двойки други. Тези промени наистина съпътстват всеки цикъл на репликация на ДНК, но тяхната честота е много по-ниска, отколкото би трябвало да бъде. Това се обяснява с факта, че повечето промени от този вид се елиминират поради действието на механизма за ремонт (молекулярно възстановяване) на оригиналната нуклеотидна последователност на ДНК.
Възстановителният механизъм се основава на наличието на две допълващи се вериги в молекулата на ДНК. Изкривяването на нуклеотидната последователност в един от тях се открива от специфични ензими. След това съответният участък се отстранява и се заменя с нов, синтезиран върху втората комплементарна ДНК верига. Този тип възстановяване се нарича ексцизионно възстановяване, т.е. с „разрязване“ (фиг. 3.15). Извършва се преди следващия цикъл на репликация, поради което се нарича още
предрепликативен.
Ориз. 3.14. Схема на процеса на корекция по време на синтеза на ДНК: I - включване в ДНК веригата на нуклеотид с променена (тавтомерна) форма на цитоеин, който "незаконно" се сдвоява с аденин; II - бърз преход
цитозин в нормалната си форма нарушава сдвояването му с аденин; несдвоеният 3"-OH край на синтезираната верига предотвратява по-нататъшното му удължаване под действието на ДНК полимераза; III - ДНК полимеразата премахва нелегалния нуклеотид, в резултат на което 3"-OH краят, сдвоен с матрицата, се появява отново; IV - ДНК полимеразата продължава удължаването на веригата в 3"-OH края
Възстановяването на оригиналната структура на ДНК изисква участието на редица ензими. Важен момент при задействането на възстановителния механизъм е откриването на грешка в структурата на ДНК. Често такива грешки възникват в новосинтезираната верига по време на процеса на репликация. Възстановяващите ензими трябва да открият тази конкретна верига. При много видове живи организми новосинтезираната ДНК верига се различава от майчината по степента на метилиране на нейните азотни бази, което изостава от синтеза. В този случай неметилираната верига претърпява възстановяване. Разкъсванията на ДНК вериги също могат да бъдат разпознати от възстановителните ензими. При висшите организми, където синтезът на ДНК не протича непрекъснато, а в отделни репликони, новосинтезираната ДНК верига има разкъсвания, което позволява разпознаването ѝ.
Възстановяването на структурата на ДНК при загуба на пуриновите бази на една от нейните вериги включва откриване на дефекта с помощта на ензима ендонуклеаза, който разкъсва фосфоестерната връзка на мястото на увреждане на веригата. След това промененият участък с няколко съседни нуклеотида се отстранява от ензима екзонуклеаза и на негово място, в съответствие с реда на базите на комплементарната верига, се образува правилната нуклеотидна последователност (фиг. 3.15).
Ориз. 3.15. Схема на изрязване, предрепликативно възстановяване на ДНК Когато една от базите в ДНК веригата се промени при възстановяването на оригинала
структури, участват около 20 ензима ДНК гликозилаза.Те специално разпознават уврежданията, причинени от дезаминиране, алкилиране и други структурни трансформации на базите. Такива модифицирани основи се премахват. Появяват се области без основи и се възстановяват, както при загубата на пурини. Ако нормалната структура не се възстанови, например при дезаминиране на азотни бази, някои двойки комплементарни бази се заменят с други - двойката C-G може да бъде заменена с двойка T-A и т.н. (вижте раздел 3.4.2.3).
Образуването на тиминови димери (Т-Т) в полинуклеотидните вериги под въздействието на ултравиолетовите лъчи изисква участието на ензими, които разпознават не отделни променени бази, а по-мащабни увреждания на структурата на ДНК. Процесът на възстановяване в този случай също е свързан с отстраняването на региона, носещ димера, и възстановяването на нормалната нуклеотидна последователност чрез синтез върху комплементарната ДНК верига.
В случай, че системата за възстановяване на ексцизията не коригира промяна, която е настъпила в една верига на ДНК, фиксирането настъпва по време на репликацията
тази промяна и тя става собственост на двете ДНК вериги. Това води до замяна на една двойка комплементарни нуклеотиди с друга или до поява на прекъсвания (празнини) в новосинтезираната верига спрямо променените участъци. Възстановяване на нормалната структура на ДНК може да настъпи и след репликация.
Пострепликативен ремонтосъществява се чрез рекомбинация (обмяна на фрагменти) между две новообразувани двойни спирали на ДНК. Пример за такова пост-репликативно възстановяване е възстановяването на нормалната структура на ДНК, когато се появят тиминови димери (T-T), когато те не се елиминират спонтанно под въздействието на видима светлина ( лека репарация) или по време на предрепликативна ексцизия.
Ковалентните връзки, които възникват между съседни тиминови остатъци, ги правят неспособни да се свързват с комплементарни нуклеотиди. В резултат на това се появяват прекъсвания (празнини) в новосинтезираната ДНК верига, разпознати от възстановителните ензими. Възстановяването на целостта на новата полинуклеотидна верига на една от дъщерните ДНК се извършва поради рекомбинация със съответната нормална родителска верига на друга дъщерна ДНК. Празнината, образувана в майчината верига, след това се запълва чрез синтез върху полинуклеотидна верига, комплементарна на нея (фиг. 3.16). Проява на такова пост-репликативно възстановяване, извършено чрез рекомбинация между веригите на две дъщерни ДНК молекули, може да се счита за често наблюдаваната обмяна на материал между сестрински хроматиди (фиг. 3.17).
Ориз. 3.16. Схема на пострепликативно възстановяване на ДНК: I - появата на тиминов димер в една от ДНК веригите;
II - образуване на "празнина" в новосинтезираната верига срещу променения участък на майчината молекула след репликация (стрелката показва последващото запълване на "празнината" с участък от съответната верига на втората дъщерна ДНК молекула);
III - възстановяване на целостта на дъщерната верига на горната молекула поради рекомбинация и в долната молекула поради синтез на допълнителната верига
Ориз. 3.17. Интерхроматидни обмени (указани със стрелки)
По време на предрепликативния и пострепликативния ремонт по-голямата част от увреждането на ДНК структурата се възстановява. Въпреки това, ако в наследствения материал на клетката настъпи твърде много увреждане и част от него не се елиминира, се активира системата от индуцируеми (стимулирани) възстановителни ензими (SOS система). Тези ензими запълват празнините, възстановявайки целостта на синтезираните полинуклеотидни вериги, без стриктно спазване на принципа на комплементарност. Ето защо понякога самите възстановителни процеси могат да служат като източник на трайни промени в структурата на ДНК (мутации). Тази реакция важи и за SOS системата.
Ако в една клетка, въпреки извършения ремонт, степента на увреждане на структурата на ДНК остава висока, процесите на репликация на ДНК в нея се блокират. Такава клетка не се дели, което означава, че не предава произтичащите от това промени на своето потомство.
Спирането на клетъчния цикъл, причинено от увреждане на ДНК, съчетано с невъзможността за молекулярно възстановяване на променен наследствен материал, може с участието на протеин, чийто синтез се контролира от гена p53, да доведе до активиране на процеса на самоунищожение (апоптоза ) на дефектната клетка, за да я елиминира от тялото.
По този начин обширен набор от различни ремонтни ензими непрекъснато „инспектират“ ДНК, премахвайки увредените участъци от нея и спомагайки за поддържането на стабилността на наследствения материал. Комбинираното действие на репликационни ензими (ДНК полимераза и редактираща ендонуклеаза) и ремонтни ензими осигурява сравнително ниска честота на грешки в ДНК молекулите, която се поддържа на ниво от 1 × 10-9 двойки променени нуклеотиди на геном. Като се има предвид размерът на човешкия геном от 3 × 109 нуклеотидни двойки, това означава около 3 грешки на репликиращ се геном. В същото време дори това ниво е достатъчно за формирането на значително генетично разнообразие под формата на генни мутации по време на съществуването на живот на Земята.
3.4.2.3. Промени в нуклеотидните последователности на ДНК. Генни мутации
Некоригирани промени химическа структурагените, които се възпроизвеждат в последователни цикли на репликация и се появяват в потомството под формата на нови варианти на знаци, се наричат генни мутации.
Промените в структурата на ДНК, която образува гена, могат да бъдат разделени на три групи. Мутациите от първата група се състоят в замяната на някои бази с други. Те представляват около 20% от спонтанно възникващите генни промени. Втората група мутации се причинява от промяна в рамката на четене, която възниква, когато броят на нуклеотидните двойки в гена се промени. И накрая, третата група е представена от мутации, свързани с промяна в реда на нуклеотидните последователности в гена (инверсия).
Мутации по вид заместване на азотни основи. Тези мутации възникват поради редица специфични причини. Една от тях може да бъде промяна в структурата на основа, която вече е включена в спиралата на ДНК, която възниква случайно или под въздействието на специфични химични агенти. Ако такава променена форма на основата остане неоткрита от ремонтните ензими, тогава по време на следващия цикъл на репликация тя може да прикрепи друг нуклеотид към себе си. Пример е дезаминирането на цитозин, който се превръща в урацил спонтанно или под влияние азотиста киселина(фиг. 3.18). Полученият урацил, незабелязан от ензимаДНК гликозилаза,по време на репликацията се свързва с аденин, който впоследствие прикрепя тимидил нуклеотид. В резултат на това двойка C-G се заменя в ДНК с двойка T-A (фиг. 3.19, I ). Дезаминирането на метилирания цитозин го превръща в тимин (виж Фигура 3.18). Тимидил нуклеотидът, който е естествен компонент на ДНК, не се открива от възстановителните ензими като промяна и по време на следващата репликация прикрепя аденилов нуклеотид. В резултат на това вместо чифт C-G двойка се появява и в молекулата на ДНК T-A (фиг. 3.19, II).
Ориз. 3.18. Спонтанно дезаминиране на цитозин
Друга причина за заместване на основата може да бъде погрешното включване в синтезираната ДНК верига на нуклеотид, носещ химически променена форма на основата или неин аналог. Ако тази грешка остане неоткрита от ензимите за репликация и възстановяване, променената база се включва в процеса на репликация, което често води до замяна на една двойка с друга. Пример за това е добавянето на нуклеотид с 5-бромоурацил (5-BU), подобен на тимидил нуклеотид, към аденина на майчината верига по време на репликация. По време на последваща репликация, 5-BU по-лесно свързва гуанин, отколкото аденин. Гуанинът, по време на по-нататъшното дублиране, образува комплементарна двойка с цитозин. В крайна сметка двойка A-Tзаменени в ДНК молекула G-C двойка(фиг. 3.20).
Ориз. 3. 19. Мутации по тип заместване на основата (дезаминиране на азотни бази в ДНК веригата):
I - превръщане на цитозин в урацил, заместване на двойката C-G с двойка T-A;
II - превръщане на метил цитозин в тимин, заместване на двойката C-G с двойка T-A
От горните примери става ясно, че промените в структурата на ДНК молекулата, като заместване на основата, възникват преди или по време на процеса на репликация, първоначално в една полинуклеотидна верига. Ако такива промени не бъдат коригирани по време на ремонта, тогава по време на последваща репликация те стават собственост на двете ДНК вериги.
Ориз. 3.20. Базови заместващи мутации
(включване на аналог на азотна основа по време на репликация на ДНК)
Последицата от замяната на една двойка комплементарни нуклеотиди с друга е образуването на нов триплет в нуклеотидната последователност на ДНК, кодираща последователността от аминокиселини в пептидната верига. Това може да не повлияе на структурата на пептида, ако новият триплет е „синоним“ на предишния, т.е. ще кодира същата аминокиселина. Например, аминокиселината валин е криптирана от четири триплета: CAA, CAG, CAT, CAC. Замяната на третата база в която и да е от тези триплети няма да промени значението й (дегенерация на генетичния код).
IN В случай, че новопоявилият се триплет криптира друга аминокиселина, структурата на пептидната верига и свойствата на съответния протеин се променят. В зависимост от естеството и местоположението на замяната, специфичните свойства на протеина се променят в различна степен. Има случаи, при които замяната само на една аминокиселина в пептид значително повлиява свойствата на протеина, което се проявява в промени в по-сложни характеристики. Пример за това е промяната в свойствата на човешкия хемоглобин, когатосърповидно-клетъчна анемия (фиг. 3.21). В такъв хемоглобин (HbS) (за разлика от нормалния HbA) - в р-глобиновите вериги на шеста позиция глутаминовата киселина се заменя с валин. Това е следствие от заместването на една от базите в триплета, който кодира глутаминовата киселина (CTT или TTC). Резултатът е триплет, който криптира валин (CAT или TsAT). В този случай замяната на една аминокиселина в пептида значително променя свойствата на глобина, който е част от хемоглобина (способността му да се свързва с O2 намалява) и човек развива признаци на сърповидно-клетъчна анемия.
IN В някои случаи замяната на една основа с друга може да доведе до появата на една отбезсмислени триплети (ATT, ATC, ACT), които не криптират никаква аминокиселина. Последицата от такава замяна ще бъде прекъсването на синтеза на пептидната верига. Изчислено е, че нуклеотидните замествания в един триплет водят до образуването на синонимни триплети в 25% от случаите; в 2-3 - безсмислени триплети, в 70-75% - появата на истински генни мутации.
По този начин мутациите на базово заместване могат да възникнат или в резултат на спонтанни промени в основната структура в една от веригите на съществуваща двойна спирала на ДНК, или по време на репликация в новосинтезирана верига. Ако тези промени не бъдат коригирани по време на процеса на ремонт (или, обратното, възникнат по време на ремонта), те се фиксират в двете вериги и след това ще бъдат възпроизведени в следващите цикли на репликация. Следователно, важен източник на такива мутации е нарушаването на процесите на репликация и възстановяване.
Мутации с изместване на рамката. Този тип мутация представлява значителна част от спонтанните мутации. Те възникват в резултат на загуба или вмъкване на една или повече двойки комплементарни нуклеотиди в нуклеотидната последователност на ДНК. Повечето от изследваните мутации, които причиняват
РЕМОНТ на ДНК
Репарационни системи
2 Ремонт на ексцизия. Примери и видове
3 Поправка на грешки при репликация на ДНК
4 Рекомбинантно (пострепликативно) възстановяване при бактерии
5 SOS ремонт
Системите за възстановяване на ДНК са доста консервативни в еволюцията от бактериите до хората и са най-изучени при E. coli.
Известни са два вида репарация:директен и ексцизионен
Директно обезщетение
Директното възстановяване е най-простият начин за елиминиране на увреждане в ДНК, което обикновено включва специфични ензими, които могат бързо (обикновено на един етап) да елиминират съответното увреждане, възстановявайки оригиналната структура на нуклеотидите.
1. Това работи, напр.О6-метилгуанин ДНК метилтрансфераза
(самоубийствен ензим), който премахва метилова група от азотна основа върху един от нейните собствени цистеинови остатъци
В E. coli за 1 минута могат да се синтезират до 100 молекули от този протеин. Протеин, подобен по функция на висшите еукариоти, очевидно играе важна роля в защитата срещу рак, причинен от вътрешни и външни алкилиращи фактори.
ДНК инсертаза
2. ДНК инсертази
фотолиаза
3. Тиминовите димери са „разединени“ от пряка репарацияВ ролитефотолиаза, извършвайки съответната фотохимична трансформация. ДНК фотолиазите са група светлинно активирани ензими с дължина на вълната 300 - 600 nm (видима област), за които имат специален светлочувствителен център в структурата си.
Те са широко разпространени в природата и се намират в бактерии, дрожди, насекоми, влечуги, земноводни и хора. Тези ензими изискват различни кофактори (FADH, тетрахидрофолиева киселина и др.), участващи във фотохимичното активиране на ензима. Фотолиазата на Е. coli е протеин с молекулно тегло 35 kDa, тясно свързан с олигорибонуклеотид с дължина 10-15 нуклеотиданеобходими за ензимната активност.
Примери за директно обезщетение
1. Метилирана основа O 6-mG диметилиран от ензима метилтрансферазаО6-метилгуанин ДНК метилтрансфераза (суициден ензим), който прехвърля метилова група към един от остатъците си
цистеин
2. AP местата могат да бъдат поправени чрез директно вкарване на пурини с участието на ензими, т.нарДНК инсертази(от английското вмъкване - вмъкване).
ДИАГРАМА НА ПРИМЕР ЗА ДИРЕКТНО ВЪЗСТАНОВЯВАНЕ НА ПОВРЕДИ В ДНК – метилирана база О6- mGдеметилиран от ензима метилтрансфераза, който прехвърля метилова група към един от неговите цистеинови аминокиселинни остатъци.
3. Фотолиазата се прикрепя към тиминовия димер и след облъчване на този комплекс с видима светлина (300-600 nm), димерът се разплита
ДИАГРАМА НА ПРИМЕР ЗА ДИРЕКТНО ВЪЗСТАНОВЯВАНЕ НА ПОВРЕДИ В ДНК – фотолиаза
се прикрепя към тиминовия димер и след облъчване с видимия спектър на светлината, този димер се разплита
Ремонт на ексцизия
(от английски excision - изрязване).
ОПРЕДЕЛЕНИЕ
Ексцизионният ремонт включва изтриванеувредени азотни бази от ДНК и последващо възстановяваненормална молекулярна структура.
МЕХАНИЗЪМ
Ексцизионното възстановяване обикновено включва няколко ензима, а самият процес включва
не само повредени ,
но и съседните на него нуклеотиди .
УСЛОВИЯ
Възстановяването чрез ексцизия изисква втора (комплементарна) верига на ДНК. Обща опростена диаграма на възстановяване чрез ексцизия е показана на фиг. 171.
СТЪПКИ
Първата стъпка в ремонта чрез ексцизия е отстраняването на необичайни азотни основи. Катализира се от групатаДНК-н-гликозилаза- ензими, които разцепват гликозидната връзка между дезоксирибозата и азотната основа.
ВАЖНА ЗАБЕЛЕЖКА:
UчовекДНК-н-гликозилазиимат висока субстратна специфичност: различни ензими от това семейство разпознават и отрязват различни аномални основания(8-оксогуанин, урацил, метилпурини и др.).
UбактерииДНК-н-гликозилазиняма такава субстратна специфичност
ОБЩИ ЕНЗИМИ ЗА ВЪЗСТАНОВЯВАНЕ НА ЕКЗИЦИЯТА
| ИМЕ | ФУНКЦИЯ | МЕХАНИЗЪМ |
| ДНК-н-гликозилази | изрязване на анормални азотни бази | разцепва гликозидната връзка между дезоксирибозата и азотна основа |
| АР ендонуклеаза | създава условия за работа на следващия ензим - екзонуклеази | разрушава захарно-фосфатния скелет на ДНК молекулата на мястото на АР |
| екзонуклеаза | освобождава няколко нуклеотида | последователно отцепва няколко нуклеотида от повреден участък на една ДНК верига |
СПЕЦИФИЧНИ ПОСЛЕДВАЩИ СТЪПКИ НА ТОЗИ МЕХАНИЗЪМ:
В резултат на действието ДНК- н-гликозилазаобразува се АР място, което се атакува от ензима АР ендонуклеаза. Той разрушава захарно-фосфатния гръбнак на молекулата на ДНК в AP мястото и по този начин създава условия за работата на следващия ензим - екзонуклеази, който последователно отцепва няколко нуклеотида от увредения участък на една ДНК верига.
В бактериалните клетки освободеното място се запълва със съответните нуклеотиди с участието ДНК полимераза I, ориентиран към втората (комплементарна) верига на ДНК.
Тъй като ДНК полимераза I е способна да удължи 3" края на една от веригите на мястото на прекъсване на двойноверижна ДНК и да отстранява нуклеотиди от 5" края на същото прекъсване,
тези. осъзнавам „ник излъчване“ , този ензим играе ключова роля в възстановяването на ДНК. Извършва се окончателно зашиване на ремонтираните участъци ДНК лигаза.
В еукариотни (бозайникови) клетки
Ексцизионното възстановяване на ДНК в клетките на бозайниците е придружено от рязък скок в активността на друг ензим -поли АдR-рибоза полимераза . Това се случва ADP-рибозилиране на хроматинови протеини(хистони и нехистонови протеини), което води до отслабване на връзката им с ДНК и отваря достъп до възстановителни ензими.
Донор ADP-рибозадейства в тези реакцииNAD+, чиито резерви са силно изчерпани по време на ексцизионно възстановяване на щети, причинени от рентгеново облъчване:
Отрицателно заредени остатъци ADP-рибозаот вътрешния състав на молекулата NAD+добавяне чрез радикалглутаминкиселина или фосфосеринкъм хроматиновите протеини, което води до неутрализиране на положителните заряди на тези протеини и отслабване на контакта им с ДНК.
КАКВО Е ГРУПА ЕНЗИМИ
ДНК гликозилази
разцепва гликозидната връзка между дезоксирибозата и азотната основа
което води до изрязване на анормални азотни бази
ДНК гликозилази участващи в елиминирането на окислителното увреждане на ДНК в клетките прокариоти и еукариоти, са много разнообразни и се различават по субстратна специфичност, пространствена структура и методи на взаимодействие с ДНК.
Най-изследваните ДНК гликозилази включват:
ендонуклеаза III(ЕндоIII),
образува амидопиримидин ДНК гликозилаза (Fpg),
Мут ТИ
Мут Йколи.
Ендонуклеаза IIIE. coli "разпознава" и специфично разцепва ДНК окислени пиримидинови бази.
Този ензим е мономерен глобуларен протеин, състоящ се от 211 аминокиселиниостатъци (моларна маса 23,4 kDa). Генът, кодиращ Endo III, е секвениран и е определена неговата нуклеотидна последователност. Ендо III е желязо-сярен протеин [(4 Fe-4S )2+ протеин] с елемента по-горе вторична структура Тип "гръцки ключ" (спирала - фиби - спирала), служещи за свързване с ДНК. Ензими с подобна субстратна специфичност и подобни аминокиселинни последователности също са изолирани от говежди и човешки клетки.
Образувайте амидо пиридин ДНК гликозилаза E. coli "разпознава" и разцепва окислените хетероциклични съединения от ДНК пуринови бази .
СХЕМА НА ЕКЗИЗИОНЕН ВЪЗСТАНОВЕН ЕТАП 1
ДНКн
СХЕМА ЗА РЕМОНТИРАНЕ НА ЕКЗЦИЗИЯ
1 ДНКнгликозидазата премахва повредената основа
АР ендонуклеазата разрушава ДНК
2 Екзонуклеазата премахва определен брой нуклеотиди
3 ДНК полимераза запълва освободената област с комплементар
Мононуклеотиди
ДНК лигаза зашива поправената ДНК верига заедно
Мут Т- малък протеин с молекулно тегло 15 kDa с нуклеозид трифосфатазна активност, която е предимно хидролизира dGTP до dGMP и пирофосфат.
Биологична роляМут Т е да предотврати образуването на неканонични двойки по време на репликацияA:GИ A: 8-оксо-G.
Такива двойки могат да се появят, когато окислена форма
dGTP (8-оксо-dGTP)става субстратДНК полимерази.
Мут Тхидролизира 8-оксо-dGTP10 пъти по-бързо от dGTP.
Това го прави 8-оксо-dGTPнай-предпочитаният субстратМътTи обяснява неговата функционална роля.
Мут Йе специфична аденин ДНК гликозилаза, която разцепва N-гликозидната връзка между аденин и дезоксирибоза аденозин,образувайки неканонична двойка с гуанин.
Функционалната роля на този ензим е да предотвратява мутация
T:A - G:A от разцепване на непокътнатия остатък аденинот базова двойка А: 8-оксо-G.
Възстановяване на нуклеотидна ексцизия
(АТФ-зависим механизъм за отстраняване на увреждане на ДНК)
Напоследък при възстановяването чрез ексцизия специално внимание се обръща на АТФ-зависимия механизъм за отстраняване на увреждане от ДНК. Този тип ексцизионно възстановяване се нарича нуклеотидно ексцизионно възстановяване (NER).
Включва ДВА ЕТАПА :
1. отстраняване от ДНКолигонуклеотидни фрагменти съдържащи щети и
Ексинуклеаза
2. последваща реконструкция на ДНК веригата с участието на комплекс от ензими (нуклеази, ДНК полимерази, ДНК лигази и др.).
Настъпва отстраняване на ДНК фрагмент от двете страни на повредениянуклеотид. Дължината на отстранените олигонуклеотидни фрагменти е различна при прокариотите и еукариотите.
Отстраняване на ДНК фрагмент от прокариоти
По този начин, в E. coli, B. subtilus, Micrococcus luteus, фрагмент дължина 12-13 нуклеотиди,
Отстраняване на ДНК фрагмент в еукариоти
а при дрождите, земноводните и хората – фрагмент, състоящ се от 24-32 нуклеотиди.
Ексинуклеаза– ензим, който премахва ДНК фрагменти
Разцепването на ДНК фрагмент се извършва от ензимексинуклеаза(ексцинуклеаза). В E. coli този ензим се състои от 3 различни протомера -
uvrA
увр Б
uvr C
всеки от които изпълнява специфична функция по време на ексцизионно разцепване на ДНК фрагмент. Имената на тези протеини са дадени от първите букви на думите"ултра виолетов ремонт".
Протомер uvr Aима АТФ-азна активност, свързва се с ДНК под формата на димер, извършвайки
първоначално разпознаване на щети и
връзванеувр Б
Протомер uvr Bима:
1 . Латентен АТФазна и латентна хеликаза активност, необходими за промяна на конформациите и разплитане на двойната спирала на ДНК;
2. Ендонуклеаза активност, разцепвайки междунуклеотидната (фосфодиестерна) връзка отZ"-крайнащърбен фрагмент.
Протомер uvr Cдейства като ендонуклеаза, въвеждайки прекъсване в ДНК веригата, с която се ремонтира5" завършваизрязан фрагмент.
По този начин, протомериuvr A, uvr B, uvr Cвзаимодействат с ДНК в специфична последователност, осъществявайки АТФ-зависима реакцияразцепване на олигонуклеотиден фрагмент от ДНК веригата, която се ремонтира.
Получената празнина в молекулата на ДНК се възстановява с участието на ДНК полимераза I и ДНК лигаза. Модел на ексцизионно възстановяване, включващ горните ензими, е показан на фиг. 172.
Възстановяване чрез ексцизия при хора
Ексцизионните ремонти при хора също са зависими от АТФ и включваттри основни етапа :
разпознаване на щети,
рязане на двойна ДНК верига
редуктивен синтез и
лигиране на ремонтираната нишка.
Въпреки това възстановяването на човешката ДНК включва
25 различни полипептида ,
16 от които участват в разцепването на олигонуклеотидния фрагмент, като са протомериексинуклеази,
и останалото 9 осъществяват синтеза на поправената част от молекулата.
В системата за възстановяване на ДНК при хората е много значителна роляизвършват транскрипционни протеини -
РНК полимераза II И
TF Пон- един от шестте основни транскрипционни фактора еукариоти.
Трябва да се отбележи, че ексцизионното възстановяване при прокариоти, както и при еукариоти, зависи от функционалното състояние на ДНК:
Транскрибираната ДНК се поправя по-бързо
отколкото транскрипционно неактивен.
Това явление се обяснява със следните фактори:
структура на хроматина,
хомология на веригите на транскрибираните ДНК участъци,
ефектът от увреждане на веригата и влиянието му върху РНК полимеразата.
ВАЖНА ЗАБЕЛЕЖКА:
ДНК КОДИРАЩА ВЕРИГА (верига за съхранение на информация)
ДНК МАТРИЧНА ВЕРИГА (информацията се копира от нея)
Известно е, че такива големи щети като образуване на тиминови димери, блокират транскрипцията както при бактерии, така и при хора, ако се появят на матрична веригаДНК (увреждане на кодираневериги не влияяткъм транскрипционния комплекс). РНК полимеразата спира на мястото на увреждане на ДНК и блокира функционирането на транскрипционния комплекс.
Фактор на свързване на транскрипция и възстановяване (TRCF) .
В E. coli повишеното възстановяване на транскрипцията се медиира от един специален протеин -транскрипционно-възстановителен свързващ фактор (TRCF) .
Този протеин насърчава :
1. отделяне на РНК полимераза от ДНК
2. същевременно стимулира образованието протеинов комплекс,
Извършване на ремонт на увредената зона.
След като възстановяването приключи, РНК полимеразата се връща в първоначалната си позиция и транскрипцията продължава (виж фигурата).
Така обща схемаремонт на ексцизия
1. ДНК-N -гликозилазата премахва увредената основа
2. АР ендонуклеазата разкъсва ДНК веригата
3. Екзонуклеазата премахва определен брой нуклеотиди
4. ДНК полимеразата запълва освободената зона
Допълнителни нуклеотиди
5. ДНК лигаза зашива поправената ДНК верига заедно
Ремонт на грешка при репликация на ДНК
чрез метилиране
Грешките в сдвояването на азотни бази по време на репликацията на ДНК възникват доста често (в бактериите, веднъж на 10 хиляди нуклеотида), в резултат на коетокъм дъщерната верига на ДНК включени са нуклеотиди, които не са комплементарни на нуклеотидите на майчината верига -несъответствия(англ. mismatch n д кореспондират).
Макар чеДНК полимераза Iпрокариотите имат способността да се самокоригират, усилията си да елиминират погрешно прикрепени нуклеотиди понякога те не са достатъчни, а след това някои неправилни (некомплементарни) двойки остават в ДНК.
В този случай ремонтът се извършва с помощта на специфична система, свързана сДНК метилиране . Действието на тази система за възстановяване се основава на факта, че след репликация, след определено време (няколко минути), ДНК претърпява метилиране.
В E. coli метилиранпредимно аденин с образование
N6-метил-аденин (N6-mA).
До този момент, ново синтезиран(дъщерно дружество)веригата остава неметилирана.
Ако такава верига съдържа несдвоени нуклеотиди, тогава тя претърпява ремонт: Такаметилирането маркира ДНК и
включва система за коригиране на грешки репликация.
В тази система за ремонт се разпознават специални структури:
подпоследователностG-N6-mA-T-CИ следващиязад него има деформация
в двойната спирала, където няма комплементарност (фиг. по-долу).
При елиминирането на несдвоени нуклеотиди в полу-метилиранДНК молекулата включва доста сложен комплекс от ремонтни ензими, които сканират повърхността на ДНК молекулата,отрязва част от дъщерна верига прибягвайки до несъответствие, а след това създава условия за развитие
неговите необходими (комплементарни) нуклеотиди.
Различните компоненти на този комплекс имат различни дейностинуклеаза,
хеликаза,
АТФаза,
необходими за въвеждане на прекъсвания в ДНК и разцепване на нуклеотиди, развиване на двойната спирала на ДНК и осигуряване на енергия за движението на комплекса по ремонтираната част на молекулата.
Комплекс от възстановителни ензими, сходни по структура и функция, е идентифициран при хората.
Рекомбинантно (пострепликативно) възстановяване
В случаите, когато по една или друга причина горепосочените възстановителни системи са нарушени, могат да се образуват пропуски (недостатъчно възстановени участъци) във веригите на ДНК, които са понякога доста значителни размери, което е изпълнено с нарушаване на системата за репликация и може да доведе до клетъчна смърт.
В този случай клетката може да използва друга ДНК молекула, получена след репликация, за да поправи една ДНК молекула, т.е. да привлече механизъм за тази целрекомбинация.
В бактериите
При бактериите той участва в рекомбинантното възстановяване.протеин Rec A. Той се свързва с едноверижен регион на ДНК и го включва в рекомбинация схомоложни региони на непокътнати вериги на друга ДНК молекула .
В резултат на това както счупените (съдържащи пропуски), така и непокътнатите вериги на ДНК молекулата, която се ремонтира, се сдвоенис непокътнати комплементарни ДНК региони, което отваря възможността за възстановяване чрез гореописаните системи.
В този случай може да има рязанеопределен фрагмент и
пълнежс негова помощ пропуски в дефектната верига.
Празнините и прекъсванията, които възникват във веригите на ДНК, се запълват с участиетоДНК полимераза I и ДНК лигаза .
SOS възстановяване
Съществуването на тази система е постулирано за първи път от М. Радман през 1974 г. Той също така дава името на този механизъм, като включва в него международния сигнал за бедствие „SOS” (спаси душите ни).
Всъщност тази система се включва, когато Увреждането на ДНК става толкова голямо, че застрашава живота на клетката. В този случай възниква индукция на активността на разнообразна група гени, участващи в различни клетъчни процеси, свързани с възстановяването на ДНК.
Включването на определени гени, определени от степента на увреждане в ДНК, води до различни по значимост клетъчни отговори (започвайки от стандартните възстановяване на повреденинуклеотиди и край потисканеклетъчно делене).
Най-проучениSOS възстановяванев E. coli, основните участници в които са протеини, кодирани гени Rec AИЛекс А.
Първият от тях е многофункционаленRec A протеин, участващи
V ДНК рекомбинация, и
V регулиране на генната транскрипция фаг ламбда, засягащи E. coli,
и второ (Lex A протеин)е репресортранскрипция на голяма група гени, предназначени за възстановяване на ДНКбактерии. Когато е инхибиран или разрешен ремонтът е активиран.
Подвързване Rec A с Lex Aводи до разделянето на последнияи съответно на активиране на ремонтни гени.
От своя страна, индуцирането на бактериалната SOS система служи зафаг ламбда сигнал за опасности кара профага да превключи от пасивен към активен (литичен) пътсъществуване, като по този начин причинява смърт на клетка гостоприемник.
Системата за възстановяване на SOS е идентифицирана не само при бактерии, но и при животни и хора.
Гени, участващи в възстановяването на увреждане на SOS ДНК
| Гени | Последици от активиране на ген |
| uvr A, B, C, D | Възстановяване на увреждане на вторичната структура на ДНК |
| Rec A | Пострепликативна репарация, индукция на SOS системата |
| лекс А | Изключване на SOS системата |
| rec N,ruv | Ремонт на двужилни прекъсвания |
| Осигуряване на рекомбинантен ремонт |
|
| umu C, D | Мутагенеза, причинена от промени в свойствата на ДНК полимеразата |
| сул А | Потискане на клетъчното делене |
Заключение
Поправянето на увреждане на ДНК е тясно свързано с други фундаментални молекулярно-генетични процеси: репликация, транскрипция и рекомбинация.Всички тези процеси се оказват преплетени V обща системавзаимодействия, обслужвани от голям брой различни протеини, много от които са многофункционални молекули, участващи в контрол на изпълнението генетична информация в про- и еукариотни клетки. В същото време е очевидно, че природата "не пести"върху контролните елементи, създавайки изключително сложни системи за коригиране на тези увреждания в ДНК, които са опасниза тялото и особено за неговото потомство. От друга страна, в случаите, когато възможностите за възстановяване не са достатъчни за запазване на генетичния статус на организма, възниква необходимостта от програмирана клетъчна смърт -апоптоза..
СХЕМА ЗА ВЪЗСТАНОВЯВАНЕ НА НУКЛЕОТИДНА ЕКЗИЦИЯ д. COLIС УЧАСТИЕТО НА EXINUCLEASE
1. НЕЗАВИСИМ МЕХАНИЗЪМ ОТ ТРАНСКРИПЦИЯТА
2. МЕХАНИЗЪМ, ЗАВИСИМ ОТ ТРАНСКРИПЦИЯТА
3. ОБЩ ЕТАП НА РЕМОНТ
СИМВОЛИ
А - протеинuvr А
B - протеинuvr IN
С - протеинuvr СЪС
малък черен триъгълник - знакът показва местоположението на повредата
СХЕМА ЗА ВЪЗСТАНОВЯВАНЕ, СВЪРЗАНА С ДНК МЕТИЛИРАНЕ
Репарации
наричаме способността на ДНК молекулата да "коригира" промените, настъпващи в нейните вериги. Най-малко 20 протеина участват във възстановяването на оригиналната структура: разпознаване на променени участъци от ДНК и отстраняването им от веригата, възстановяване на правилната последователност от нуклеотиди и зашиване на възстановения фрагмент с останалата част от ДНК молекулата.
Изброените особености на химичната структура и свойства на ДНК определят функциите, които тя изпълнява. ДНК записва, съхранява, възпроизвежда генетична информация и участва в процесите на нейното внедряване между новите поколения клетки и организми.
Рибонуклеинови киселини - РНК -
са представени от молекули с различни размери, структура и функции. Всички молекули на РНК са копия на определени участъци от молекулата на ДНК и в допълнение към вече споменатите разлики са по-къси от нея и се състоят от една верига. Между отделни участъци от една верига на РНК, които са комплементарни един на друг, е възможно сдвояване на основите (A с Y, G с C) и образуването на спирални участъци. В резултат на това молекулите придобиват специфична конформация.
Матрична или информационна РНК (mRNA, mRNA) се синтезира в ядрото под контрола на ензима РНК полимераза, комплементарна на информационните последователности на ДНК, прехвърля тази информация към рибозомите, където се превръща в матрица за синтеза на протеинова молекула. В зависимост от количеството копирана информация, молекулата на иРНК може да има различна дължина и съставлява около 5% от цялата клетъчна РНК.
Рибопротеиновата РНК (рРНК) се синтезира главно в нуклеола, в областта на гените на рРНК и е представена от различни молекулно тегломолекули, които изграждат големите и малките субединици на рибозомите. rRNA представлява 85% от общата РНК в клетката.
Трансферната РНК (тРНК) съставлява около 10% от клетъчната РНК. Има повече от 40 вида tRNA. Когато внедрява генетична информация, всяка тРНК прикрепя специфична аминокиселина и я транспортира до мястото на сглобяване на полипентида. При еукариотите тРНК се състоят от 70-90 нуклеотида.
Клетъчна структура
Видове клетъчна организация.
Сред цялото разнообразие от организми, съществуващи в момента на Земята, се разграничават две групи: вируси и фаги, които нямат клетъчна структура; всички други организми са представени от различни клетъчни форми на живот. Има два вида клетъчна организация: прокариотни
И еукариотни (
виж фиг.1 ).
Прокариотните клетки имат сравнително проста структура. Те нямат морфологично отделно ядро; единствената хромозома се образува от кръгова ДНК и се намира в цитоплазмата; липсват мембранни органели (тяхната функция се изпълнява от различни инвагинации на плазмената мембрана); цитоплазмата съдържа множество малки рибозоми; Няма микротубули, така че цитоплазмата е неподвижна, а ресничките и флагелите имат специална структура. Бактериите се класифицират като прокариоти.
Повечето съвременни живи организми принадлежат към едно от трите царства – растения, гъби или животни, обединени в надцарството на еукариотите.
В зависимост от това от кое количество се състоят организмите, последните се делят на едноклетъчни и многоклетъчни. Едноклетъчните организми се състоят от една клетка, която изпълнява всички функции. Много от тези клетки са много по-сложни от клетките на многоклетъчния организъм. Всички прокариоти са едноклетъчни, както и протозоите, някои зелени водорасли и гъби.
Съдържание на темата "Генетични елементи на бактерии. Мутации в бактерии. Трансдукция.":1. Мигриращи генетични елементи на бактерии. Транспозони. Бактериофагите като мигриращи генетични елементи.
2. Мутация. Мутации в бактериите. Мутагени. Спонтанни мутации. Обратни мутации (реверсии).
3. Индуцирани мутации на бактерии. Химическа мутагенеза. Радиационна мутагенеза. Видове мутации.
4. Възстановяване на бактериална ДНК. Системи за възстановяване на ДНК. Компенсация на функции, нарушени в резултат на мутации. Вътрешно генно потискане. Екстрагенно потискане.
5. Трансфер на бактериална ДНК. Конюгация на бактерии. F-фактор на бактериите.
6. Трансформация на бактерии. Етапи на бактериална трансформация. Картографиране на бактериални хромозоми.
7. Трансдукция. Неспецифична трансдукция. Специфична трансдукция. Абортивна трансдукция. Явлението лизогения.
8. Свойства на бактериите. Ненаследствени промени в свойствата на бактериите. S - колонии. R - колонии. М - колонии. D - колонии от бактерии.
Възстановяване на бактериална ДНК. Системи за възстановяване на ДНК. Компенсация на функции, нарушени в резултат на мутации. Вътрешно генно потискане. Екстрагенно потискане.
В клетката има механизми, които могат напълно или частично да възстановят оригиналната структура на променената ДНК. Мутации, причинени от радиация химикалии други фактори, биха могли теоретично да доведат до изчезване на бактериалната популация, ако последните бъдат лишени от способността да възстановяване на ДНК. Набор от ензими, които катализират корекцията на увреждането на ДНК, се комбинират в така наречените възстановителни системи, които се различават фундаментално в биохимичните механизми на "лечебни" увреждания. Има три основни направления за коригиране на ДНК дефекти.
1. Директно сторниране от увредена ДНКкъм оригиналната структура, когато промени в ДНКкоригирани чрез една ензимна реакция. Например, отстраняване на неправилно прикрепена метилова група при шестия кислороден атом на гуанин с помощта на метилтрансфераза; или разцепване на тиминовия димер в резултат на облъчване с помощта на фотолиаза ( рекомбинационен ремонт).
2. „Изрязване“ на щетипоследвано от възстановяване на оригиналната структура (ексцизионен ремонт).
3. Активиране на специални механизми, осигуряващи оцеляване в случай на повреда ДНК(възстановяване на оригиналната структура ДНКв резултат на рекомбинация; коригиране на грешно сдвояване на основите; транслационен синтез върху повредена матрица ДНК). Тези механизми не винаги водят до пълно възстановяване на оригиналната структура на ДНК.
Компенсация на функции, нарушени в резултат на мутации
Първична мутациямогат да бъдат компенсирани от вторична мутация, възникнала в рамките на мутиралия ген (интрагенно) или в друг ген (екстрагенно). Промени, които елиминират проявите на мутация, без да коригират първоначалното нарушение в ДНК, Наречен потискане.
Вътрешно генно потисканепричинени от вторична мутация, коригираща ефектите на първичната мутация. Например, точкова мутация, която води до синтеза на дефектен протеин със загубена биологична активност, може да бъде коригирана, ако вторична точкова мутация води до кодиране на аминокиселина, която запазва конфигурацията и активността на протеина. Точното възстановяване на оригиналната генна структура се нарича истинска обратна мутация ( истинска реверсия). Ако ефектът от първата мутация се компенсира от мутация в друга част на гена, такива мутации се наричат вторични реверсии.
Екстрагенно потискане- потискане на проявата на мутация, настъпила в един ген поради мутация във втория ген.
