в колонці, що може призводити до появи вакантних додаткових піків.

Найбільшого поширення набули петлеві дозатори. При заповненні дозатора під високим тиском виявляються входи 1,2 канал між ними. Входи 3-6, канали між ними і петля, що дозує, виявляються під атмосферним тиском, що дозволяє заповнити петлю за допомогою шприца або насоса. При повороті дозатора потік рухомої фази витісняє пробу колонку. Для зниження похибки петля промивається 5-10-кратним обсягом проби. Якщо проби мало, її можна ввести в петлю мікрошприцом. Об'єм петлі зазвичай 5-50 мкл.

Н.А. Воїнів, Т.Г. Волова

У високоефективній рідинній хроматографії (ВЕРХ) характер процесів, що відбуваються в хроматографічній колонці, загалом ідентичний з процесами в газовій хроматографії. Відмінність полягає лише у застосуванні як нерухомої фази рідини. У зв'язку з високою щільністю рідких рухомих фаз та великим опором колонок газова та рідинна хроматографія сильно розрізняються за апаратурним оформленням.

У ВЕРХ як рухливі фази зазвичай використовують чисті розчинники або їх суміші.

Для створення потоку чистого розчинника (або сумішей розчинників), званого рідинної хроматографії елюентом, використовуються насоси, що входять в гідравлічну систему хроматографа.

Адсорбційна хроматографія здійснюється внаслідок взаємодії речовини з адсорбентами, такими як силікагель або оксид алюмінію, що мають на поверхні активні центри. Відмінність здатність до взаємодії з адсорбційними центрами різних молекул проби призводить до їх поділу на зони у процесі руху з рухомою фазою по колонці. Досяжний при цьому поділ зон компонентів залежить від взаємодії як з розчинником, так і з адсорбентом.

Найбільше застосування у ВЕРХ знаходять адсорбенти із силікагелю з різним об'ємом, поверхнею та діаметром пор. Значно рідше використовують оксид алюмінію та інші адсорбенти. Основна причина цього:

недостатня механічна міцність, що не дозволяє упаковувати та використовувати при підвищених тисках, характерних для ВЕРХ;

силікагель порівняно з оксидом алюмінію має ширший діапазон пористості, поверхні та діаметра пор;Значно більша каталітична активність оксиду алюмінію призводить до спотворення результатів аналізу внаслідок розкладання компонентів проби чи його незворотній хемосорбції.

Детектори для ВЕРХ

Високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ) використовується для детектування полярних нелетючих речовин, які з будь-яких причин не можуть бути переведені у зручну форму для газової хроматографії, навіть у вигляді похідних. До таких речовин, зокрема, відносять сульфонові кислоти, водорозчинні барвники та деякі пестициди, наприклад, похідні феніл - сечовини.

Детектори:

УФ – детектор на діодній матриці. «Матриця» фотодіодів (їх більше двохсот) постійно реєструє сигнали в УФ- та видимій області спектру, забезпечуючи таким чином запис УФ-В-спектрів у режимі сканування. Це дозволяє безперервно знімати при високій чутливості неспотворені спектри компонентів, що швидко проходять через спеціальний осередок.

Порівняно з детектуванням на одній довжині хвилі, яке не дає інформації про «чистоту» піку, можливості порівняння повних спектрів діодної матриці забезпечують отримання результату ідентифікації з більшою мірою достовірності.

Флуоресцентний детектор.Велика популярність флуоресцентних детекторів пояснюється дуже високою селективністю і чутливістю, і тим, що багато забруднювачів навколишнього середовища флуоресцують (наприклад, поліароматичні вуглеводні).

Електрохімічний детекторвикористовуються для детектування речовин, які легко окислюються або відновлюються: феноли, меркаптани, аміни, ароматичні нітро- та галогенпохідні, кетони альдегіди, бензидини.

Хроматографічне поділ суміші на колонці внаслідок повільного просування ПФ займає багато часу. Для прискорення процесу хроматографування проводять під тиском. Цей метод називають високоефективною рідинною хроматографією (ВЖХ)

Модернізація апаратури, що застосовується в класичній рідинній колонковій хроматографії, зробила її одним з перспективних і сучасних методів аналізу. Високоефективна рідинна хроматографія є зручним способом поділу, препаративного виділення та проведення якісного та кількісного аналізу нелетких термолабільних сполук як з малою, так з великою молекулярною масою.

Залежно від типу сорбенту, що застосовується в даному методі використовують 2 варіанти хроматографування: на полярному сорбенті з використанням неполярного елюенту (варіант прямої фази) і на неполярному сорбенті з використанням полярного елюенту - так звана звернено-фазова високоефективна рідинна хроматографія (ОфВЖХ).

При переході елюентів до елюентів рівновага в умовах ОфВЖХ встановлюється набагато швидше, ніж в умовах полярних сорбентів і неводних ПФ. Внаслідок цього, а також зручності роботи з водними та водно-спиртовими елюентами, ОфВЖХ набула нині великої популярності. Більшість аналізів за допомогою ВРХ проводять саме цим методом.

детектори.Реєстрація виходу з колонки окремого компонента провадиться за допомогою детектора. Для реєстрації можна використовувати зміну будь-якого аналітичного сигналу, що йде від рухомої фази та пов'язаного з природою та кількістю компонента суміші. У рідинній хроматографії використовують такі аналітичні сигнали, як світлопоглинання або світловиділення вихідного розчину (фотометричні та флуориметричні детектори), показник заломлення (рефрактометричні детектори), потенціал та електрична провідність (електрохімічні детектори) та ін.

Безперервно детектується сигнал реєструється самописцем. Хроматограма являє собою зафіксовану на стрічці самописця послідовність сигналів детектора, що виробляються при виході з колонки окремих компонентів суміші. У разі поділу суміші на зовнішній хроматограмі видно окремі піки. Положення піку на хроматограмі використовують для ідентифікації речовини, висоту або площу піку - для цілей кількісного визначення.

Вступ.

Бурхливий розвиток рідинної хроматографії в останні 10 років зумовлено, головним чином, інтенсивною розробкою теоретичних основ та практичним використанням її високоефективного варіанту, а також створенням та промисловим випуском необхідних сорбентів та апаратури.

Відмінною особливістю високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) є використання сорбентів з розміром зерен 3-10 мкм, що забезпечує швидке масоперенесення при дуже високій ефективності поділу.

Нині ВЕРХ за темпами розвитку вийшла перше місце серед інструментальних методів, обігнавши навіть газову хроматографію. Найважливіша перевага ВЕРХ у порівнянні з газовою хроматографією - можливість дослідження практично будь-яких об'єктів без будь-яких обмежень щодо їх фізико-хімічних властивостей, наприклад, за температурами кипіння або молекулярною масою.

Сьогодні ВЕРХ є добре оформленим інструментальним методом, який широко застосовують у найрізноманітніших галузях науки і техніки. Особливо велике його значення у таких найважливіших областях, як біохімія, молекулярна біологія, контроль забруднень навколишнього середовища, а також у хімічній, нафтохімічній, харчовій та фармацевтичній промисловості.

оскільки необхідно враховувати низку вельми специфічних вимог, зумовлених такими особливостями методики.

а. Колонки для ВЕРХ наповнюють носієм із дуже малим діаметром частинок. В результаті, при таких об'ємних швидкостях розчинника, які необхідні для швидкого поділу проби, на колонці створюється високий тиск.

б. Детектори, що застосовуються у ВЕРХ, чутливі до флуктуації потоку та тиску елюенту (шуми). Більш того, при застосуванні концентраційних детекторів потрібна ще більш висока стабільність об'ємної швидкості елюентів.

в. Процес хроматографічного поділу супроводжується низкою антагоністичних ефектів, так, наприклад, диспергування зразка в рухомій фазі веде до змішування компонентів, що розділяються, і знижує максимальну концентрацію речовини в елююваному піку (у детекторі). Диспергування спостерігається усім ділянках системи від точки введення проби до детектора.

р. Розчинники, які виконують роль рухомої фази, часто здатні викликати корозію апаратури. Це в першу чергу відноситься до розчинників, що використовуються в обернено-фазовій хроматографії, яка переважна в біохімічних додатках ВЕРХ.

Специфіку ВЕРХ як інструментальної методики необхідно враховувати у процесі розробки, створення та експлуатації цих систем. Для створення комерційних зразків хроматографічних систем та їх компонентів, досить надійних, простих і безпечних у роботі з прийнятним співвідношенням між ціною та технічними характеристиками, знадобилося понад десять років пошуків та досліджень. тенденції до зменшення колонок (як довжини, так і діаметра), що намітилися останнім часом, змушують пред'являти нові вимоги до інструментів.

1.1. ЕФЕКТИВНІСТЬІСЕЛЕКТИВНІСТЬ

Хроматографія - це метод поділу компонентів суміші, заснований на відмінності в рівноважному розподілі їх між двома фазами, що не змішуються, одна з яких нерухома, а інша рухлива. Компоненти зразка рухаються по колонці, коли вони знаходяться в рухомій фазі, і залишаються на місці, коли знаходяться в нерухомій фазі Чим більше спорідненість компонента до нерухомої фази і чим менше - до рухомої, тим повільніше він рухається по колонці і тим довше в ній утримується. прийнятний проміжок часу суміші на окремі смуги (піки) компонентів у міру їхнього просування по колонці з рухомою фазою.

З цих загальних уявлень ясно, що хроматографічне поділ можливе, тільки в тому випадку, якщо компоненти зразка, потрапляючи в колонку при введенні проби, по-перше, будуть розчинені в рухомій фазі і, по-друге, взаємодіятимуть (утримуватись) з нерухомою фазою . Якщо при введенні проби якісь компоненти знаходяться не у вигляді розчину, вони будуть відфільтровані і не братимуть участь у хроматографічному процесі. Так само компоненти, що не взаємодіють з нерухомою фазою, пройдуть через колонку з рухомою фазою, не поділяючись на компоненти.

Приймемо умову, що якісь два компоненти розчиняються в рухомій фазі і взаємодіють з нерухомою фазою, тобто хроіатографічний процес може протікати без порушень. У цьому випадку після проходження суміші через колонку можна отримати хроматограми виду а, бабо в(Рис. 1.1). Ці хроматограми ілюструють хроматографічні поділи, що відрізняються ефективністю. (аі б) при рівній селективності та селективністю (бі в)за рівної ефективності.

Ефективність колонки тим вище, що вже пік виходить за того ж часу утримування. Ефективність колонки вимірюється кількістю теоретичних тарілок (ЧТТ) N: чим вище еф-

Рис. 1.2. Параметри хроматографічного піку та розрахунок числа теоретичних тарілок:

t R - час утримання піку; h - Висота піка; Wj/j – ширина піка на половині його висоти

Рис. 1.1. Вид хроматограми в залежності від ефективності та селективності колонки:

а- нормальна селективність, знижена ефективність (менше теоретичних тарілок); б - звичайні селективність та ефективність; в -нормальна ефективність, підвищена селективність (більше відношення часів утримання компонентів)

ефективність, тим більше ЧТТ, тим менше розширення піку спочатку вузької смуги в міру проходження її через колонку, тим пік на виході з колонки. ЧТТ характеризує число ступенів встановлення рівноваги між рухомою та нерухомою фазами.

Знаючи число теоретичних тарілок, що припадає на колонку, та довжину колонки L (мкм), а також середній діаметр зерна сорбенту d c (мкм), легко отримати значення висоти, еквівалентної теоретичної тарілці (ВЕТТ), а також наведеної висоти, еквівалентної теоретичної тарілці (ПВЕТТ):

ВЕТТ = L/ N

ПВЕТ = B3TT/d c.

Маючи значення ЧТТ, ВЕТТ та ПВЕТ, можна легко порівнювати ефективність колонок різних типів, різної довжини, заповнених різними за природою та зерном сорбентами. Порівнюючи ЧТТ двох колонок однієї довжини, порівнюють їхню ефективність. При порівнянні ВЕТТ порівнюють колонки з сорбентами однакового збіжжя, що мають різну довжину. Нарешті, величина ПВЕТ дозволяє для двох будь-яких колонок оцінити якість сорбенту, по-перше, і якість заповнення колонок, по-друге, незалежно від довжини колонок, зернення сорбентами його природи.

Селективність колонки грає велику роль досягненні хроматографічного поділу.

Селективність колонки залежить від багатьох факторів, і мистецтво експериментатора великою мірою визначається вмінням впливати на селективність поділу. Для цього в руках хроматографіста знаходяться три дуже важливі фактори: вибір хімічної природи сорбенту, вибір складу розчинника та його модифікаторів та облік хімічної структури та властивостей компонентів, що розділяються. Іноді помітний вплив на селективність має зміна температури колонки, що змінює коефіцієнти розподілу речовин між рухомою та нерухомою фазами.

При розгляді поділу двох компонентів на хроматограмі та його оцінці важливим параметром є дозвіл R s, яке пов'язує часи виходу і ширину піків обох компонентів, що розділяються.

Роздільна здатність як параметр, що характеризує поділ піків, збільшується в міру зростання селективності, що відображається зростанням чисельника, і зростання ефективності, що відображається зниженням значення знаменника через зменшення ширини піків. Тому швидкий прогрес рідинної хроматографії призвів до зміни поняття «рідинна хроматографія високого тиску» - воно було замінено на «рідинну хроматографію високої роздільної здатності» (при цьому скорочений запис терміна англійською мовою зберігся HPLC як найбільш правильно характеризує напрямок розвитку сучасної рідинної хроматографії).

Таким чином, розмивання в колонці зменшується і ефективність підвищується, коли використовують дрібніший сорбент, більш рівномірний за складом (вузька фракція), більш щільно і рівномірно упакований у колонці, при використанні більш тонких шарів щепленої фази, менш в'язких розчинників і оптимальних швидкостей потоку.

Однак поряд з розмиванням смуги хроматографічної зони в процесі поділу в колонці може відбуватися також і розмивання її в пристрої для введення проби, в сполучних капілярах інжектор - колонка і колонка - детектор, в осередку детектора і в деяких допоміжних пристроях (мікрофільтри для уловлювання проби, що встановлюються після інжектора, передколонки, реактори-змійовики та ін.)- Розмивання при цьому тим більше, чим більший позаколоночний обсяг у порівнянні з утримуваним обсягом піку. Має також значення і те, де знаходиться мертвий об'єм: чим вже хроматографічна покликання, тим більше розмивання дасть мертвий об'єм. Тому особливу увагу слід приділяти конструюванню тієї частини хроматографа, де хроматографічна зона найбільш вузька (інжектор та пристрої від інжектора до колонки) - тут позаколоночне розмивання є найбільш небезпечним і позначається найбільш сильно. Хоча вважається, що у добре сконструйованих хроматографах джерела додаткового позаколонкового розмивання повинні бути зведені до мінімуму, проте кожен новий прилад, кожна переробка хроматографа повинні обов'язково закінчуватися тестуванням на колонці та порівнянням отриманої хроматограми з паспортною. Якщо спостерігається спотворення піку, різке зниження ефективності, слід ретельно проінспектувати нововведені до системи капіляри та інші пристрої.

Розмивання поза колонкою і його неправильна оцінка можуть призвести до значної (більше 50%) втрати ефективності, особливо в тих випадках, коли відносно давно сконструйовані хроматографи намагаються використовувати для високошвидкісного ВЕРХ, мікроколонкової ВЕРХ та інших варіантів сучасної ВЕРХ, що потребують мікроінжекторів, сполучних капілярів діаметром 0,05-0,15 мм мінімальної довжини, колонок місткістю 10-1000 мкл, детекторів з мікрокюветами ємністю 0,03-1 мкл та з високою швидкодією, високошвидкісних самописців та інтеграторів.

1.2. УТРИМАННЯ І СИЛА РОЗЧИНАЧА

Для того, щоб аналізовані речовини поділялися на колонці, як уже згадувалося вище, коефіцієнт ємності k" повинен бути більше 0, тобто речовини повинні утримуватися нерухомою фазою, сорбентом. Однак коефіцієнт ємності не повинен бути занадто великим, щоб отримати прийнятний час елюювання. Якщо для даної суміші речовин вибрано нерухому фазу, яка їх утримує, то подальша робота з розробки методики аналізу полягає у виборі такого розчинника, який забезпечив би в ідеальному випадку різні для всіх компонентів, але прийнятно не дуже великі k". Цього добиваються, змінюючи елюювальну силу розчинника.

У разі адсорбційної хроматографії на силікагелі або оксиді алюмінію, як правило, силу двокомпонентного розчинника (наприклад, гексану з добавкою ізопропанолу) збільшують, збільшуючи вміст полярного компонента (ізопропанолу), або ж зменшують, зменшуючи вміст ізопропанолу. Якщо вміст полярного компонента стає занадто малим (менше 0,1%), слід замінити його більш слабким за елюювальною силою. Так само надходять, замінюючи на інші або полярну, або неполярну складову і в тому випадку, якщо дана система не забезпечує бажаної селективності по відношенню до компонентів суміші, що цікавлять. При підборі систем розчинників беруть до уваги як розчинності компонентів суміші, так і елюотропні ряди розчинників, складені різними авторами.

Приблизно так само підбирають силу розчинника у разі використання щеплених полярних фаз (нітрил, аміно, діол, нітро та ін), враховуючи можливі хімічні реакції та виключаючи небезпечні для фази розчинники (наприклад і кетони для амінофази).

У разі звернено-фазної хроматографії силу розчинника збільшують, підвищуючи вміст в елюенті органічної складової (метанолу, ацетонітрилу або ТГФ) та зменшують, додаючи більше води. Якщо не вдається досягти бажаної селективності, використовують іншу органічну складову або намагаються змінити її за допомогою різних добавок (кислот, ион-парних реагентів та ін.).

При поділах методом іонообмінної хроматографії силу розчинника змінюють, збільшуючи або зменшуючи концентрацію буферного розчину або змінюючи рН, у деяких випадках використовують модифікацію органічними речовинами.

Однак, особливо у разі складних природних і біологічних сумішей, часто не вдається підібрати силу розчинника таким чином, щоб усі компоненти проби елюювалися за прийнятний термін. Тоді доводиться вдаватися до градієнтного елюювання, тобто використовувати розчинник, що елюює сила якого в процесі аналізу змінюється так, що вона постійно збільшується за заздалегідь заданою програмою. Таким прийомом вдається домогтися елюювання всіх компонентів складних сумішей за короткий проміжок часу та їх поділу на компоненти у вигляді вузьких піків.

1.3. РОЗМІР ЧАСТОК СОРБЕНТУ, ПРОНИЦЬКІСТЬ І ЕФЕКТИВНІСТЬ

Розглядаючи розмивання у колонці, ми вказували, що ефективність колонки (ВЕТТ) залежить від розміру частинок сорбенту. У великій мірі бурхливий розвиток ВЕРХ за останні 10-12 років було обумовлено, по-перше, розробкою способів одержання сорбентів з розміром частинок від 3 до 10 мкм і з вузьким фракційним складом, що забезпечують високу ефективність при хорошій проникності, по-друге, розробкою способів заповнення цими сорбентами колонок і, по-третє, розробкою та серійним випуском рідинних хроматографів, що мають розраховані на високі тиски насоси, інжектори та детектори з кюветами малого обсягу, здатні реєструвати піки малого обсягу.

Для добре упакованих суспензійним способом колонок наведена висота, еквівалентна теоретичній тарілці (ПВЕТТ), може становити 2 незалежно від того, чи для упаковки використовували частинки з розміром 3, 5, 10 або 20 мкм. І тут отримаємо відповідно колонки (при стандартної довжині їх 250 мм) ефективністю 41670, 25000, 12500 і 6250 т.т. Здається природним вибрати найефективнішу колонку, заповнену частинками розміром 3 мкм. Однак за цю ефективність доведеться заплатити використанням при роботі дуже високого тиску і відносно невисокою швидкістю поділу, так як наявний насос, швидше за все, буде прокачувати через таку колонку розчинник з високою об'ємною швидкістю. Тут ми якраз і стикаємося з питанням зв'язку розміру частинок сорбенту, ефективності та проникності колонок.

Якщо висловити звідси фактор опору колонки - безрозмірну величину, отримаємо наступне рівняння:

Фактор опору для колонок, упакованих мікрочастинками одного виду по тому самому способу, змінюється незначно і становить наступні значення:

Вигляд часток ».... Неправильна Сферична

форма форма

Сухе упакування. . . . . 1000-2000 800-1200

Суспензійна упаковка. . . 700-1500 500-700

Тиск на вході в колонку пропорційно лінійній швидкості потоку, фактору опору колонки, в'язкості розчинника та довжині колонки і обернено пропорційно квадрату діаметра частинок.

Застосувавши цю залежність для описаних вище колонок з частинками діаметром 3, 5, 10 і 20 мкм і припустивши постійними лінійну швидкість потоку, фактор опору колонки і в'язкість розчинника, отримаємо для колонок рівної довжини співвідношення тисків на вході 44:16:4:1. Таким чином, якщо для обернено-фазного сорбенту з розміром частинок 10 мкм при використанні систем розчинників метанол - . вода (70:30) зазвичай на стандартній колонці при витраті розчинника 1 мл/хв тиск на вході в колонку становить 5 МПа, то частинок 5 мкм - 20 МПа і для 3 мкм - 55 МПа. При використанні силікагелю і менш в'язкої системи розчинників гексан - ізопропанол (100:2) значення будуть значно нижчими: відповідно 1, 4 та 11 МПа. Якщо у разі звернено-фазного сорбенту застосування часток розміром Змкм дуже проблематично, а 5 мкм можливо, але не на всіх приладах, то для нормально-фазного проблем із тиском не виникає. Слід зазначити, що з сучасної швидкісної ВЕРХ характерне використання вищої витрати розчинників, ніж у вищерозглянутому прикладі, тому вимоги до тиску зростають ще більше.

Однак у тих випадках, коли для поділу потрібна певна кількість теоретичних тарілок і бажано здійснити швидкісний аналіз, картина дещо змінюється. Оскільки довжини колонок із сорбентами зерненням 3, 5, 10 мкм при рівній ефективності будуть відповідно 7,5; 12,5 і 25 см, то співвідношення тисків на вході в колонки зміниться доЗ,3:2:1. Відповідно, тривалість аналізу на таких колонках рівної ефективності буде співвідноситися як 0,3:0,5:1, тобто при переході від 10 до 5 і 3 мкм тривалість аналізу скоротиться в 2 і 3,3 рази. За це прискорення аналізу доводиться розплачуватись пропорційно вищим тиском на вході в колонку.

Наведені дані справедливі для тих випадків, коли сорбенти різного зернення мають однакові криві розподілу частинок за розміром, колонки набиті однаковим способом та мають однаковий фактор опору колонки. Слід пам'ятати, що труднощі отримання вузьких фракцій сорбенту зростає у міру зменшення розміру частинок і що. фракції від різних виробників мають різний склад фракції. Тому фактор опору колонок змінюватиметься в залежності від зернення, типу сорбенту, способу упаковки колонок та ін.

КЛАСИФІКАЦІЯ МЕТОДІВ ВЕРХ З МЕХАНІЗМУ РОЗДІЛУ

Більшість поділів, що проводяться методом ВЕРХ, засновано на змішаному механізмі взаємодії речовин з сорбентом, що забезпечує більше або менше утримування компонентів у колонці. Механізми поділу у більш менш чистому вигляді на практиці зустрічаються досить рідко, наприклад, адсорбційний при використанні абсолютно безводного силікагелю і безводного гексану для поділу ароматичних вуглеводнів.

При змішаному механізмі утримування для речовин різної будови та молекулярної маси можна оцінити внесок у утримання адсорбційного, розподільчого, ексклюзивного та інших механізмів. Однак для кращого розуміння та уявлення про механізми поділу у ВЕРХ доцільно розглядати поділи з переважанням того чи іншого механізму, що відносяться до певного виду хроматографії, наприклад, іонообмінної хроматографії.

2.1.1 АДСОРБЦІЙНА ХРОМАТОГРАФІЯ

Поділ методом адсорбційної хроматографії здійснюється в результаті взаємодії речовини з адсорбентами, такими як силікагель або оксид алюмінію, що мають на поверхні активні центри. Відмінність у здатності до взаємодії з адсорбційними центрами різних молекул проби призводить до їхнього поділу на зони в процесі руху з рухомою фазою по колонці. Поділ зон компонентів, що досягається при цьому, залежить від взаємодії як з розчинником, так і з адсорбентом.

В основі сорбції на поверхні адсорбенту, що має гід-роксильні групи, лежить специфічна взаємодія між полярною поверхнею адсорбенту та полярними (або здатними поляризуватися) групами або ділянками молекул. До таких взаємодій відносять диполь-дипольну взаємодію між постійними або індукованими диполями, утворення водневого зв'язку аж до утворення я-комплексів або комплексів з перенесенням заряду. Можливим і досить частим у практичній роботі є прояв хемосорбції, яка може призвести до значного підвищення часу утримання, різкого зниження ефективності, появи продуктів розкладання або незворотної сорбції речовини.

Ізотерми адсорбції речовин мають лінійну, опуклу або увігнуту форму. При лінійній ізотермі адсорбції пік речовини симетричний і час утримування залежить від розміру проби. Найчастіше ізотерми адсорбції речовин нелінійні і мають опуклу форму, що призводить до деякої асиметрії піку з утворенням хвоста.

Найбільше застосування у ВЕРХ знаходять адсорбенти із силікагелю з різним обсягом пор, поверхнею, діаметром пор. Значно рідше використовують оксид алюмінію і вкрай рідко-інші адсорбенти, що широко застосовуються в класичній колонковій і тонкошаровій хроматографії. Основна причина цього - недостатня механічна міцність більшості інших адсорбентів, що не дозволяє упаковувати їх використовувати при підвищених тисках, характерних для ВЕРХ.

Полярні групи, що зумовлюють адсорбцію та знаходяться на поверхні силікагелю та оксиду алюмінію, за властивостями близькі. Тому зазвичай порядок елюювання сумішей речовин та елюотропний ряд розчинників для них однакові. Однак відмінність хімічної будови силікагелю та оксиду алюмінію іноді призводить до появи відмінностей у селективності- тоді перевагу віддають тому чи іншому адсорбенту, більш підходящому для даної конкретної задачі. Наприклад, оксид алюмінію забезпечує більшу вибірковість при поділі деяких багатоядерних ароматичних вуглеводнів.

Перевага, що віддається зазвичай силікагелю в порівнянні з оксидом алюмінію, пояснюється ширшим вибором си-лікагелів по пористості, поверхні і діаметру пор, а також значно більш високою каталітичною активністю оксиду алюмінію, нерідко призводить до спотворення результатів аналізу внаслідок розкладання компонентів проби або їх .

2.1.2 Недоліки адсорбційної хроматографії, що обмежують її використання

Популярність адсорбційної хроматографії в міру розвитку методу ВЕРХ поступово падала, вона все більше замінювалася і продовжує замінюватися на інші варіанти, такі, як обернено-фазна і нормально-фазна ВЕРХ на сорбентах з щепленою фазою. Які недоліки адсорбційної хроматографії призвели до цього?

Насамперед, це велика тривалість процесів врівноваження адсорбентів з розчинниками, що містять воду в мікрокількостях, труднощі приготування таких розчинників з певною та відтворюваною вологістю. З цього випливає погана відтворюваність параметрів утримування, роздільної здатності, селективності. З цієї ж причини неможливо використовувати градієнтне елюювання - повернення до початкового стану настільки тривале, що значно перевищує виграш часу за рахунок використання градієнта.

Істотні недоліки адсорбентів, особливо оксиду алюмінію, пов'язані з частими випадками перегрупувань чутливих до каталізу сполук, їх розкладання, незворотної сорбції, також загальновідомі і неодноразово відзначати в літературі. Необоротно сорбуються речовини, накопичуючись на початковій ділянці колонки, змінюють природу сорбенту, можуть призвести до підвищення опору колонки або навіть до повного забивання. Останній недолік може бути усунений шляхом використання передколонки, яка по-мірою підвищення опору та забиття замінюється на нову* або перезаповнюється новим сорбентом. Однак незворотна сорбція, що має місце і в цьому випадку, призводить до отримання хроматограми, на якій повністю або частково відсутні чутливі до сорбції або каталітичного розкладання компоненти проби.

2.2. РОЗПОДІЛЬНА ХРОМАТОГРАФІЯ

Розподільна хроматографія - це варіант ВЕРХ, в якому поділ суміші на компоненти здійснюється за рахунок відмінності їх коефіцієнтів розподілу між двома фазами, що не змішуються: розчинником (рухлива фаза) і фазою на сорбенті (нерухома фаза). Історично першими були сорбенти такого типу, які отримували нанесенням рідких фаз (оксидипропіонітрилу, парафінової олії та ін.) на пористі носії, аналогічно тому, як готували та готують сорбенти для газорідинної хроматографії (ГЖХ). Однак відразу ж виявились і недоліки таких сорбентів, основним з яких було відносно швидке змивання фази носія. За рахунок цього кількість фази в колонці поступово зменшувалася, часи утримування також зменшувались, на початковій ділянці колонки з'являлися не покриті фазою центри адсорбції, що викликали утворення хвостів піків. З цим недоліком боролися, насичуючи розчинник нанесеною фазою ще до його влучення в колонку. Винесення також зменшувався, коли використовували більш в'язкі та менш розчинні полімерні фази, проте в цьому випадку через утруднення дифузії з товстих полімерних плівок ефективність колонок помітно знижувалася.

Логічним виявилося прищепити хімічними зв'язками рідку фазу до носія в такий спосіб, щоб віднесення її став фізично неможливий, т. е. перетворити носій і фазу в одне ціле- так званий привито-фазний сорбент.

Надалі зусилля дослідників були спрямовані на пошук реагентів, щеплення яких протікало досить швидко і повно, а зв'язки, що утворилися, були максимально стійкими. Такими реагентами стали алкілхлорсилани та їх похідні, що дозволили за подібною технологією отримувати привито-фазні сорбенти різного типу та з різними як полярними, так і неполярними групами на поверхні.

Успішне застосування сорбентів останнього типу для ВЕРХ сприяло зростанню їх виробництва різними виробниками. Кожна фірма виробляла такі сорбенти, як правило, на основі свого виду силікагелю та за своєю технологією, яка зазвичай становить «ноу-хау» виробництва. В результаті велика кількість сорбентів, що називаються хімічно абсолютно однаково (наприклад, силікагель з щепленим октадецилсиланом), мають хро-матографічні характеристики, що дуже сильно відрізняються. Це пов'язано з тим, що силікагель може мати пори ширшу або вже, різну поверхню, пористість, його поверхня до щеплення може гідроксилюватися або ні, щеплюватися можуть моно-, ді-або трихлорсила-ни, умови щеплення можуть давати мономерний, полімерний або змішаний шар фази, що використовуються різні методи видалення залишків реагентів, може використовуватися або не використовуватись додаткова дезактивація силанольних та інших активних груп.

Складність технології щеплення реагентів і підготовки сировини і матеріалів, її багатостадійність призводять до того, що навіть отримані за однією технологією до однієї фірми-виробника партії сорбентів можуть мати кілька різні хроматографічні характеристики. Особливо це стосується тих випадків, коли такі сорбенти використовують для аналізу багатокомпонентних сумішей, що містять речовини, що помітно розрізняються за кількістю та положенням функціональних груп, за * родом функціональності.

Враховуючи вищезазначене, завжди слід прагнути до того, щоб при використанні описаної в літературі методики аналізу застосовувати саме цей сорбент і ті ж умови роботи. І тут ймовірність того, що роботу не вдасться відтворити, є мінімальною. Якщо ж такої можливості немає, а береться сорбент іншої фірми з аналогічною щепленою фазою, потрібно бути готовим до того, що буде потрібна тривала робота з переробки методики. При цьому існує ймовірність (і її слід враховувати), що на цьому сорбенті навіть після тривалої розробки можна не домогтися необхідного поділу. Наявність у літературі багатьох описаних методик поділу на давно вироблених старих сорбентах стимулює їхнє подальше виробництво та застосування з цієї причини. Однак у тих випадках, коли доводиться переходити до розробки оригінальних методик, особливо стосовно речовин, схильних до розкладання, хемосорбції, перегрупування, доцільно починати роботу на сорбентах, розроблених останнім часом і що випускаються за> новими, поліпшеними варіантами технології. Нові сорбенти мають більш однорідний фракційний склад, більш однорідне та повне покриття поверхні щепленою фазою, досконаліші остаточні стадії обробки сорбентів.

2.3. ІОНООБМІННА ХРОМАТОГРАФІЯ

В іонообмінній хроматографії поділ компонентів суміші досягається за рахунок оборотної взаємодії речовин, що іонізуються, з іонними групами сорбенту. Збереження електронейтральності сорбенту забезпечується наявністю здатних до іонного обміну протиіонів, розташованих у безпосередній близькості до поверхні. Іон введеного зразка, взаємодіючи з фіксованим зарядом сорбенту, обмінюється із протиіоном. Речовини, що мають різну спорідненість до фіксованих зарядів, поділяються на аніонітах або на катеонітах. Аніоніти мають на поверхні позитивно заряджені групи і сорбують з рухомої фази аніони.

В якості рухомої фази використовують водні розчини солей кислот, основ і розчинники типу рідкого аміаку, тобто системи розчинників, що мають високе значення діелектричної проникності е і велику тенденцію іонізувати з'єднання.Зазвичай працюють з буферними розчинами, що дозволяють регулювати значення рН.

При хроматографічному поділі іони аналізованої речовини конкурують з іонами, що містяться в елюенті, прагнучи вступити у взаємодію з протилежно зарядженими групами сорбенту. Звідси випливає, що іонообмінну хроматографію можна застосовувати для поділу будь-яких сполук, які можуть бути іонізовані. Можна провести аналіз навіть нейтральних молекул Сахаров у вигляді їх комплексів із борат-іоном:

Цукор + ВО 3 2 - = Цукор - ВО 3 2 -.

Іонообмінна хроматографія незамінна при розподілі високополярних речовин, які без переведення у похідні не можуть бути проаналізовані методом ГРХ. До таких сполук належать амінокислоти, пептиди, цукри.

Іонообмінну хроматографію широко застосовують у медицині, біології, біохімії, для контролю навколишнього середовища, при аналізі вмісту ліків та їх метаболітів у крові та сечі, отрутохімікатів у харчовій сировині, а також для поділу неорганічних сполук, у тому числі радіоізотопів, лантаноїдів, актиноїдів та ін. Аналіз біополімерів (білків, нуклеїнових кислот та ін), на який зазвичай витрачали годинник або дні, за допомогою іонообмінної хроматографії проводять за 20-40 хв з кращим поділом. Застосування іонообмінної хроматографії в біології дозволило спостерігати за зразками безпосередньо в біосередовищах, зменшуючи можливість перегрупування або ізомеризації, що може призвести до неправильної інтерпретації кінцевого результату. Цікаво використання цього методу контролю змін, що відбуваються з біологічними рідинами . Застосування пористих слабких аніонообмінників на силікагелевій основі дозволило розділити пептиди. V

Механізм іонного обміну можна як наступних рівнянь:

для аніонного обміну

X- + R+Y- год ->■ Y-+R+X-.

для катіонного обміну

X+ + R-Y+ год=* Y++R-X+.

У першому випадку іон зразка Х~ конкурує з іоном рухомої фази Y~ за іонні центри R+ іонообмінника, а в другому у конкуренцію з іонами рухомої фази Y+ за іонні центри R~ вступають катіони зразка Х+.

Природно, що іони зразка, що слабо взаємодіють з іонообмінником, при цій конкуренції будуть слабо утримуватися на колонці і першими вимиваються з неї і, навпаки, іони, що сильно утримуються, будуть елюювати з колонки останніми. Зазвичай виникають BTqpH4Hbie взаємодії неіонної природи за рахунок адсорбції або водневих зв'язків зразка з неіонною частиною матриці або обмеженою розчинністю зразка в рухомій фазі. Важко виділити "класичну" іонообмінну хроматографію в "чистому" вигляді, і тому деякі хроматографісти виходять з емпіричних, а не теоретичних закономірностей при іонообмінній хроматографії.

Поділ конкретних речовин залежить насамперед від вибору найбільш відповідного сорбенту та рухомої фази. Як нерухомі фази в іонообмінній хроматографії застосовують іонообмінні смоли і силікагелі з щепленими іоногенними групами.

2.4. ЕКСКЛЮЗІЙНА ХРОМАТОГРАФІЯ

Склюзійна хроматографія є варіантом! рідинної хроматографії, в якому поділ відбувається за рахунок розподілу молекул між розчинником, що знаходиться всередині пор сорбенту, і розчинником, що протікає " між його частинками.

На відміну від інших варіантів ВЕРХ, де поділ йдеза рахунок різної взаємодії компонентів з поверхнею сорбенту, роль твердого наповнювача в екслюзійній хроматографії полягає тільки у формуванні пір певного розміру, а нерухомою фазою є розчинник, що заповнює ці пори. Тому застосування терміна «сорбент» до цих наповнювачів певною мірою умовно.

Принциповою особливістю методу є можливість поділу молекул за їх розміром у розчині в діапазоні практично будь-яких молекулярних мас - від 10 2 до 10 8 , що робить його незамінним для дослідження синтетичних і біополімерів.

За традицією процес, що проводиться в органічних розчинниках, все ще часто називають гель-проникною, а у водних системах – гель-фільтраційною хроматографією. У цій книзі для обох варіантів прийнято єдиний термін, який походить від англійського «Size Exclusion» - виняток за розміром - і найбільш повною мірою відображає механізм процесу.

Детальний розбір існуючих уявлень про дуже складну теорію процесу екслюзійної хроматографії проведено в монографіях.

Повний об'єм розчинника у колонці Vt (його часто називають повним обсягом колонки, так як Vd не бере участі в хроматографічному процесі) являє собою суму обсягів рухомої та нерухомої фаз.

Утримання молекул у зклюзійній колонці визначається ймовірністю їх дифузії в пори і залежить від співвідношення розмірів молекул і пір, що схематично показано на рис. 2.15. Коефіцієнт розподілу Ка,як і в інших варіантах хроматографії, являє собою відношення концентрацій речовини в нерухомій та рухомій фазах.

Оскільки рухлива та нерухома фази мають однаковий склад, то Kd речовини, для якого обидві фази однаково доступні, дорівнює одиниці. Ця ситуація реалізується для молекул З найменшими розмірами (у тому числі і молекул розчинника), які проникають у всі пори (див. рис. 2.15) і тому рухаються через колонку найповільніше. Їх утримуваний об'єм дорівнює повному об'єму розчинника Vt-

Рис. 2.15. Модель поділу молекул за мірою в ексклюзивній хроматографії.

Всі молекули, розмір яких більше розміру пор сорбенту, не можуть потрапити в них (повна ексклюзив) і проходять каналами між частинками. Вони елююються з колонки з тим самим утримуваним об'ємом, рівним об'єму рухомої фази V 0 - Коефіцієнт розподілу для цих молекул дорівнює нулю.

Молекули проміжного розміру, здатні проникати тільки в якусь частину пір, утримуються в колонці відповідно до їх розміру. Коефіцієнт розподілу цих молекул змінюється в "межах від нуля до одиниці і характеризує частку обсягу пор, доступних для молекул даного розміру. Їх утримуваний обсяг визначається сумою У і доступної частини обсягу пор.

ЯКІСНИЙ АНАЛІЗ

Хроматографіст, який починає працювати в галузі високоефективної рідинної хроматографії, повинен ознайомитися з основами якісного аналізу. Якісний аналіз застосовують для ідентифікації відомого продукту, отриманого новим шляхом або що знаходиться в суміші з іншими продуктами." деяких лікарських засобів хімічних продуктів та їх метаболітів у біомл.тер.іалах..„"Знайомство з основами якісного" аналізу допоможе уникнути типових помилок, наприклад/відрізнити домішки в зразку від домішок в розчиннику або перевіряти чистоту речовини не на одній довжині хвилі спектрофотометра, але в різних тощо.

Перш ніж приступити до аналізу, необхідно встановити, чи зразок весь елююється з колонки даною системою розчинників чи ні. Щоб бути впевненим у повному елююванні, необхідно зібрати всю рідину, що витікає з колонки, упарити розчинник, зважити залишок і знайти ступінь вилучення зразка.

Ідентифікацію компонентів у ВЕРХ можна проводити трьома способами: 1) використовувати інформацію про утримання; 2) досліджувати зони, отримані під час поділу в колонці рідинного хроматографа, методами спектрального або хімічного аналізу; 3) безпосередньо підключити спектральний аналізатор до колонки.

Для реєстрації піків у хроматографії використовують утримуваний обсяг V R або час утримання t R. Обидві величини є характеристикою речовини у цій хроматографічної системі. Так як час утримування речовини, що розділяється, складається з часу взаємодії в колонці і часу проходження порожніх ділянок трубки, воно змінюється від приладу до приладу. Зручно мати речовину, яка не утримується даною колонкою, прийнявши її за стандарт, час та обсяг утримування якої t 0 , V o. Хроматографування речовини та стандарту необхідно проводити за одних і тих самих умов (тиску та швидкості потоку). При ідентифікації за даними про утримання, відомі індивідуальні речовини, які можуть бути присутніми у зразках, поділяють у тій же хроматографічній системі, і для них отримують значення t R. Порівнюючи ці значення t R з часом утримання невідомого піку, можна виявити, що вони або збігаються, і тоді ймовірно, що піки відповідають тому самому речовині, або t R відомої речовини не відповідає t R невідома зона. Тоді все ж таки можлива орієнтовна оцінка значень t R речовин, недоступних для безпосереднього виміру ступеня їх утримання. Розглянемо обидва варіанти.

У першому випадку, очевидно, потрібне попереднє вивчення зразка для постулювання присутності в ньому конкретних речовин. При роботі з простими сумішами неважко визначити, чи збігається ступінь утримання зон зразка та відомих речовин, чи ні, тобто значення t B однакові чи розрізняються. У разі складних сумішей відразу кілька речовин можуть елююватися зі схожими значеннями t R, і реально одержувані при хроматографічному розподілі зони перекриваються. В результаті набуття точних значень t R для різних зон стає неможливим. Надійність ідентифікації зростає при підвищенні роздільної здатності, більш ретельному контролі умов поділу, багаторазовому вимірі значень t R та усереднення знайдених величин. При цьому хроматографічне поділ відомої та невідомої речовини повинно чергуватись. При поділі складних сумішей значення t R речовини можуть змінюватися під впливом матриці самого зразка. Така дія можлива на початку хроматограми і при перекриванні піків; можливе також затягування зон, що вже згадувалося.

У подібних випадках слід додати стандарт до зразка у співвідношенні 1: 1. Якщо речовини ідентичні, значення t R вихідної речовини не зміниться, і на хроматограмі одержують лише один пік. Якщо є прилад із циклічною системою хроматографування, то для надійності ідентифікації бажано суміш пропускати через колонку кілька разів.

Відомості про рівень утримування можна знайти і в літературі, проте цінність цієї інформації обмежена. Оскільки колонки навіть однієї партії дають погану відтворюваність, літературні значення не завжди відповідають справжньому значенню t R на цій колонці. Для адсорбційної хроматографії можливе, проте, передбачення t R виходячи з літературних даних. Інша проблема, пов'язана з використанням літературних значень t R, - складність їх пошуку у спеціальній літературі, хоча бібліографічні огляди, які публікуються Jornal of chromatography, мають оновлюваний покажчик за типами речовин.

У другому випадку, коли часи утримання відомих з'єднань і зон зразка не збігаються, є можливість передбачити час утримання невідомого компонента. Цілком надійні передбачення відносного утримування на підставі даних про структуру просторово-ексклюзивної хроматографії. Менш точні вони в адсорбційній, розподільній хроматографії та особливо при роботі на хімічно прив'язаній фазі. Для іонної та іон-парної хроматографії речовин з відомою р Каможливі лише приблизні визначення значень tR. Завжди легше передбачити відносне утримання чи значення *х, ніж абсолютні значення k". Відносні значення t R легше оцінити для споріднених сполук або похідних, наприклад, заміщених алкілкарбонових кислот або похідних бензолу.

При ізократичному розподілі гомологів або олігомерів іноді спостерігається наступна закономірність:

\ gk" = A + Bn,

де Аі В- константи для низки обраних зразків і для даної хроматографічної системи (на одній і тій же колонці, з такою ж рухомою і нерухомою фазами); п- Число однакових структурних одиниць у молекулі зразка.

Введення в молекулу зразка функціональної групи / призводитиме до зміни k" у першому рівнянні деякий постійний коефіцієнт а/ у цій хроматографічної системі. Можна отримати групові константи а/ для різних заміщуючих груп /, значення яких зростатимуть при збільшенні полярності функціональних груп у всіх видах хроматографії, крім обернено-фазної, де значення констант зменшуватимуться зі збільшенням полярності.

Деякі групові константи для різних заміщуючих груп / наведені в табл. 9.1.

В адсорбційній хроматографії перше рівняння не завжди застосовне, тому що воно справедливе за умови, що всі ізомери мають одне й те саме значення k", що не завжди дотримується. Можна, однак, побудувати графік залежності lgfe" одних і тих же з'єднань на одній колонці щодо lgfe" тих самих з'єднань, але на іншій колонці або щодо відповідних характеристик тонкошарової хроматографії, наприклад, lg[(l- Rf) IRf].

При порівнянні даних про утримання речовин можна використовувати значення коефіцієнта ємності k", тому що на нього на відміну від t R не впливають швидкість рухомої фази та геометричні особливості колонки.

Поділ на хімічно прив'язаній фазі аналогічно поділу за методом розподільчої хроматографії з аналогічними фазами, і тому екстракційні дані при рівноважному стані можуть бути використані для передбачення часу утримування.

В іонообмінній хроматографії на ступінь утримування впливають три фактори: ступінь іонізації кислот і основ, заряд іонізованої молекули і здатність речовини з рухомої водної фази, що використовується в іонообмінній хроматографії, мігрувати в органічну фазу. Останнє залежить від молекулярної маси сполуки та її гідрофобності. Отже, сильніші кислоти або основи сильніше утримуються при аніонообмінному або катіонообмінному поділі. При зниженні РК аокремої кислоти, що входить в зразок, утримування зростає при поділі ряду кислот за рахунок аніонного обміну, а при збільшенні р/С збільшується утримування підстав при їх поділі за рахунок катіонного обміну.

Таким чином, збіг значень часу утримання відомої речовини з спостерігається дає можливість припустити їх ідентичність. Достовірність ідентифікації зростає, якщо порівняти хроматограм відомої речовини і невідомого компонента в різних умовах. Якщо речовини в адсорбційній та обернено-фазній або іоннообмінній та винятковій хроматографії поводяться однаково, надійність ідентифікації зростає. Якщо достовірність ідентифікації за рівності відносного утримування становить 90%, то щодо вивчення цих цих речовин за умов істотно відмінних достовірність ідентифікації становить вже 99%.

Цінною характеристикою речовини, яка застосовується при ідентифікації, є відношення сигналів, отриманих для цієї речовини на двох різних детекторах. Аналізована речовина після виходу з колонки проходить спочатку через перший детектор, потім через другий, а сигнали, що надходять з детекторів, реєструються одночасно за допомогою пір'яного самописця або на двох самописцях. Зазвичай застосовують послідовне з'єднання ультрафіолетового детектора (більш чутливого, але селективного) з рефрактометром, або ультрафіолетового з детектором флуоресценції, або двох ультрафіолетових детекторів, що працюють на різних довжинах хвиль. Відносний відгук, тобто відношення сигналу рефрактометра до сигналу фотометра є характеристикою речовини за умови, що обидва детектори працюють у своєму лінійному діапазоні; це перевіряється запровадженням різних кількостей однієї й тієї ж речовини. Якісну інформацію можна отримати, працюючи на фотометричних детекторах, забезпечених пристроєм для зупинки потоку (Stop flow) і дозволяють реєструвати спектр "виходить" з колонки піка, поки він знаходиться в проточній кюветі, порівнюючи його зі спектром відомого з'єднання.

Значний інтерес при ідентифікації представляють сучасні, поки що дорогі, спектрофотометри з діодними гратами.

Цілком невідома речовина неможливо ідентифікувати лише за допомогою високоефективної рідинної хроматографії, необхідні й інші методи.

Кількісний аналіз

Кількісна рідинна хроматографія є добре розробленим аналітичним методом, який не поступається за точністю кількісної газової хроматографії і значно перевищує точність ТСХ або електрофорезу. ГЖХ) Тому для отримання кількісних результатів калібрування приладу обов'язкове.

Кількісний аналіз складається з наступних стадій: 1) хроматографічне поділ; 2) вимірювання площ або висот піку; 3) розрахунок кількісного складу суміші на підставі хроматографічних даних; 4) інтерпретація одержаних результатів, тобто статистична обробка. Розглянемо всі ці стадії.

4.1. ХРМАТОГРАФІЧНИЙ РОЗДІЛ

При відборі проби можуть бути допущені помилки. Особливо важливо уникнути помилки та відібрати адекватну представницьку пробу неоднорідних твердих зразків, легколетких або нестійких речовин, а також сільськогосподарських продуктів та біоматеріалів. Неоднорідні зразки, наприклад, харчових продуктів, ретельно перемішують та квартують. Проводячи цю операцію багаторазово, досягають однорідності проби.

Похибки та втрати речовин можуть бути допущені на стадії екстракції, виділення, очищення тощо.

Зразки мають бути повністю розчинені, які розчини приготовані з точністю ±0,1%. Розчиняти зразок бажано у рухомій фазі, що виключить можливість осадження його після введення в хроматограф. Якщо розчинення в рухомій фазі неможливо, слід застосовувати розчинник, що змішується з нею, і вводити в хроматограф обсяги зразка (менше 25 мкл).

Значні похибки можуть бути при введенні проби за рахунок її фракціонування, витоків та розмивання піків. Розмивання піків викликає утворення хвостів, що призводять до часткового перекриття піків, і як наслідок цього до похибок при детектуванні. Для введення проби при кількісному аналізі краще використовувати петлеві клапанні пристрої, а не шприци через більш високу точність і меншу залежність від індивідуальних особливостей операторів.

При хроматографічному поділі речовин також можуть виникнути ускладнення, що призводять до викривлення даних: кількісного аналізу. Можливе розкладання або перетворення проби під час хроматографічного процесу або необоротна адсорбція речовини на цій колонці. Важливо переконатися у відсутності цих небажаних явищ та за необхідності провести регенерацію колонки або замінити її. Перекриття піків і утворення хвостів також можна зменшити, змінюючи умови хроматографування.

Не можна використовувати в кількісному аналізі піки несправжні або нечіткої форми, а також піки, час виходу яких близький до to, оскільки можливе недостатнє їхнє поділ. Зазвичай використовують піки зі значенням й"^0,5. Найвища ефективність колонки досягається при введенні 10~ 5 -10~ 6 г розчиненої речовини на 1 г сорбенту. за площами піків.

До суттєвого спотворення результатів хроматографічного поділу призводять похибки, пов'язані з детектуванням, або посиленням. Кожен детектор характеризується специфічністю, лінійністю та чутливістю. Особливо важливою є перевірка на селективність при аналізі мікродомішок. Відгук УФ-детекторів може змінюватися на речовини зі схожими функціональними групами в 10-4 разів. Необхідно відгук детектора прокалібрувати для кожної речовини, що визначається. Природно, що речовини, що не поглинають в УФ-області, не дадуть сигналу на самописець при використанні як детектор фотометра. При використанні рефрактометра можлива поява негативних піків. Крім того, цей детектор необхідно термостатувати, чого не потрібно УФ-детектора.

Лінійністю детектора визначається розмір проби, що вводиться. Необхідно пам'ятати, що швидкість потоку через колонку, температура колонки та детектора, а також його конструкція впливають на точність кількісного аналізу. Похибки при передачі електричного сигналу на вихідний пристрій (самописець), інтегратор або ЕОМ можуть виникати за рахунок наведення шумів, відсутності заземлення, коливання напруги в мережі і т.д.

4.2. ВИМІР ПЛОЩЕЙ АБО ВИСІТ ПІКІВ

Висотою пік h (Рис. 10.1) називають відстань від вершини піку до базової лінії, його вимірюють лінійною або підраховують кількість поділів на самописці. Деякі електронні інтегратори та обчислювальні машини дають інформацію про висоту піків. Положення базової лінії зміщених піків знаходять шляхом інтерполування значень ординат, що відповідають початку та кінцю піку (пік 1 та 3див. рис. 10.1). Для підвищення точності потрібно мати пологу стабільну базову лінію. У разі нерозділених піків базову лінію будують між початком та кінцем піку, а не замінюють нульовою лінією. Так як висота піків менш залежить від впливу сусідніх піків, що перекриваються, оцінка по висоті піку точніше, і її майже завжди використовують при аналізі мікродомішок.

Площа піку можна визначати у різний спосіб. Розглянемо деякі з них.

1. Планіметричний метод полягає в тому, що пік обводять ручним планіметром, що є приладом механічно визначальний площу піку. Метод точний, але трудомісткий і погано відтворюємо. Застосування цього небажано.

2. Метод паперових силуетів – пік вирізують та зважують. Метод добре відтворюваний, але трудомісткий, при цьому знищується хроматограма. Застосування його залежить від однорідності діаграмної стрічки. Метод також може бути широко рекомендований.

4. Метод тріангуляції полягає у побудові трикутника шляхом проведення дотичних до сторін піку. Вершина трикутника перебуває вище, ніж вершина піку. Збільшення площі, утвореної цією продовженою вершиною, буде послідовним для всієї хроматограми і не надто вплине на точність. Крім того, деяку площу, що втрачається під час проведення дотичних, буде компенсовано. Основу трикутника визначають перетином дотичних з базовою лінією, а площа - добутком 7г основи на висоту. Для визначення площ асиметричних піків цей спосіб найкращий. Однак відтворюваність при побудові дотичних різних операторів різна і, отже; низька.

5. Метод із застосуванням дискового інтегратора заснований на електромеханічному пристрої, приєднаному до самописця. Перо, прикріплене до інтегратора, переміщається смугою внизу стрічки зі швидкістю, пропорційною переміщенню пера самописця.

Як і при ручному вимірі, пік повинен залишатися на шкалі самописця, проте регулювання, що компенсують зміщення базової лінії та неповне поділ суміжних піків, знижує надійність та збільшує тривалість аналізу.

Метод точніший, ніж ручні методи вимірювання, особливо при асиметричних піках, і дає перевагу у швидкості. Крім того, він забезпечує постійний кількісний запис аналізу.

6. Методи із застосуванням електронних інтеграторів, що визначають площу піків та друкують інформацію про цю площу та про часи утримання, можуть включати корекцію зміщення базової лінії та визначати площу лише частково розділених піків. Основні переваги – точність, швидкість, незалежність дії від роботи самописця. Інтегратори мають пам'ять і їх можна програмувати для конкретного аналізу, використовуючи попередньо закладену програму. До переваг інтегратора відносять його здатність використовувати поправочні коефіцієнти на відгук детектора при перерахунку вихідних даних про площі піків, компенсуючи відмінність чутливості детектора до різних речовин. Подібні системи економлять час, покращують аналітичну точність та корисні для рутинного аналітичного аналізу.

7. У рідинній хроматографії широко застосовують ЕОМ, що вимірюють площі піків. Вони виводять на друк повне повідомлення, включаючи назву речовин, площі піків, часи утримування, поправочні коефіцієнти на відгук детектора та вміст (мас.%) для різних компонентів зразка.

ЗАГАЛЬНА ФАРМАКОПЕЙНА СТАТТЯ

Натомість ст. ДФ XI

Високоефективна рідинна хроматографія (рідинна хроматографія високого тиску) – це метод колонкової хроматографії, в якому рухомою фазою служить рідина, що рухається через хроматографічну колонку, заповнену нерухомою фазою (сорбентом). Колонки високоефективної рідинної хроматографії характеризуються високим гідравлічним опором на вході.

Залежно від механізму поділу речовин розрізняють наступні варіанти високоефективної рідинної хроматографії: адсорбційну, розподільну, іонообмінну, екслюзійну, хіральну та ін. відповідно до характеру основних міжмолекулярних взаємодій, що проявляються. В адсорбційній хроматографії поділ речовин відбувається за рахунок їхньої різної здатності адсорбуватися та десорбуватися з поверхні сорбенту з розвиненою поверхнею, наприклад, силікагелю. У розподільній високоефективній рідинній хроматографії поділ відбувається за рахунок відмінності коефіцієнтів розподілу речовин, що розділяються між нерухомою (як правило, хімічно прищепленою до поверхні нерухомого носія) і рухомою фазами.

Залежно від типу рухомої та нерухомої фази розрізняють нормально-фазову та обернено-фазову хроматографію. У нормально-фазовій високоефективній рідинній хроматографії нерухома фаза - полярна (найчастіше силікагель або силікагель з щепленими NH 2 - або CN-групами та ін), а рухлива фаза - неполярна (гексан, або суміші гексану з більш полярними органічними розчинниками - хлороформом, спиртами тощо). Утримання речовин зростає зі збільшенням їхньої полярності. У нормально-фазовій хроматографії елюююча здатність рухомої фази збільшується зі зростанням її полярності.

У обернено-фазовій хроматографії нерухома фаза – неполярна (гідрофобні силікагелі з щепленими групами С4, С8, С18 та ін.); рухлива фаза – полярна (суміші води та полярних розчинників: ацетонітрилу, метанолу, тетрагідрофурану та ін.). Утримання речовин зростає зі збільшенням їхньої гідрофобності (неполярності). Чим більший вміст органічного розчинника, тим вище елюююча здатність рухомої фази.

В іонообмінній хроматографії молекули речовин суміші, дисоційовані в розчині на катіони та аніони, поділяються при русі через сорбент (катіоніт або аніоніт) за рахунок різної сили взаємодії іонів, що визначаються з іонними групами сорбенту.

В ексклюзійній (ситової, гель-проникаючої, гель-фільтраційної) хроматографії молекули речовин поділяються за розміром за рахунок їх різної здатності проникати в пори нерухомої фази. При цьому першими з колонки виходять найбільші молекули, здатні проникати в мінімальне число пір нерухомої фази, а останніми виходять речовини з малими розмірами молекул.

У хіральній хроматографії відбувається розподіл оптично активних сполук на окремі енантіомери. Поділ може здійснюватися на хіральних нерухомих фазах або на ахіральних нерухомих фазах з використанням хіральних рухомих фаз.

Існують інші варіанти високоефективної рідинної хроматографії.

часто поділ протікає не по одному, а за декількома механізмами одночасно, залежно від типу рухомої та нерухомої фаз, а також природи з'єднання, що визначається.

Область застосування

Високоефективна рідинна хроматографія успішно застосовується як для якісного, так і для кількісного аналізу лікарських засобів у випробуваннях «Справжність», «Сторонні домішки», «Розчинення», «Однорідність дозування», «Кількісне визначення». Слід зазначити, що хроматографія дозволяє поєднувати в одній пробі кілька випробувань, у тому числі «Справжність» та «Кількісне визначення».

Обладнання

Для аналізу використовують відповідні прилади – рідинні хроматографи.

До складу рідинного хроматографа зазвичай входять такі основні вузли:

- вузол підготовки рухомої фази, включаючи ємність з рухомою фазою (або ємності з окремими розчинниками, що входять до складу рухомої фази) та систему дегазації рухомої фази;

- Насосна система;

- Змішувач рухомої фази (при необхідності);

- система введення проби (інжектор) може бути ручним або автоматичним (автосамплер);

- хроматографічна колонка (може бути встановлена ​​в термостаті);

- детектор (один або кілька з різними способами детектування);

- Система управління хроматографом, збору та обробки даних.

Крім цього до складу хроматографа можуть входити: система пробопідготовки та передколонковий реактор, система перемикання колонок, постколоночний реактор та інше обладнання.

Насосна система

Насоси забезпечують подачу рухомої фази в колонку із заданою швидкістю. Склад рухомої фази і швидкість потоку можуть бути постійними або такими, що змінюються під час аналізу. У разі постійного складу рухомої фази процес називають ізократичним, тоді як у другому – градієнтним. Сучасна насосна система рідинного хроматографа складається з одного або кількох насосів, керованих комп'ютером. Це дозволяє змінювати склад рухомої фази за певною програмою при градієнтному елююванні. Насоси для високоефективної аналітичної рідинної хроматографії дозволяють підтримувати швидкість подачі рухомої фази в колонку в інтервалі від 0,1 до 10 мл/хв при тиску на вході в колонку до 40 МПа. Пульсації тиску мінімізуються спеціальними демпферними системами, що входять до конструкції насосів. Робочі деталі насосів виготовляються із корозійностійких матеріалів, що дозволяє використовувати у складі рухомої фази агресивні компоненти.

Змішувачі

У змішувачі відбувається утворення єдиної рухомої фази з окремих розчинників, що подаються насосами, якщо необхідна суміш була приготовлена ​​заздалегідь. Змішування компонентів рухомої фази в змішувачі може відбуватися як при низькому тиску (до насосів), так і високому тиску (після насосів). Змішувач можна використовувати для підготовки рухомої фази та при ізократичному елююванні.

Об'єм змішувача може впливати на час утримання компонентів при градієнтному елююванні.

Інжектори

Інжектори можуть бути універсальними, з можливістю зміни обсягу проби, або дискретними для введення проби тільки певного обсягу. Обидва типи інжекторів можуть бути автоматичними (автоінжектори або автосемплери). Інжектор для введення проби (розчину) розташований безпосередньо перед хроматографічною колонкою. Конструкція інжектора дозволяє змінювати напрямок потоку рухомої фази і здійснювати попереднє введення проби в петлю-дозатор певного об'єму (зазвичай від 10 до 100 мкл) або спеціальний дозуючий пристрій змінного об'єму. Об'єм петлі вказаний на її маркуванні. Конструкція дискретного інжектора, зазвичай, дозволяє здійснювати заміну петлі. Сучасні автоматичні інжектори можуть мати низку додаткових функцій, наприклад, виконувати функцію станції пробопідготовки: здійснювати змішування та розведення зразків, проводити реакцію передколонкової дериватизації.

Хроматографічна колонка

Хроматографічні колонки зазвичай є трубками з нержавіючої сталі, скла або пластику, заповнені сорбентом і закриті з обох боків фільтрами з діаметром пор 2-5 мкм. Довжина аналітичної колонки може бути в діапазоні від 5 до 60 см і більше, внутрішній діаметр - від 2 до 10 мм. Колонки з внутрішнім діаметром менше 2 мм використовуються в мікроколонній хроматографії. Існують також капілярні колонки із внутрішнім діаметром близько 0,3–0,7 мм. Колонки для препаративної хроматографії можуть мати внутрішній діаметр 50 мм та більше.

Перед аналітичною колонкою можуть встановлюватися короткі колонки (передколонки), що виконують різні допоміжні функції, основна з яких – захист аналітичної колонки. Зазвичай аналіз проводять при кімнатній температурі, проте збільшення ефективності поділу і скорочення тривалості аналізу може бути використане термостатування колонок при температурах до 80 — 100 °З. Можливість використання підвищеної температури при розподілі обмежується стабільністю нерухомої фази, оскільки при підвищених температурах можлива її деструкція.

Нерухома фаза (сорбент)

Як сорбенти зазвичай застосовуються:

• силікагель, оксид алюмінію, використовуються у нормально-фазовій хроматографії. Механізм утримування у разі – зазвичай адсорбція;
• силікагель, смоли або полімери з щепленими кислотними чи основними групами. Область застосування – іонообмінна та іонна хроматографія;
• силікагель або полімери із заданим розподілом розмірів пор (ексклюзивна хроматографія);
• хімічно модифіковані сорбенти (сорбенти з щепленими фазами), приготовані найчастіше на основі силікагелю. Механізм утримування - адсорбція або розподіл між рухомою та нерухомою фазами. Область застосування залежить від типу щеплених функціональних груп. Деякі типи сорбентів можуть використовуватися як у зверненій, так і нормально фазової хроматографії;
• хімічно модифіковані хіральні сорбенти, наприклад, похідні целюлози та амілози, протеїни та пептиди, циклодекстрини, хітозани, що використовуються для поділу енантіомерів (хіральна хроматографія).

Сорбенти з щепленими фазами можуть мати різний ступінь хімічної модифікації. Як щеплені фази найчастіше застосовуються:

– октадецильні групи (сорбент октадецилсилан (ODS) або С18);

– октильні групи (сорбент октилсилан або С8);

- фенільні групи (сорбент фенілсілан);

- ціанопропільні групи (сорбент CN);

– амінопропильні групи (сорбент NH2);

- Діольні групи (сорбент діол).

Найчастіше аналіз виконують на неполярних щеплених фазах в обернено-фазовому режимі із застосуванням сорбенту 18 .

Сорбенти з щепленими фазами, отримані на основі силікагелю, хімічно стійкі при значеннях pH від 2,0 до 7,0, якщо інше не обумовлюється виробником. Частинки сорбенту можуть мати сферичну або неправильну форму та різноманітну пористість. Розмір частинок сорбенту в аналітичній високоефективній рідинній хроматографії зазвичай становить 3-10 мкм, препаративної високоефективної рідинної хроматографії - 50 мкм і більше. Існують також монолітні колонки, в яких сорбент є монолітом з наскрізними порами, що заповнює весь обсяг колонки.

Висока ефективність поділу забезпечується високою площею поверхні частинок сорбенту (яка є наслідком їх мікроскопічних розмірів та наявності пір), а також рівномірністю складу сорбенту та щільною та рівномірною його упаковкою.

Детектори

У високоефективної рідинної хроматографії використовують різні способи детектування. У загальному випадку рухлива фаза з розчиненими в ній компонентами після хроматографічної колонки потрапляє в комірку детектора, де безперервно вимірюється та чи інша її властивість (поглинання в ультрафіолетовій або видимій ділянці спектра, флуоресценція, показник заломлення, електропровідність та ін.). Отримана при цьому хроматограма є графіком залежності деякого фізичного або фізико-хімічного параметра рухомої фази від часу.

Найбільш поширеними детекторами високоефективної рідинної хроматографії є ​​спектрофотометричні. У процесі елюювання речовин у спеціально сконструйованій мікрокюветі вимірюється оптична щільність елюату при заздалегідь вибраній довжині хвилі. Широка область лінійності детектора дозволяє аналізувати як домішки, і основні компоненти суміші однією хроматограмме. Спектрофотометричний детектор дозволяє проводити детектування за будь-якої довжини хвилі в його робочому діапазоні (як правило, 190-600 нм). Застосовуються також мультихвильові детектори, що дозволяють проводити детектування при декількох довжинах хвиль одночасно і детектори на діодній матриці, що дозволяють реєструвати оптичну щільність одночасно у всьому робочому діапазоні довжин хвиль (як правило, 190-950 нм). Це дозволяє реєструвати спектри поглинання компонентів, що проходять через комірку детектора.

Флуориметрический детектор застосовується визначення флуоресцирующих сполук або не флуоресцирующих сполук як їх флуоресцирующих похідних. Принцип дії флуориметричного детектора ґрунтується на вимірі флуоресцентного випромінювання поглиненого світла. Поглинання зазвичай проводять в ультрафіолетовій ділянці спектру, довжини хвиль флуоресцентного випромінювання перевищують довжини хвиль поглиненого світла. Флуориметричні детектори мають дуже високу чутливість і селективність. Чутливість флуоресцентних детекторів приблизно в 1000 разів вища за чутливість спектрофотометричних. Сучасні флуоресцентні детектори дозволяють не лише отримувати хроматограми, а й реєструвати спектри збудження та флуоресценції аналізованих сполук.

Для визначення сполук, що слабо поглинають в ультрафіолетовій та видимій областях спектру (наприклад, вуглеводів), використовують рефрактометричнідетектори (рефрактометри). Недоліки цих детекторів – їх низька (порівняно зі спектрофотометричними детекторами) чутливість та значна температурна залежність інтенсивності сигналу (детектор необхідно термостатувати), а також неможливість їх використання у режимі градієнтного елюювання.

Принцип роботи випарних детекторів лазерного світлового розсіюваннязаснований на відмінності тиску пари хроматографічних розчинників, що входять до складу рухомої фази, і аналізованих речовин. Рухлива фаза на виході з колонки вводиться в розпилювач, змішується з азотом або СО 2 і у вигляді дрібнодисперсного аерозолю потрапляє в обігрівається випарну трубку з температурою 30 - 160 ° С, в якій рухлива фаза випаровується. Аерозоль з нелетючих частинок аналізованих речовин розсіює світловий потік камери розсіювання. За ступенем розсіювання світлового потоку можна судити про кількість з'єднання, що визначається. Детектор більш чутливий, ніж рефрактометричний, його сигнал не залежить від оптичних властивостей проби, від типу функціональних груп в речовинах, що визначаються, від складу рухомої фази і може бути використаний в режимі градієнтного елюювання.

Електрохімічні детектори (кондуктометричні, амперометричні, кулонометричні та ін.). Амперометричний детектор застосовують визначення електроактивних сполук, які можуть бути окислені або відновлені на поверхні твердого електрода. Аналітичним сигналом є величина струму окиснення чи відновлення. У осередку детектора є принаймні два електроди - робочий і електрод порівняння (хлоридсрібний або сталевий). До електродів прикладається робочий потенціал, величина якого залежить від природи з'єднань, що визначаються. Вимірювання можуть проводитися як при постійному потенціалі, так і в імпульсному режимі, коли визначається профіль зміни потенціалу робочого електрода на протязі одного циклу реєстрації сигналу. В амперометрическом детекторі використовують робочі електроди з вуглецевих матеріалів (найчастіше скловуглецевий або графітовий), та металеві: платиновий, золотий, мідний, нікелевий.

Кондуктометричний детектор використовують для детектування аніонів та катіонів в іонній хроматографії. Принцип його роботи заснований на вимірі електропровідності рухомої фази у процесі елюювання речовини.

Винятково інформативним є мас-спектрометричний детектор, який має високу чутливість і селективність. Останні моделі мас-спектрометрів для рідинної хроматографії працюють у діапазоні мас m/z від 20 до 4000 а.

У високоефективній рідинній хроматографії використовуються також Фур'є-ІЧ-детектори, радіоактивності та деякі інші.

Система збору та обробки даних

Сучасна система обробки даних є пов'язаний з хроматографом персональний комп'ютер із встановленим програмним забезпеченням, що дозволяє реєструвати та обробляти хроматограму, а також керувати роботою хроматографа та стежити за основними параметрами хроматографічної системи.

Рухлива фаза

Рухлива фаза високоефективної рідинної хроматографії виконує двояку функцію: забезпечує перенесення десорбованих молекул по колонці і регулює константи рівноваги, а, отже, і утримання в результаті взаємодії з нерухомою фазою (сорбуючись на поверхні) і з молекулами речовин, що розділяються. Таким чином, змінюючи склад рухомої фази високоефективної рідинної хроматографії можна впливати на часи утримання сполук, селективність і ефективність їх поділу.

Рухлива фаза може складатися з одного розчинника, часто з двох, у разі потреби – з трьох і більше. Склад рухомої фази вказують як об'ємне співвідношення розчинників, що входять до неї. В окремих випадках може вказуватись масове співвідношення, що має бути спеціально обумовлено. Як компоненти рухомої фази можуть бути використані буферні розчини з певним значенням рН, різні солі, кислоти та основи та інші модифікатори.

У нормально-фазовій хроматографії зазвичай застосовуються рідкі вуглеводні (гексан, циклогексан, гептан) та інші відносно неполярні розчинники з невеликими добавками органічних полярних сполук, які регулюють елюювальну силу рухомої фази.

У звернено-фазовій хроматографії як рухому фазу використовується вода або водно-органічні суміші. Органічними добавками зазвичай є полярні органічні розчинники (ацетонітрил і метанол). Для оптимізації поділу можуть використовуватися водні розчини з певним значенням рН, зокрема буферні розчини, а також різні добавки в рухому фазу: фосфорна та оцтова кислоти при розділенні сполук кислотного характеру; аміак та аліфатичні аміни при поділі сполук основного характеру та інші модифікатори.

На хроматографічний аналіз великий вплив має ступінь чистоти рухомої фази, тому переважно застосовувати розчинники, випущені спеціально для рідинної хроматографії (включаючи воду).

При використанні УФ-спектрофотометричного детектора рухлива фаза не повинна мати вираженого поглинання при вибраній для детектування довжині хвилі. Межа прозорості або оптична щільність за певної довжини хвилі розчинника конкретного виробника часто вказується на упаковці.

Рухлива фаза і аналізовані розчини не повинні містити частинок, що не розчинилися, і бульбашки газу. Воду, отриману в лабораторних умовах, водні розчини, попередньо змішані з водою органічні розчинники, а також аналізовані розчини необхідно тонкої фільтрації і дегазації. Для цих цілей зазвичай застосовують фільтрування під вакуумом через інертний по відношенню до даного розчинника або розчину мембранний фільтр з розміром пор 0,45 мкм

Перелік умов хроматографування, що підлягають вказівці

У фармакопейній статті повинні бути наведені: повне комерційне найменування колонки із зазначенням виробника та каталожного номера, розміри колонки (довжина та внутрішній діаметр), типу сорбенту із зазначенням розміру частинок, розміру пор, температура колонки (якщо необхідне термостатування), обсяг проби, що вводиться (обсяг петлі), склад рухомої фази і спосіб її приготування, швидкість подачі рухомої фази, тип детектора та умови детектування (при необхідності параметри осередку детектора), опис градієнтного режиму (якщо використовується), що включає в себе стадію перерівноваження до вихідних умов, час хроматографування, докладний опис методики та формули розрахунку, описи приготування стандартних та випробуваних розчинів.

У разі використання передколонної дериватизації в автосамплері наводиться інформація про програму роботи автосамплера. У разі використання постколонової дериватизації вказується швидкість подачі дериватизуючого реагенту, обсяг петлі змішування та її температура.

Модифіковані види високоефективної рідинної хроматографії

Іон-парна хроматографія

Одним із різновидів звернено-фазової високоефективної рідинної хроматографії є ​​іон парна хроматографія – що дозволяє визначати іонізовані сполуки. Для цього до складу традиційної звернено-фазової високоефективної рідинної хроматографії рухомої фази додають гідрофобні органічні сполуки з іоногенними групами (іонні парні реагенти). Для поділу основ зазвичай використовують алкілсульфати натрію, для поділу кислот застосовують солі тетраалкіламонію (тетрабутиламонію фосфат, цетилтриметиламонію бромід та ін.). В іон-парному режимі селективність поділу неіоногенних компонентів лімітуватиметься звернено-фазовим механізмом утримування, а утримування основ і кислот помітно зростає, при цьому покращується форма хроматографічних піків.

Утримання в ион-парном режимі зумовлено досить складними рівноважними процесами, конкуруючими між собою. З одного боку, за рахунок гідрофобних взаємодій та ефекту витіснення полярного середовища рухомої фази можлива сорбція гідрофобних іонів на поверхні алкілсилікагелю таким чином, що заряджені групи звернені до рухомої фази. У цьому випадку поверхня набуває іонообмінних властивостей, і утримування підпорядковується закономірностям іонообмінної хроматографії. З іншого боку, можливе утворення іонної пари безпосередньо в об'ємі елюентів, з подальшою її сорбцією на сорбенті по обернено-фазовому механізму.

Хроматографія гідрофільного взаємодії ( HILIC хроматографія)

Хроматографія гідрофільного взаємодії використовується для поділу полярних сполук, що слабко утримуються в обернено-фазовій високоефективній рідинній хроматографії. Як рухомий фази в цьому варіанті хроматографії використовуються водно-ацетонітрильні суміші з додаванням солей, кислот або основ. Нерухомими фазами, як правило, є силікагелі, модифіковані полярними групами (аміно-, діольні, ціанопропільні групи тощо). Більше полярні з'єднання утримуються сильніше. Елюююча здатність рухомої фази зростає зі збільшенням полярності.

Іонообмінна та іонна високоефективна рідинна хроматографія

Іонообмінна хроматографія використовується для аналізу як органічних (гетероциклічні основи, амінокислоти, білки та ін.), так і неорганічних (різні катіони та аніони) сполук. Поділ компонентів аналізованої суміші в іонообмінній хроматографії заснований на оборотній взаємодії іонів аналізованих речовин з іонообмінними групами сорбенту. Ці сорбенти являють собою, в основному, або полімерні іонообмінні смоли (зазвичай сополімери стиролу та дивінілбензолу з щепленими іонообмінними групами), або силікагелі з щепленими іонообмінними групами. Сорбенти з групами: -NH 3 + , -R 3 N + , -R 2 HN + , -RH 2 N + та ін. – , –СООН, -PО 3 – та інших. поділу катіонів (катіоніти).

Як рухому фазу в іонообмінній хроматографії застосовують водні розчини кислот, основ і солей. Зазвичай застосовують буферні розчини, що дозволяють підтримувати певні значення рН. Можливе також використання невеликих добавок органічних розчинників, що змішуються з водою – ацетонітрилу, метанолу, етанолу, тетрагідрофурану.

Іонна хроматографія - варіант іонообмінної хроматографії, в якому для детектування з'єднань (іонів), що визначаються, використовується кондуктометричний детектор. Для високочутливого визначення змін електропровідності рухомої фази, що проходить через детектор, фонова електропровідність рухомої фази повинна бути низькою.

Існують два основні варіанти іонної хроматографії.

Перший — двоколоночная іонна хроматографія, заснований на придушенні електропровідності електроліту рухомої фази за допомогою другої іонообмінної колонки або спеціальної мембранної системи придушення, що знаходиться між аналітичною колонкою і детектором. При проходженні через систему електропровідність рухомої фази знижується.

Другий варіант іонної хроматографії – одноколоночна іонна хроматографія. У цьому варіанті використовується рухома фаза з низькою електропровідністю. Як електроліти широко застосовують слабкі органічні кислоти: бензойну, саліцилову або ізофталеву.

Ексклюзивна високоефективна рідинна хроматографія

Ексклюзивна хроматографія (гель-хроматографія) - особливий варіант високоефективної рідинної хроматографії, заснований на розподілі молекул за їх розмірами. Розподіл молекул між нерухомою та рухомою фазами заснований на розмірах молекул і частково на їх формі та полярності.

Можливі два граничні типи взаємодії молекул з пористою нерухомою фазою. Молекули з розмірами, що перевищують максимальний діаметр пір, взагалі не утримуються та елююються першими, переміщуючись одночасно з рухомою фазою. Молекули з розмірами, меншими ніж мінімальний діаметр пор сорбенту, вільно проникають у пори та елююються з колонки останніми. Інші молекули, що мають проміжні розміри, утримуються в порах частково і в ході елюювання поділяються на фракції відповідно до своїх розмірів і, частково, формою проникають у пори сорбенту залежно від розміру та частково залежно від своєї форми. В результаті речовини елююються з різними часами утримання.

Іоноексклюзивна хроматографія

В основі механіму іоноексклюзійної хроматографії лежить ефект, в результаті якого з'єднання в іонізованій формі не утримуються на сорбенті-іонообміннику, тоді як з'єднання в молекулярній формі розподіляються між нерухомою і водною фазами всередині пор іонообмінного сорбенту і рухомою фазою мігрує в просторі між. Поділ заснований на електростатичному відштовхуванні, полярних та гідрофобних взаємодіях між розчиненими сполуками та сорбентом.

Аніоногенні групи на поверхні сорбенту діють як напівпроникна «мембрана» між стаціонарною та рухомою фазами. Негативно заряджені компоненти не досягають стаціонарної рухомої фази, тому що відштовхуються однойменно зарядженими функціональними групами і елююються в "мертвому" (вільному) об'ємі колонки. Компоненти в молекулярному вигляді не «відторгаються» катіонообмінним сорбентом і розподіляються між стаціонарною та рухомою фазами. Відмінність ступеня утримування неіонних компонентів суміші продиктована сукупністю полярних взаємодій неіонних компонентів з функціональними групами катіонообмінного сорбенту та гідрофобних взаємодій неіонних компонентів з неполярною матрицею сорбенту.

Хіральна хроматографія

Метою хіральної хроматографії є ​​поділ оптичних ізомерів. Поділ здійснюється на хіральних нерухомих фазах або на звичайних ахіральних нерухомих фазах з використанням хіральних рухомих фаз. В якості хіральних нерухомих фаз використовуються сорбенти з модифікованою поверхнею, групами або речовинами, що мають хіральні центри (хітозани, циклодекстрини, полісахариди, білки та ін. (хіральні селектори). В якості рухомих фаз у цьому випадку можуть використовуватися ті ж фази, що і в При використанні ахіральних нерухомих фаз для забезпечення поділу енантіомерів в рухомі фази додаються хіральні модифікатори: хіральні комплекси металів, нейтральні хіральні ліганди, хіральні іон-парні реагенти та ін.

Ультраефективна рідинна хроматографія

Ультраефективна рідинна хроматографія є варіантом рідинної хроматографії, що відрізняється більшою ефективністю в порівнянні з класичною високоефективною рідинною хроматографією.

Особливістю ультраефективної рідинної хроматографії є ​​використання сорбентів розміром частинок від 1,5 до 2 мкм. Розміри хроматографічних колонок зазвичай становлять від 50 до 150 мм у довжину та від 1 до 4 мм у діаметрі. Об'єм проби, що вводиться, може становити від 1 до 50 мкл. Використання таких хроматографічних колонок дозволяє значно зменшити час аналізу та підвищити ефективність хроматографічного поділу. Однак, при цьому тиск на колонці може досягати 80 - 120 МПа, необхідна частота збору даних детектора може зростати до 40-100 герц, позаколоночний обсяг хроматографічної системи має бути мінімізований. Хроматографічне обладнання та колонки, що використовуються в ультраефективній рідинній хроматографії, спеціально адаптовані для виконання вимог цього виду хроматографії.

Устаткування, призначене для ультраефективної рідинної хроматографії, може використовуватись і в класичному варіанті високоефективної рідинної хроматографії.

(переважно міжмолекулярних) на межі поділу фаз. Як спосіб аналізу, ВЕРХ входить до складу групи методів, яка, зважаючи на складність досліджуваних об'єктів, включає попереднє поділ вихідної складної суміші на відносно прості. Отримані прості суміші аналізуються звичайними фізико-хімічними методами або спеціальними методами, створеними для хроматографії.

Метод ВЕРХ знаходить широке застосування в таких областях, як хімія, нафтохімія, біологія, біотехнологія, медицина, харчова промисловість, охорона навколишнього середовища, виробництво лікарських препаратів та в багатьох інших.

За механізмом поділу аналізованих або поділюваних речовин ВЕРХ ділиться на адсорбційну, розподільну, іонообмінну, екслюзійну, лігандообмінну та інші.

Слід пам'ятати, що у практичної роботі поділ часто протікає по одному, а, по декількома механізмами одночасно. Так, екслюзійний поділ буває ускладнений адсорбційними ефектами, адсорбційний - розподільними, і навпаки. При цьому чим більша відмінність речовин у пробі за ступенем іонізації, основності або кислотності, за молекулярною масою, поляризацією та іншими параметрами, тим більша ймовірність прояву іншого механізму поділу для таких речовин.

Нормально-фазова ВЕРХ

Нерухома фаза більш полярна, ніж рухлива, тому у складі елюенти переважає неполярний розчинник:

• Гексан: ізопропанол = 95:5 (для малополярних речовин)
• Хлороформ:метанол = 95:5 (для середньополярних речовин)
• Хлороформ:метанол = 80:20 (для сильнополярних речовин)

Обернено-фазова ВЕРХ

Нерухома фаза менш полярна, ніж рухлива, тому у складі елюенту майже завжди є вода. В цьому випадку завжди можна забезпечити повне розчинення БАС у рухомій фазі, майже завжди можливо використовувати УФ-детектування, майже всі рухомі фази взаємно змішуються, можна використовувати градієнтне елюювання, можна швидко перерівноважити колонку, колонку можна регенерувати.

Звичайними елюентами для обернено-фазової ВЕРХ є:

• Ацетонітрил: вода
• Метанол:вода
• Ізопропанол: вода

Матриці для ВЕРХ

Як матриці у ВЕРХ використовуються неорганічні сполуки, такі як оксид кремнію (силікагель) або оксид алюмінію, або органічні полімери, такі як полістирол (зшитий дивінілбензолом) або поліметакрилат. Силікагель, звісно, ​​нині загальновизнаний.

Основні характеристики матриці:

• розмір часток (мкм);
• Розмір внутрішніх пір (Å, нм).

Одержання силікагелю для ВЕРХ:

1. Формування мікросфер полікремневої кислоти;
2. Сушіння частинок силікагелю;
3. Повітряне сепарування.

Частинки сорбенту:

• Регулярні (сферичні): вища стійкість до тиску, вища вартість;
• Несферичні: нижча стійкість до тиску.

Розмір часу в ВЕРХ - один з найважливіших параметрів. Чим менший розмір пір, тим гірша їхня проникність для молекул речовин, що елююються. А отже, тим гірша сорбційна ємність сорбентів. Чим більше пори, тим, по-перше, менше механічна стійкість частинок сорбенту, а, по-друге, тим менша сорбційна поверхня, отже, гірша ефективність.

Щеплення нерухомої фази

Нормально-фазова ВЕРХ:

• Нерухома фаза з пропілнітрильним щепленням (нітрильним);
• Нерухома фаза з пропіламінним щепленням (амінною).

Зворотно-фазова ВЕРХ:

• Нерухома фаза з алкільним щепленням;
• Нерухлива фаза з алкілсилільним щепленням.

Енд-кепування - захист нещеплених ділянок сорбенту додатковим щепленням «маленькими» молекулами. Гідрофобний енд-кеппінг (С1, С2): вища селективність, гірша змочуваність; гідрофільний енд-кеппінг (діол): нижче селективність, вище змочуваність.

Детектори для ВЕРХ

• Ультрафіолетовий
• Діодно-матричний
• Флуоресцентний
• Електрохімічний
• Рефрактометричний
• Мас-селективний

Посилання

Wikimedia Foundation. 2010 .

Дивитися що таке "Високоефективна рідинна хроматографія" в інших словниках:

високоефективна рідинна хроматографія- - [А.С.Гольдберг. Англо-російський енергетичний словник. 2006 р.] Тематики енергетика в цілому EN high performance liquid chromatographyHPLC … Довідник технічного перекладача

Термін високоефективна рідинна хроматографія Термін англійською high performance liquid chromatography Синоніми Абревіатури ВЕРХ, HPLC Пов'язані терміни адсорбція, олігопептид, протеоміка, сорбент, фулерен, ендоедральний, хроматографія… …

Рідина хроматографія, яка для підвищення ефективності поділу ритель (елюент) під тиском (більше 3х107 Па) прокачують через колонки, заповнені сорбентом з частинками малого діаметра (до 1 мкм), а також використовують перфузійні.

Вид хрому тографії, в якій рухомий фазою служитьрідкість (елюент), а нерухомої та. сорбент, тв. носій із нанесеною на його поверхню рідиною або гель. Здійснюють у колонці, заповненій сорбентом (колонова хроматографія), на плоскій… Природознавство. Енциклопедичний словник

- [κρώμα (υрома) колір] процес, заснований на неоднаковій здатності окремих компонентів суміші (рідкої або газоподібної) утримуватись на поверхні адсорбенту як при поглинанні їх з потоку носія, так і при… Геологічна енциклопедія

- (від ін. грец... Вікіпедія

Термін хроматографія Термін англійською chromatography Синоніми Абревіатури Пов'язані терміни високоефективна рідинна хроматографія, клатрат, лабораторія на чіпі, порометрія, протеом, протеоміка, сорбент, фермент, фулерен, ендоедральний… … Енциклопедичний словник нанотехнологій

Рідина хроматографія, заснована на разл. Можливості поділених іонів до іонного обміну з фіксир. іонами сорбенту, що утворюються внаслідок дисоціації іоногенних груп останнього. Для поділу катіонів використовують катіоніти, для ... Хімічна енциклопедія

ВЕРХ- високоефективна рідинна хроматографія. Словник скорочень російської мови

Високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ) один з ефективних методів поділу складних сумішей речовин, що широко застосовується як в аналітичній хімії, так і в хімічній технології. Основою хроматографічного поділу є … Вікіпедія

Книжки

• Практична високоефективна рідинна хроматографія, Вероніка Р. Майєр. Представляємо читачеві 5-те видання книги, яке розширено за рахунок сучасних методів та обладнання. У книзі багато доопрацьовано та додано велику кількість посилань. Ті місця у тексті, де…