висолення: осадження солями лужних, лужноземельних металів (хлорид натрію, сульфат магнію), сульфатом амонію; при цьому не порушується первинна структурабілка;
осадження: використання водовіднімних речовин: спирт або ацетон за низьких температур (близько –20 С).
При використанні цих методів білки позбавляються гідратної оболонки та випадають в осад у розчині.
Денатурація- Порушення просторової структури білків (первинна структура молекули зберігається). Може бути оборотна (структура білка відновлюється після усунення агента, що денатурує) або незворотна (просторова структура молекули не відновлюється, наприклад, при осадженні білків мінеральними концентрованими кислотами, солями важких металів).
Методи поділу білків Відділення білків від низькомолекулярних домішок
Діаліз
Використовують спеціальну полімерну мембрану, яка має пори певної величини. Малі молекули (низькомолекулярні домішки) проходять через пори в мембрані, а великі (білки) затримуються. Таким чином, білки відмивають від домішок.
Поділ білків за молекулярною масою
Гель-хроматографія
Хроматографічну колонку заповнюють гранулами гелю (сефадекс), що має пори певної величини. У колонку вносять суміш білків. Білки, розмір яких менший, ніж розмір пір сефадекса, затримуються в колонці, оскільки «застрягають» у порах, а інші вільно виходять із колонки (рис. 2.1). Розмір білка залежить з його молекулярної маси.
Мал. 2.1.Поділ білків методом гель-фільтрації
Ультрацентрифугування
Цей метод ґрунтується на різній швидкості седиментації (осадження) білкових молекул у розчинах з різним градієнтом щільності (сахарозний буфер або хлорид цезію) (рис. 2.2).
Мал. 2.2.Поділ білків методом ультрацентрифугування
Електрофорез
Даний метод ґрунтується на різній швидкості міграції білків та пептидів в електричному полі залежно від заряду.
Носіями для електрофорезу можуть бути гелі, ацетатцелюлоза, агар. Молекули, що розділяються, рухаються в гелі залежно від розміру: ті з них, які мають більші розміри, будуть затримуватися при проходженні через пори гелю. Найменші молекули зустрічатимуть менший опір і, відповідно, рухатимуться швидше. В результаті, після проведення електрофорезу, більші молекули будуть ближче до старту, ніж менші (рис. 2.3).
Мал. 2.3. Поділ білків методом електрофорезу в гелі
Методом електрофорезу можна розділити білки і молекулярної масі.Для цього використовують електрофорез у ПААГ у присутності додецилсульфату натрію (ДДS-Na).
Виділення індивідуальних білків
Афінна хроматографія
Метод заснований на здатності білків міцно зв'язуватися з різними нековалентними молекулами зв'язками. Використовується для виділення та очищення ферментів, імуноглобулінів, рецепторних білків.
Молекули речовин (ліганди), з якими зв'язуються специфічно певні білки, ковалентно з'єднують з частинками інертної речовини. Суміш білків вносять у колонку, і білок, що шукається, міцно приєднується до ліганду. Інші білки вільно виходять із колонки. Затриманий білок можна вимити з колонки за допомогою буферного розчину, що містить у вільному стані ліганд. Цей високочутливий метод дозволяє виділити в чистому вигляді дуже малі кількості білка клітинного екстракту, що містить сотні інших білків.
Ізоелектрофокусування
Метод заснований на різній величині ІЕТ білків. Білки розділяють методом електрофорезу на пластині з амфоліном (це речовина, у якої заздалегідь сформовано градієнт pH в діапазоні від 3 до 10). При електрофорезі білки поділяються відповідно до значення їх ІЕТ (в ІЕТ заряд білка дорівнюватиме нулю, і він не пересуватися в електричному полі).
Двовимірний електрофорез
Є поєднанням ізоелектрофокусування і електрофорезу з ДДС-Na. Проводять спочатку електрофорез у горизонтальному напрямку на пластині з амфоліном. Білки поділяються залежно від заряду (ІЕТ). Потім обробляють пластину розчином ДДС-Na та проводять електрофорез у вертикальному напрямку. Білки поділяються залежно від молекулярної маси.
Імуноелектрофорез (Вестерн-блот)
Аналітичний метод, який використовується визначення специфічних білків у зразку (рис 2.4).
Виділення білків із біологічного матеріалу.
Поділ білків за молекулярною масою методом електрофорезу в ПААГ із ДДС-Na.
Перенесення білків із гелю на полімерну пластину з метою полегшення подальших робіт.
Обробка пластини розчином неспецифічного білка для заповнення пір, що залишилися.
Таким чином, після цього етапу отримана пластинка, у порах якої містяться розділені білки, а простір між ними заповнений неспецифічним білком. Тепер треба виявити, чи серед білків є шуканий, відповідальний за якесь захворювання. Для виявлення використовують обробку антитілами. Під первинними антитілами розуміють антитіла до білка. Під вторинними антитілами розуміють антитіла до первинних антитіл. До складу вторинних антитіл додатково вводять спеціальну мітку (т.зв. молекулярний зонд), щоб потім можна було візуалізувати результати. Як мітки використовуються радіоактивний фосфат або фермент, що міцно пов'язані з вторинним антитілом. Зв'язування спочатку з первинними, а потім із вторинними антитілами переслідує дві мети: стандартизація методу та покращення результатів.
Обробка розчином первинних антитіл зв'язування відбувається там пластини, де є антиген (шуканий білок).
Видалення антитіл, що не зв'язалися (промивання).
Обробка розчином мічених вторинних антитіл для подальшого прояву.
Видалення вторинних антитіл (промивання), що не зв'язалися.
Мал. 2.4. Імуноелектрофорез (Вестерн-блот)
У разі присутності білка в біологічному матеріалі – на платівці з'являється смуга, що свідчить про зв'язування цього білка з відповідними антитілами.
Заголовок
2
2
Виділення та очищення білків здійснюється поетапно.
1. Гомогенізація– це ретельне подрібнення об'єктів біохімічного дослідження до однорідного, тобто гомогенного стану, тобто білки зазнають ретельної дезінтеграції до руйнування клітинної стінки.
При цьому використовують:
а)ножові гомогенізатори типу Уоррінга;
б)маточкові гомогенізатори Поттера - Ельвегейму;
в)кульові та валкові млини – для більш щільних об'єктів;
г)метод поперемінного заморожування та розморожування, при цьому розрив клітинної стінки відбувається під дією кристаликів льоду;
д)метод "азотної бомби" - під високим тиском клітини насичуються азотом, потім тиск різко скидають, виділяється газоподібний азот, який ніби підриває клітину зсередини;
е)УЗ, різні прес - методи, перетравлення клітинних стінок ферментами. У більшості випадків при гомогенізації виділяється тепло, при цьому багато білків можуть інактивуватися, тому всі процедури проводяться в холодних приміщеннях при t 0 або охолоджують сировину за допомогою льоду. При цьому ретельно контролюють обсяг та час руйнування клітин, робочий тиск. Ідеальним вважається такий гомогенізат, який може зазнати подальшого екстрагування.
2. Екстракція білків, тобто їх переведення в розчинений стан; найчастіше екстракцію проводять разом із подрібненням одночасно.
Екстракцію проводять:
а)розчиненням у 8-10% розчинах солей;
б)з використанням буферних розчинів з рН від кислих до слаболужних (боратних, фосфатних, цитратних, трис-буферних: суміш трисамінометану з NH2 – CH3 + HCl;
в)осадження білків органічними розчинниками (етанол, метанол, бутанол, ацетон та їх комбінаціями), при цьому відбувається розщеплення білково-ліпідних та білково-білкових компонентів, тобто руйнування ЧСЛ.
3. Очищення та фракціонування білків.Після екстрагування проводять поділ або фракціонування суміші на індивідуальні білки та їх подальше очищення:
а) висолення– це процес осадження білків нейтральними сольовими розчинами лужних та лужноземельних металів.
Механізм висолення- аніони і катіони, що додаються, руйнують гідратну білкову оболонку білків, що є одним з факторів стійкості білкових розчинів. Найчастіше застосовуються розчини сульфатів Na та амонію. Багато білків відрізняються за розміром гідратної оболонки та величиною заряду. Для кожного білка є своя зона висолення. Після видалення агента висолює білок зберігає свою біологічну активність і фізико-хімічні властивості. У клінічній практиці застосовується метод висолювання для поділу глобулінів (при додаванні 50% розчину сульфату амонію (NH 4)2SO 4 випадає осад) та альбумінів (при додаванні 100% розчину сульфату амонію (NH 4)2SO 4 випадає осад).
На величину висолювання впливають:
1) природа та концентрація солі;
2) рН-середовища;
3) температура.
Головну роль у своїй грають валентності іонів. Тому дію солі оцінюють за іонною силою розчину μ:
тобто іонна сила розчину (μ) дорівнює добутку ½ концентрації кожного іона (С) на квадрат його валентності (V).
Метод Кона є різновидом висолення. Одночасно відбувається екстракція та осадження компонентів. Змінюючи послідовно температуру (зазвичай низькі t o –0+8 o С), рН розчину та концентрованого етанолу, із плазми крові послідовно виділяють до 18 фракцій білків.
Метод Коназастосовують у фармацевтичному виробництві при отриманні кровозамінників;
б) методи хроматографії. Основоположником розробки хроматографічних методів аналізу вважається російський учений Михайло Колір (1903). Нині є багато її різновидів. В основі методу лежить здатність речовин специфічно адсорбуватися на адсорбенті, укладеному в колонку або вміщеному на якомусь носії. При цьому відбувається поділ аналізованих речовин та їх концентрування в певному шарі адсорбенту. Потім через колонку пропускають відповідні елюенти (розчинники), які послаблюють сили адсорбції та вимивають адсорбовані речовини з колонки. Речовини збираються у колекторі фракцій.
Основним у хроматографії є коефіцієнт розподілу, який дорівнює відношенню концентрації речовини в рухомий фазідо концентрації речовини в нерухомій фазі(або стаціонарної фази).
Нерухома стаціонарна фаза- може бути твердою або рідкою або сумішшю твердої та рідкої.
Рухома фаза- Рідка або газоподібна, вона тече по стаціонарній, або пропускається через неї.
Залежно від виду стаціонарної та рухомої фази бувають різні модифікації хроматографічного аналізу.
Адсорбційна– заснована на різному ступені адсорбції білків адсорбентом та розчинності їх у відповідному розчиннику.
Адсорбенти, що застосовуються - кремнієва кислота, Al 2 Про 3 , CaCO 3 , MgO, деревне вугілля. Адсорбент у вигляді суспензії з розчинником (частіше з буферним розчином) пакують у колонці (скляна вертикальна трубка). Зразок наносять на колонку, потім через неї пропускають розчинник чи суміш розчинників.
Поділ заснований на тому, що речовини з більш високим До розпр. (Б), просуваються по колонці з більшою швидкістю. Збір фракцій здійснюється за допомогою колектора фракцій.
Розподільча хроматографія– заснована на розподіл суміші білків між двома рідкими фазами. Поділ може відбуватися на спеціальному хроматографічному папері, а також у колонках, як в адсорбційному. Тверда фаза у разі служить лише опорою для рідкої стаціонарної фази. Хроматографічний папір має властивість затримувати воду між своїми целюлозними волокнами. Ця вода – нерухома стаціонарна фаза. Коли по паперу під дією капілярних сил рухається неводний розчинник (рухлива фаза), молекули речовини, нанесеної на папір, розподіляються між двома фазами відповідно до їх коефіцієнта розподілу. Чим вище розчинність речовини в рухомій фазі, тим далі вона просунеться по паперу разом із розчинником.
У разі розподілу хроматографії на колонці – носії – це целюлоза, крохмаль, силікагель та ін, нерухома фаза – вода. При нанесенні на колонку речовини суміші рухаються по колонці з різною швидкістюз урахуванням Краспр.
Rf для кожного з'єднання у стандартних умовах величина постійна.
Іонообмінна хроматографія – заснована на тяжінні протилежно заряджених частинок. Для цього використовують різні іонообмінні смоли: катіонообмінні – містять негативно заряджені групи – сульфовані стироли та КМЦ, які притягують позитивно заряджені іони досліджуваних речовин. Їх називають також кислотними іонообмінниками.
Аніонообмінні смоли, або основні іонообмінники, містять позитивно заряджені групи, що притягують негативно заряджені молекули білків
Триметиламіностирол, це похідне стиролів та целюлози.
Залежно від q білків, що розділяються, використовують відповідні іонообмінники, з якими взаємодіють певні білки, а інші безперешкодно виходять з колонки. Обложені на колонці білки знімають, використовуючи більш концентровані сольові розчини або змінюючи рН елюентів.
Афінна хроматографія (або хроматографія за спорідненістю) заснована на принципі вибіркової взаємодії білків або інших макромолекул з іммобілізованими на носіях специфічними речовинами – лігандами (це може бути кофермент, якщо виділяють фермент, антитіло антиген та ін. Завдяки високій специфічності білків до них тільки один білок із суміші Змивається буферними сумішами зі зміненим рН або зміненою іонною силою.
Гідність – можливість одноетапно виділити задану речовину високого ступенячистоти.
Метод гель – фільтрації або метод молекулярних «сит» – це різновид проникаючої хроматографії.
Поділ молекул за розмірами та формою заснований на властивостях молекулярного сита, які мають багато пористих матеріалів, наприклад органічні полімери з тривимірною сітчастою структурою, що надає їм властивості гелів. Гель фільтрація – це поділ речовин за допомогою гелів, заснований на відмінностях у розмірі молекул (сефарозу, сефадекс, сефакрил, біогелі тощо). Під дією епіхлоргідрину полісахаридні ланцюжки декстрану (синтезується мікроорганізмами) зшиваються в сітчасту структуру, стають нерозчинними у воді, але зберігають до неї велику спорідненість. Завдяки цій гідрофільності отримані зерна (звані сефадекс) сильно набухають з утворенням гелю, яким заповнюють колонку. Метод заснований на тому, що великі молекули не проникають у внутрішню водну фазу, а дрібніші молекули спершу проникають у пори «сита», як би застрягають у них, а тому рухаються з меншою швидкістю. Відповідно білки з більшою Mr першими надходять у приймач. Останнім часом у проникаючій хроматографії все частіше використовують як молекулярний сит пористі скляні гранули.
Електрофоретичний метод біохімії – заснований на відмінності швидкості пересування молекул в електричному полі (амінокислоти, пептиди, білки, нуклеїнові кислоти).
Відмінність швидкості руху залежить:
1. від q молекули: рухливість молекул тим більше, що більше сумарний q. Розмір q залежить від рН;
2. від розмірів молекул: що більше молекули, то менше їх рухливість. Це пов'язано зі зростанням сил тертя та електростатичних взаємодій великих молекул з довкіллям;
3. від форми молекул: молекули однакового розміру, але різної форми, наприклад, фібрил і глобул білка мають різну швидкість. Це пов'язано з відмінностями в силах тертя та електростатичної взаємодії.
Види електрофорезу
а) Ізоелектричне фокусування. Поділ відбувається на вертикальній колонці у град. як рН, і напруги. За допомогою спеціальних носіїв амфолітів у колонці встановлюється град. рН від 0 до 14. У колонку поміщають суміш речовин, підключаю електрострум. Кожен із компонентів рухається до тієї частини колонки, де значення рН відповідає його ізоелектричній точці і там зупиняється, тобто фокусується.
Перевага: відбувається поділ, очищення та ідентифікація білків в один прийом. У методу висока роздільна здатність (0,02 pI).
б) Ізотахофорез – це електрофорез на підтримуючих середовищах. Після включення електроструму іони з найвищою рухливістю рухаються до відповідного електрода першими, з найнижчою - останніми, що мають проміжну рухливість - розташовуються посередині.
в) Диск-електрофорез – прилад складається з двох судин з буфером – верхньої та нижньої, з'єднаних вертикальними трубками, що містять різнопористий гель. У міру руху іонізованих частинок під дією електроструму. Вища пористість – у верхній частині гелю.
г) Імуноелектрофорез – метод, що поєднує електрофорез з імунодифузією (для виявлення антигенів у складних фізіологічних сумішах). На спеціальний носій перпендикулярно один одному поміщають суміш антигенів та суміш антитіл. При включенні електроструму вони поділяються на індивідуальні речовини та дифундують на гелевому носії. На місці зустрічі антигену з відповідним антитілом відбувається специфічна реакція преципітації у формі дуги. Кількості дуг, що утворилися, відповідає кількості антигенів.
Методи визначення Mr білків
У багатьох білків хімічний складі послідовність амінокислот не встановлена (1010-1012 білків), тому такі білки визначають Mr. У цьому використовуються різні методи.
а) Седиментаційний метод – визначення Mr проводять у спеціальних центрифугах (перша центрифуга була запропонована шведським біохіміком Сведбергом), у яких вдається створити відцентрове прискорення, яке більше 200 тис. і більше разів прискорення земного тяжіння. Mr визначають за V седиментацією молекул. Принаймні переміщення молекул від центру до периферії утворюється різка межа білок-розчинник. Швидкість седиментації виражають через константу седиментації (S):
де V - швидкість переміщення кордону білок-розчинник (см/с);
– кутова швидкістьротора (рад/с);
– відстань від центру ротора до середини осередку із розчином білків (см).
Розмір константи седиментації S, яка дорівнює 110–13 З умовно прийнята за 1 і називається 1 Сведбергом (S). S для білків лежить у межах 1-50 S, іноді до 100 S.
Mr білків визначається за рівнянням Сведберга:
де R – універсальна постійна газова;
Т - абсолютна температура по Кельвіну;
S – константа седиментації;
Д – коефіцієнт дифузії;
– щільність розчинника;
V – парціальний питомий обсяг газу.
Цей метод дорогий через застосування апаратури.
Простіші та дешевші:
б) Гель-фільтрація у тонкому шарі сефадекса.
Довжина пробігу білка (мм) знаходиться в логарифмічній залежності від Mr.
Х - Mr шуканого білка на калібрувальному графіку.
в) Диск-електрофорез у поліакриламідному шарі – також існує залежність між логарифмом Mr калібрувальних білків та довжиною їх пробігу.
Методи визначення гомогенності білків
Ступінь чистоти виділеного білка визначається:
- ультрацентрифугуванням;
- методом диск – електрофорезу;
- різними імунохімічними методами;
- визначенням розчинності білка (метод Нортропа) заснований на правилі фаз, згідно з яким розчинність чистої речовини за умов досвіду залежить тільки від температури, але не залежить від концентрації речовини в твердій фазі.
Якщо білок гомогенний, то на графіці виходить один перегин (а), якщо є домішки білків (б, в), отримаємо кілька перегинів кривої насичення. У всіх білків свої індивідуальні криві розчинності.
Розглянуті питання:Методи виділення органел та мембран з тканин, клітини.
Етапи субклітинного фракціонування: екстракція,
гомогенізація та центрифугування, їх особливості.
Методи поділу та очищення субклітинних компонентів.
Виділення мембранних частинок.
Ідентифікація мембранних фракцій, критерії їхнього очищення.
Контроль наявності домішок за допомогою світлової та
електронної мікроскопії, аналізу ліпідного складу або
визначення активності маркерних ферментів.
Визначення білкового складу у виділених мембранних
фракціях. Визначення активності маркерних ферментів
певного типу виділеної мембранної фракції Отримання окремих клітинних компонентів дає змогу вивчати
їх біохімію та функціональні особливості. Наприклад, можна створити
безклітинну систему для рибосом, які синтезуватимуть білок
за заданою експериментатором інформаційної РНК. Виділені
мітохондрії в підібраних умовах можуть здійснювати синтез АТФ, на
виділеному хроматині за участю відповідних ферментів може
відбуватися синтез РНК тощо.
Останнім часом застосовуються безклітинні системи для відтворення
клітинних надмолекулярних структур. Так, використовуючи очищені від
гранул жовтка екстракти цитоплазми яєць земноводних або морських яєць
їжаків, можна отримати ядра з ядерною оболонкою із введеної в цю
безклітинну систему чужорідної ДНК (наприклад, ДНК бактеріофага)
Така ДНК пов'язується з білками-гастонами, які є в надлишку
такому екстракті, утворюється хроматин (дезоксирибонуклеопротеїд),
який покривається подвійною мембранною оболонкою, що несе навіть
ядерні пори. Такі модельні системи допомагають вивчати тонкі,
інтимні процеси, наприклад транспорт макромолекул з цитоплазми
ядро, і навпаки. У цитоплазматичних екстрактах яєць земноводних та
голкошкірі такі ядра можуть періодично ділитися шляхом мітозу. Ці
моделі зробили величезний внесок у розшифровку природи регуляції
клітинного циклу. Для того щоб виділити клітинні органели,
досліджуваний зразок подрібнюють і
потім гомогенізують у забуференому середовищі з
використанням гомогенізатора Поттера-Елведжема
(тефлоновий маточка, що обертається в скляному
циліндрі). Це порівняно м'який метод, який
особливо переважний для виділення лабільних
молекул та ультраструктур. Інші методики руйнування
клітин включають ферментативний лізис, що руйнує
клітинні стінки, або механічне руйнування
заморожених тканин (розмолом або за допомогою
обертових ножів; під великим тиском;
осмотичний шок; багаторазовим чергуванням
заморожування та відтавання). Для виділення інтактних органел важливо, щоб середовище, в якому
проводиться гомогенізація, була ізотонічною, тобто.
осмотичний тиск буфера повинен відповідати тиску
всередині клітини. Якщо розчин гіпотонічний, органели будуть
«вбирати» додаткову воду і луснуть, а в
Гіпертонічні розчини вони, навпаки, зморщуються.
Після гомогенізацією слід фільтрування видалення
інтактних клітин та сполучних тканин. Власне
фракціонування клітинних органел проводиться за допомогою
диференціального центрифугування, тобто. центрифугування
за різних швидкостях обертання ротора. При цьому ступінчасте
збільшення відцентрової сили (яку прийнято висловлювати
величиною, кратною нормальному прискоренню вільного падіння g
= 9,81 м/с2) призводить до послідовного осадження різних
органел, тобто. їх поділу відповідно до щільності та
розміром. Одним з основних способів виділення клітинних структур є
диференційне (розділове) центрифугування. Принцип його
застосування в тому, що час осадження частинок у гомогенаті залежить від їх
розміру та щільності: чим більше частка або чим вона важча, тим швидше
вона осяде на дно пробірки. Для прискорення процесу осідання варіюють
прискорення, створювані центрифугою.
При центрифугуванні насамперед і при невеликих прискореннях осядуть ядра
і неруйновані клітини, при 15-30 тис. g осядуть великі частинки,
макросоми, що складаються з мітохондрій, дрібних пластид, пероксисом,
лізосом та ін., при 50 тис. g осядуть мікросоми, фрагменти вакуолярної
Системи клітини.
При повторному дробовому центрифугуванні цих змішаних підфракцій
можна одержати чисті фракції. Так, при поділі макросомної
підфракції одержують окремо мітохондрії, лізосоми, пероксисоми. При
розділення мікросом можна отримати фракцію мембран апарату Гольджі,
фрагментів плазматичної мембрани, вакуолей, гранулярного ретикулуму У
випадках більш тонкого поділу фракцій використовують центрифугування в
градієнт щільності сахарози, що дозволяє добре розділити компоненти,
навіть трохи відрізняються один від одного за питомою масою. Виділення клітинних органел зазвичай проводять при низьких
температурах (0-5°С) для того, щоб зменшити ступінь
деградації матеріалу за рахунок реакцій, що каталізуються
ферментами; останні вивільняються у процесі руйнування
тканини. Додавання тіолів і хелатуючих агентів необхідне
захисту функціональних SH-груп від окиснення.
Перш ніж виділені фракції аналізувати біохімічними
способами, необхідно перевірити їх на чистоту за допомогою
електронний мікроскоп.
Отримання окремих клітинних компонентів дає можливість
вивчати їхню біохімію та функціональні особливості. Так можна
створити безклітинну систему для рибосом, які будуть
синтезувати білок за заданою експериментатором
інформаційної РНК. Виділені мітохондрії у підібраних
умовах можуть здійснювати синтез АТФ, на виділеному хроматині
за участю відповідних ферментів може відбуватися
синтез РНК тощо. Основи методу центрифугування
Частинки в розчині осідають (седиментація),
коли їх щільність вища за щільність розчину, або
спливають (флотація), коли їх щільність нижче
густини розчину. Чим більша різниця в
густини, тим швидше йде розподіл часток.
Коли густини частинок і розчину однакові
(ізопікнічні умови), частки залишаються
нерухомими. При малій різниці в щільності
частинки можна розділити тільки в центрифузі,
яка створює відцентрову силу, багато разів
що перевищує силу земного тяжіння. співвідношення між щільністю та коефіцієнтом седиментації для
різних частинок у розчині хлориду цезію (CsCI). Швидкість седиментації частки (ν) залежить від кутової
швидкості (ω), ефективного радіуса ротора rеф(відстань від
осі обертання) та седиментаційних властивостей частинок.
Седиментаційні властивості частки
характеризуються коефіцієнтом седиментації S та
виражаються у одиницях Сведберга (1S = 10-13с).
Величина S може коливатися у межах. Для
порівняння коефіцієнтів седиментації у різних середовищах
їх зазвичай коректують за щільністю і в'язкістю води
20oC (S20w).
Коефіцієнт седиментації залежить від молекулярної маси
(М) частинки, її форми (коефіцієнт тертя f),
парціального питомого обсягу ΰ (величина, обернена
густини частинки).
Центрифугування у градієнті щільності
Макромолекули або органели, які незначно відрізняються за розміром або щільністю,
можна розділити центрифугуванням у градієнті щільності. Для цих цілей використовуються два
методу.
При зональному центрифугуванні аналізована проба (наприклад, білки або клітини)
нашаровується тонким шаром поверх буферного розчину. У процесі центрифугування частки
проходять через розчин, так як їх щільність вище за щільність розчину. Швидкість руху
залежить від маси та форми частинок (див. формули на схемі А). Центрифугування припиняють
перш ніж частинки досягнуть дна центрифужної пробірки. Потім дно проколюють і
збирають низку фракцій, що містять різні частинки. Стабільність градієнта щільності в
процесі центрифугування досягається застосуванням розчинів вуглеводів або колоїдного
силікагелю, концентрація яких зростає від поверхні до дна пробірки. Градієнт густини
перешкоджає утворенню конвекційних потоків, що знижують якість поділу.
При ізопікнічному центрифугуванні пробу (наприклад, ДНК, РНК або віруси) рівномірно
розподіляють у всьому обсязі розчину (зазвичай CsCI). У цьому випадку поділ триває
значно довше, ніж при зональному центрифугуванні. Градієнт щільності створюється в
процесі центрифугування за рахунок седиментації дифузії. Згодом кожна частка
потрапляє в область, що відповідає її власній плавучій густині. Центрифугування
припиняють, коли встановлюється рівновага. Отримані фракції аналізують, використовуючи
відповідну вимірювальну техніку. Молекули-маркери
У процесі фракціонування важливо
контролювати чистоту фракцій Присутність
у певній фракції тієї чи іншої
органели та наявність інших компонентів
визначають за допомогою молекул-маркерів.
Зазвичай це органелоспецифічні
ферменти (ферменти-маркери).
Розподіл ферментів-маркерів у клітці
відображає локалізацію у ній
відповідних каталітичних реакцій. Функції та склад біомембран
Найбільш важливими мембранами у тваринних клітинах
є плазматична мембрана, внутрішня та
зовнішня ядерна мембрана, мембрана
ендоплазматичного ретикулуму та апарату Гольджі
, внутрішні та зовнішні мітохондріальні
мембрани. Лізосоми, пероксисоми, різні
везикули також відокремлені від цитоплазмимембранами
. Клітини рослин містять додатково мембрани
хлоропластів, лейкопластів та вакуолей. Усе
мембрани полярні, тобто. існує відмінність у
складах внутрішнього та зовнішнього по відношенню до
цитоплазмі шарів. Біомембрани та їх складові виконують такі функції:
1. Обмеження та відокремлення клітин та органел. Відокремлення клітин від міжклітинної
середовища забезпечується плазматичною мембраною, що захищає клітини від
механічного та хімічного впливів. Плазматична мембрана забезпечує
також збереження різниці концентрацій метаболітів та неорганічних іонів між
внутрішньоклітинним та зовнішнім середовищем.
2. Контрольований транспорт метаболітів та іонів визначає внутрішнє середовище, що
значно для гомеостазу, тобто. підтримки постійної концентрації метаболітів та
неорганічних іонів та інших фізіологічних параметрів. Регульований та
виборчий транспорт метаболітів та неорганічних іонів через пори та
за допомогою переносників стає можливим завдяки відокремленню клітин та
органел за допомогою мембранних систем.
3. Сприйняття позаклітинних сигналів та їх передача всередину клітини, а також ініціація
сигналів.
4. Ферментативний каталіз. У мембранах на межі між ліпідною та водною фазами
локалізовані ферменти. Саме тут відбуваються реакції з неполярними
субстратами. Прикладами служать біосинтез ліпідів та метаболізмнеполярних
ксенобіотиків. У мембранах локалізовані найважливіші реакції енергетичного.
обміну, такі, як окисне фосфорилювання (дихальний ланцюг) та фотосинтез.
5. Контактна взаємодія з міжклітинним матриксом та взаємодія з іншими
клітинами при злитті клітини утворенні тканин.
6. Заякорювання цитоскелета, що забезпечує підтримання форми клітин та органел
та клітинної рухливості. Після гомогенізації зразка, центрифугування гомогенату з
різною швидкістю отримують окремі фракції, що містять
клітинні ядра, мітохондрії та інші органели, а також
надосадову рідину, в якій знаходяться розчинні
білки цитозол клітини.
Екстракція білків, пов'язаних з мембранами, та руйнування
олігомірних білків на протоміри
Якщо шуканий білок міцно пов'язаний із будь-якими структурами
клітини його необхідно перевести в розчин.
Для руйнування гідрофобних взаємодій між білками
та ліпідами мембран у розчин додають детергенти: Частіше
всього використовують тритон Х-100 або додецилсульфат натрію.
При дії детергентів зазвичай руйнуються та гідрофобні
взаємодії між протомірами в олігомерних білках Видалення з розчину небілкових речовин
Нуклеїнові кислоти, ліпіди та інші
небілкові речовини можна видалити з розчину, використовуючи їх особливі фізикохімічні
властивості. Так, ліпіди легко
видаляються
з
розчину
додаванням
органічних
розчинників,
наприклад
ацетону. Однак вплив повинен бути
короткочасним. так як ацетон викликає
денатурацію деяких білків. Нуклеїнові
кислоти беруть в облогу додаванням в розчин
стрептоміцину. Виділення ліпідів мембран здійснюють відразу після отримання мембранної
фракції, яку необхідно захищати від дії протео- та ліполітичних
ферментів, автоокислення.
Зазвичай усі процедури проводять за низької температури, підтримуючи певні
значення pH та іонної сили. Для екстракції ліпідів використовують суміш хлороформ-
метанол. Для одночасної екстракції білків та ліпідів з тіней еритроцитів їх
екстрагують сумішшю бутанол-вода. У цьому більшість білків перетворюється на
водний, а ліпіду в бутанольний шар.
Кількісний аналіз складних сумішей фосфоліпідів проводять
хроматографічними методами. Для препаративних цілей переважно використовують
хроматографію на шпальтах. Для мікроаналітичних досліджень успішно
застосовують тонкошарова хроматографію, за допомогою якої можна розділити
практично всі класи ліпідів, локалізувати та ідентифікувати їх при
використання спеціальних реактивів.
По елююючої здатності розчинники розташовуються в наступному
зростаючому порядку петролейний ефір, цикло-гексан, чотирихлористий вуглець,
толуол, бензол, хлороформ, діетиловий ефір, етилацетат, ацетон, н-пропанол,
етанол, метанол, вода. Після пропускання розчинників платівку висушують на
повітрі та ідентифікують ліпіди за допомогою фарбування специфічними
реагентами. Для кількісного визначення фосфоліпідів, розділених
тонкошаровою хроматографією, використовують спектрофотометричні методи. Дослідження мембран у значній
мірою базуються на двох основних
методичних прийомах: це розбирання
нативної (тобто природної) мембрани на
складові її елементи та наступна
повне або часткове складання штучної
мембрани з використанням всіх або
частини компонентів вихідної мембрани
Щодо мембран ці прийоми
отримали назву "солюбілізація" та
"Реконструкція». Для солюбилізації краще використовувати детергенти з
низькою ККМ, оскільки такі детергенти легші
вбудовуються в мембрану та швидше викликають її
розпад до змішаних міцел. У цій якості
найефективніші іонні детергенти.
Як параметри, що характеризують здатність
детергентів до міцелоутворення, зазвичай
використовують критичну концентрацію
міцелоутворення (ККМ) та число агрегації. ККМ -
це та концентрація, при якій детергент починає
утворювати міцели. До цього він перебуває у воді
у мономерній формі у стані істинного
розчину. Число агрегації показує, скільки
молекул детергенту посідає одну міцеллу. Найчастіше використовуються чотири основні способи видалення
детергенту: діаліз, гель-фільтрація, сильне розведення
солюбілізату та адсорбція детергенту на гідрофобних полімерах.
Швидший спосіб заснований на видаленні детергенту за допомогою
гель-фільтрації, коли солюбілізат пропускають через інертний
гель, розмір пір якого досить великий, щоб утримати
молекули детергенту, але малий у порівнянні з такими, що утворюються
мембранними частинками, які вільно проходять між
гранулами гелю.
З максимальною повнотою детергент може бути вилучений з мембрани
шляхом його адсорбції на гідрофобних полімерах. Цей спосіб
особливо хороший для видалення залишкових кількостей детергенту з
вже сформованих мембранних частинок. Однак для видалення
Детергент з вихідного солюбілізату він малопридатний, так як на
початкових стадіях реконструкції видалення детергенту може
супроводжуватися адсорбцією значних кількостей білка та ліпіду
на полімері. Тому зазвичай цей метод використовують у комбінації з
іншими способами кінцевої стадії видалення детергенту.
високою здатністю зберігання, що гарантує їх активний біологічний початок.
ЛІТЕРАТУРА
1. Кличкова Г.Ю. Розробка технології комплексного препарату з хрящової тканини кальмара, лосося та осетра // Матеріали Всерос. Інтернет-конф. молоді вчені. – Владивосток: ТІН-РО-Центр, 2004. – С. 164-170.
2. Мецлер Д. Біохімія. Т. 2. – М., 1980. – 605 с.
3. Суховерхова Г.Ю. Біохімічна характеристика хрящової тканини гідробіонтів та технологія БАД до їжі: Дис. ... канд. техн. наук. – Владивосток, 2006. – 157 с.
4. Ситова М.В. Наукове обґрунтування комплексної переробки амурських осетрових риб: Автореф. дис. ... канд. техн. наук
М.: ВНІРО, 2005. – 24 с.
Кафедра харчової біотехнології
Надійшла 07.02.07 р.
ІДЕНТИФІКАЦІЯ БІЛКОВИХ КОМПОНЕНТІВ КЕРА ТИНОВОГО ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГІДРОЛІЗАТУ
Ч.Ю. ШАМХАНОВ, Л.В. АНТИПОВА
Грозненський державний нафтовий інститут Воронезька державна технологічна академія
Одним з найбільш ефективних способівобробки вторинних ресурсів м'ясної та птахопереробної промисловості є застосування методів сучасної біотехнології для отримання харчових гідролізатів. Функціонально-технологічні властивості одержаних продуктів залежать від біохімічного складу та молекулярної маси його білкових компонентів.
При використанні фізико-хімічних методівдля визначення молекулярної маси білків результат залежить як від маси, а й від електричного зарядуформи молекули білка, особливо при зміні швидкості дифузії білка, швидкості седиментації в гравітаційному полі . У зв'язку з цим щодо молекулярних масбілків краще використовувати статистичні методи, коли білковий розчин знаходиться в стані рівноваги, наприклад, при пропусканні його через колонку, заповнену гелем .
Мета роботи – визначення молекулярної маси М білкових компонентів кератинового ферментативного гідролізату та його біохімічного складу.
Для визначення молекулярної маси білкових компонентів кератинового гідролізату застосовували метод гель-фільтрації. Використовували сефадекс-100 (середній, діаметр частинок 40-120 мкм) з межами фракціонування 4000-150000 Так.
Колонку розмірами 46,0 х 1,9 см заповнювали сефа-дексом, обробленим 0,02 М універсальним буфером з рН 7,0. Наносили на неї 1,5 см3 розчину -7 мг/см3 - кератинового гідролізату та елюювали тим самим універсальним буфером зі швидкістю 12 см3/год. Збирали фракції по 3 см3 і потім визначали вміст білка спектрофотометрически на СФ-46 при 280 нм. Для визначення молекулярної маси фракцій кератинового гідролізату колонку з сефадекс попередньо проградуювали в тих же умовах за допомогою декількох чистих (маркерних) білків з відомою М. Калібрувальну криву будували, використовуючи лінійну залежність між ^ М і об'ємом
елюату Уе, що вийшов із колонки. У табл. 1 представлені деякі фізико-хімічні характеристики білків маркерних.
Таблиця 1
Маркерний білок М, Так 1§ м V, см3
Лізоцим 13930 4,143 54
Трипсин 25700 4,409 48
Пероксидаза 34000 4,531 45
Бичачий альбумін 68000 4,832 36
Блакитний декстран 2000000 6,301 21
Водорозчинна фракція
керопептида<10000 2,845 72
Водорозчинна фракція кератинового гідролізату виходить з колонки значно меншому обсязі, ніж маркерний білок лізоцим з найменшою молекулярною масою. Отже, в кератиновому гідролізаті (керопептиді) відсутні білкові фракції з М> 13930 Так. Орієнтовна маса продуктів гідролізу знаходиться нижче рівня 10000 Так, що визначається методом гель-фільтрації на сефадексі-100 маркерними білками. Лінійна залежністьміж ^ М білків та обсягом елюату Уе, що вийшов з колонки, представлена на рис. 1 (1 - блакитний декстран; 2 - бичачий альбумін; 3 - пероксидаза; 4 - трипсин; 5 -лізоцим; 6 - водорозчинна фракція керопептиду).
У зв'язку з відсутністю маркерних білків в досліджуваному діапазоні 10000-5000 Так пошук фракції білка водорозчинного здійснювали за допомогою порис-
Таблиця 2
М, Так Розчинний білок і пептиди, мг/см3 Сумарні пептиди та амінокислоти, мкг/см3 Тирозин, мкмоль/см3 Редукуючі речовини, мкг/см3
0-10000 5,64 7337 7,835 2815
0-5000 4,21 5278 5,960 2272
% від вихідної 74,6 71,9 76,1 80,7
тих мембран марок УПМ-100 та УАМ-50 на лабораторній ультрафільтраційній установці (ЗАТ НВО «Техкон»). Схема включала саму установку з 5% розчином керопептиду, вміщену для його постійного перемішування на магнітну мішалку. Для ефективного поділу білкового розчину у верхню частину установки під тиском подавали стиснене повітря. Продукти гідролізу проходили через пористі мембрани, які по черзі змінювалися в залежності від бажаної молекулярної маси ультрафільтрату, в нижню частину установки і збиралися в приймальну ємність. В отриманих ультрафільтрат визначали ряд біохімічних показників, що дозволяють оцінити розподіл продуктів гідролізу по молекулярній масі (табл. 2).
У керопептиді є низькомолекулярні білки з М 5000-10000 Так. Їх масова частка оцінюється як різниця у показаннях для фракцій 0-10000 та 0-5000 Так і становить 1,43 мг/см3. Ця фракція дала також позитивну реакцію на нінгідринову реакцію (2059 мкг/см3), тирозин (1,875 мкмоль/см3) та редукуючі речовини (543 мкг/см3). Однак основна частка продуктів гідролізу зосереджена в більш низькомолекулярній фракції М< 5000 Да, соответствующей по существующей классификации фракции пептидов. Массовая доля всех исследуемых показателей составляет более 7 0% от аналогичных значений во фракции 0-10000 Да.
Подальше визначення молекулярної маси водорозчинних білкових фракцій керопептиду проводили на сефадекс в-25 (середній, діаметр частинок 50-150 мкм), що дозволяє встановлювати її в межах фракціонування 1000-5000 Да. Умови проведення гель-фільтрації залишалися незмінними. за
результатами визначення білка у фракціях будували профіль елюції. У всіх фракціях крім білка визначали вміст низькомолекулярних речовин нінгідриновим методом, тирозину та редукуючих речовин (РВ), а також встановлювали кількісний розподіл білкових фракцій. На рис. 2 представлена гель-хроматограма ферментативного кератинового гідролізату через сефадекс в-25 (крива 1 - білок; 2 - нінгідринова проба; 3 - тирозин; 4 - РВ).
У цьому випадку білок виявляється у вигляді двох невеликих піків практично в перших фракціях. Масова частка білка у фракціях № 1-8 з 3-24 см3
має досить високі значення та становить 0,12-0,18 мг/см3 (крива 1).
Основна маса продукту виходила з колонки у вигляді максимального піку білка об'ємом 27 см3 елюату (фракція № 9, 3 см3 елюату). Масова частка білка у цій фракції зареєстрована лише на рівні 0,66 мг/см3, що у 3-4 разу вище, ніж у інших досліджуваних фракціях.
Подальша елюція керопептиду в діапазоні об'ємів 36-96 см3 виявила три піки зі зниженням масової частки білка не більше 0,08 мг/см3. Повністю розчин керопептиду елююється у кінцевому обсязі 96 см3.
У фракції № 9 виявлено всю кількість наявних РВ масовою часткою 66 мкг/см3 (крива 4). Нінгідринову реакцію застосовували при гель-хроматографії для ідентифікації розподілу продуктів гідролізу молекулярною масою. Встановлено, що при взаємодії надмірної кількості нінгідрину та білкових продуктів зі вільною МН2-групою та залежно від кількості цих груп можна визначити місцезнаходження білкових
РВ, мкг/см3 175 з Г 5 о л; ,7 0,
100 125 X - 3 з о. 0,5
80 § 100 2 _ н 0,4
60 1 ізін, 7 сл 0,3
40 1 л 5 про - (П 2 про I-0,2
20 25 _ 2 ай О 0,1
6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 90 96 V, см
похідних під час елюції через сефадекс. Так, низька масова частка нінгідрину (4-6 мкг/см3) дуже точно відображає кількість вільних аміногруп і визначає знаходження високомолекулярних пептидів з М 3000-5000 та у фракціях J № 1-8 (крива 2). Відомо, що діапазон вимірювання молекулярної маси продуктів гідролізу< 5000 Да входят только пептиды и аминокислоты. При больших концентрациях белка (фракция № 9) соответственно увеличивается окрашивание его свободных аминогрупп нингидрином -64 мкг/см3. Этот диапазон элюции характеризует наличие во фракциях № 8-12 среднемолекулярных пептидов с М 300-3000 Да. Определяемый с помощью маркерных белков по калибровочной кривой lg M керопептида 2,845 также указывает на его ориентировочную массу >700 Так. Подальший аналіз профілю елюції по нінгідринової пробі (фракції № 12-36) виявив пік, що не відповідає його концентрації по білку, як спостерігалося для пептидів у попередніх фракціях. Масова частка низькомолекулярних речовин у фракції № 23 склала 157 мкг/см3, що більш ніж у 2 рази перевищує аналогічний показник для пептидів у фракції № 9. на присутність у останній фракції продуктів гідролізу у вигляді вільних амінокислот. Приналежність до неї та амінокислоти тирозину (0,06 мкмоль/см3) є ще одним доказом висловленого положення.
Таким чином, гель-фільтрація кератинового гідролізату через сефадекси G-100 і G-25 свідчить про наявність в ньому низькомолекулярного розчину.
мого білка (< 10000 Да), составляющего 25% от его общего количества в гидролизате. Преобладающая часть белковых продуктов - 75% - представлена среднемолекулярными пептидами (300-3000 Да) с ориентировочной М >700 Так. У разі білкові ланцюжка містять 5-20 амінокислотних залишків. Важливо підкреслити, що фракція № 9 одночасно дає реакцію биуретовую зв'язок, нингидрин, тирозин і РВ. Подібна характеристика передбачає наявність у білку кератині вуглеводів та їх безпосереднього зв'язку з білком у складі єдиного комплексу.
ЛІТЕРАТУРА
1. Антипова Л.В., Пащенко Л.П., Шамханов Ч.Ю., Курілова Є.С. Отримання та характеристика харчового кератинового гідролізату // Зберігання та переробка сільгоспсировини. – 2003. – № 7.
2. Антипова Л.В., Шамханов Ч.Ю., Осмінін О.С., По-жалова Н.А. Біохімічні характеристики процесу ферментативного гідролізу кератинвмісної сировини птиціпереробної галузі// Изв. вишів. Харчова технологія. – 2003. – № 5-6.
3. Антіпова Л.В., Шамханов Ч.Ю., Осмінін О.С. З -
вдосконалення технології виробництва керопептиду з перо-пу-хового сировини // М'ясна промисловість. – 2004. – № 3. – С. 44-47.
4. Рогов І.А., Антипова Л.В., Дунченко Н.І., Жереб-ців Н.А. Хімія їжі. У 2 кн. Кн. 1. Білки: структура, функції, що у харчуванні. – М.: Колос, 2000. – 384 с.
5. Остерман Л.А. Хроматографія білків та нуклеїнових кислот. – М.: Наука, 1985. – 536 с.
6. Кочетов Г.А. Практичний посібник з ензимології. - 2-ге вид., перераб. та дод. - М.: Вищ. шк., 1980. – 272 с.
Кафедра технології продуктів харчування Кафедра технології м'яса та м'ясних продуктів
Надійшла 0S.02.0? м.
ТЕОРЕТИЧНЕ ОБГРУНТУВАННЯ МЕХАНІЗМУ КОНСЕРВУЮЧОЇ ДІЇ КОМПОНЕНТІВ КОПТИЛЬНИХ ЕКСТРАКТІВ
С.В. ЗОЛОТОКОПОВА, І.А. ПАЛАГІНА
Астраханський державний технічний університетАстраханська філія Саратовського державного соціально-економічного університету
Важливим напрямом досліджень останніх роківє вивчення впливу різних харчових добавок як на смак і аромат, а й збільшення термінів зберігання продуктів харчування. З давніх часів для консервування використовують пряні рослини, кухонну сіль, копчення та ін. Аналіз показує, що в даний час ринок завойовують коптильні екстракти. Продукти харчування з ароматом копчення користуються у населення особливою популярністю, а традиційне копчення поступається своїми позиціями бездимному.
Екологічно вигідними та перспективними є екстракти, одержувані за щадних умов.
Над удосконаленням технології екстракції не одне десятиліття працює Г.І. Касьянов – заслужений діяч науки і техніки РФ, заслужений винахідник РФ, доктор технічних наук, професор, завідувач кафедри технології м'ясних та рибних продуктів Кубанського державного технологічного університету. Діюча при КубДТУ та Краснодарському науково-дослідному інституті зберігання та переробки сільськогосподарської продукції під його керівництвом науково-педагогічна школа «Теорія та практика обробки сировини рослинного та тваринного походження зрідженими та стислими газами» займається проблемами підвищення ефективності переробки різної сировини, що дозволяють поліпшити скоротити тривалість процесів обробки та одночасно знизити енергетичні витрати.
Для ідентифікації білків використовуються різні системи пошуку базах даних EMBL, Sequest, розроблені всередині дослідницьких колективів. Проте стандартом для ідентифікації білків стала пошукова машина Mascot. Як практично у всіх пошукових системах у ній використовується веб-інтнерфейс і сама пошукова система доступна в Інтернеті, але її також можна придбати та встановити на комп'ютері користувача.
Mascot може працювати з різними білковими і геномними базами даних, що підключаються. Це можуть бути великі загальнодоступні бази, такі як NCBI або SwissProt, комерційні та створені самим користувачем.
У всіх системах ідентифікація здійснюється за отриманими дослідником мас-спектрометричними даними шляхом їх зіставлення з відомими структурами білків.
Враховуючи, що в останні десятиліття сіквенування білків звелося, по суті, з сиквенування генів, що кодують, на практиці розумніше ідентифікувати білки зіставляючи експериментальні мас-спектрометричні дані з відомими геномами.
Існують різні алгоритми ідентифікації білків, проте їх можливості обмежені відомими на сьогоднішній день геномами. Хоча, враховуючи що організми різних видіввсе-таки мають гомологічні білки, часто вдається ідентифікувати білки з організмів з невідомим геномом.
Різні методичні підходи протеомних досліджень дають принципово різні типиданих, і вимагають своїх обчислювальних підходів під час обробки.
Найбільш доступним і високопродуктивним є метод ідентифікації мас-спетрометричних пептидних карт специфічного протеолітичного гідролізу. В англомовній літературі він відомий як Peptide Mass Fingerprint (PMF) Як специфічна протеаза найчастіше використовується трипсин. На першому етапі виділений (наприклад, елетрофорез) білок піддається протеолітичному гідролізу. В результаті такого гідролізу виходить суміш пептидів. З огляду на те, що використовується високоспецифічна протеаза, це буде суміш цілком певних пептидів. Так, при використанні трипсину білок буде "порізаний" по аргініну та лізину.
Наступний етап – реєстрація мас-спектру отриманої суміші. У результаті виходить набір чи список молекулярних мас. Він не дає ніякої інформації про структуру або інші властивості продуктів, в основі методу тільки припущення, що це молекулярні маси пептидів, і ці пептиди утворилися в результаті специфічного гідролізу. Тут і захована головна ідея підходу - якщо кожен білок має свій набір пептидів і відповідний йому перелік молекулярних мас, то цілком можливе рішення зворотного завдання - знайти для отриманого переліку молекулярних мас відповідний йому білок. І таке завдання справді часто вдається вирішити.
Зокрема це дозволяє зробити маскот.
