Male RNA i rak. Veliki poslovi malih molekula: kako male RNA orkestriraju bakterijske gene Male RNA

U živoj stanici protok informacija između jezgre i citoplazme nikada ne presušuje, ali razumijevanje svih njegovih "kovitlaca" i dešifriranje informacija kodiranih u njima doista je herkulov zadatak. Jedan od najvažnijih otkrića u biologiji prošlog stoljeća može se smatrati otkrićem informacijskih (ili matričnih) molekula RNA (mRNA ili mRNA), koje služe kao posrednici koji prenose informacijske "poruke" od jezgre (od kromosoma) do citoplazme. . Odlučujuća uloga RNK u sintezi proteina predvidjena je još 1939. u radu Thorbjörna Kasperssona ( Torbjörn Caspersson), Jean Brachet ( Jean Brachet) i Jack Schultz ( Jack Schultz), a 1971. George Marbeis ( George Marbaix) pokrenuo je sintezu hemoglobina u oocitima žaba ubrizgavanjem prve izolirane zečje glasničke RNK koja kodira ovaj protein.

Godine 1956. – 1957. u Sovjetskom Savezu, A. N. Belozersky i A. S. Spirin neovisno su dokazali postojanje mRNA, a također su otkrili da glavnina RNA u stanici nije šablonska, već ribosomska RNA(rRNA). Ribosomska RNA - drugi "glavni" tip stanične RNA - čini "kostur" i funkcionalno središte ribosoma u svim organizmima; RRNA (a ne proteini) je ta koja regulira glavne faze sinteze proteina. Istodobno je opisana i proučavana treća "glavna" vrsta RNA - prijenosne RNA (tRNA), koje u kombinaciji s druge dvije - mRNA i rRNA - tvore jedan kompleks za sintezu proteina. Prema prilično popularnoj hipotezi "RNK svijeta", upravo je ova nukleinska kiselina bila u samom podrijetlu života na Zemlji.

Budući da je RNA značajno hidrofilnija u usporedbi s DNA (zbog zamjene deoksiriboze ribozom), labilnija je i može se relativno slobodno kretati u stanici, te stoga isporučuje kratkotrajne replike genetske informacije(mRNA) na mjesto gdje počinje sinteza proteina. Međutim, vrijedi napomenuti "neugodnost" povezanu s tim - RNA je vrlo nestabilna. Pohranjuje se puno lošije od DNK (čak i unutar stanice) i razgrađuje se pri najmanjoj promjeni uvjeta (temperatura, pH). Osim "vlastite" nestabilnosti, veliki doprinos pripada ribonukleazama (ili RNazama) - klasi enzima koji cijepaju RNK koji su vrlo stabilni i "sveprisutni" - čak i koža ruku eksperimentatora sadrži dovoljno ovih enzima da negira cijeli eksperiment. Zbog toga je rad s RNK mnogo teži nego s proteinima ili DNK - potonji se općenito mogu pohraniti stotinama tisuća godina bez ikakvih oštećenja.

Fantastična njega tijekom rada, tri-destilat, sterilne rukavice, jednokratno laboratorijsko stakleno posuđe - sve je to potrebno kako bi se spriječila degradacija RNK, ali održavanje takvih standarda nije uvijek bilo moguće. Stoga dugo vremena jednostavno nisu obraćali pozornost na kratke "fragmente" RNK, koji su neizbježno kontaminirali otopine. Međutim, s vremenom je postalo jasno da se, usprkos svim naporima da se održi sterilnost radnog područja, “otpadci” prirodno nastavljaju otkrivati, a zatim se pokazalo da su tisuće kratkih dvolančanih RNA uvijek prisutne u citoplazmi. , obavljaju vrlo specifične funkcije i apsolutno su neophodni za normalan razvoj stanica i organizma.

Princip RNA interferencije

Farmaceuti su također postali zainteresirani za mogućnost korištenja siRNA, budući da sposobnost specifične regulacije funkcioniranja pojedinih gena obećava neviđene izglede u liječenju niza bolesti. Mala veličina i visoka specifičnost djelovanja obećavaju visoku učinkovitost i nisku toksičnost lijekova na bazi siRNA; kako god riješiti problem dostava siRNA do oboljelih stanica u tijelu još nije bila uspješna – to je zbog krhkosti i lomljivosti ovih molekula. I premda deseci timova sada pokušavaju pronaći način kako te "čarobne metke" usmjeriti točno na metu (unutar oboljelih organa), još nisu postigli vidljiv uspjeh. Osim toga, postoje i druge poteškoće. Na primjer, u slučaju antivirusne terapije, visoka selektivnost djelovanja siRNA može biti loša usluga - budući da virusi brzo mutiraju, modificirani soj će vrlo brzo izgubiti osjetljivost na siRNA odabranu na početku terapije: poznato je da zamjena samo jednog nukleotida u siRNA dovodi do značajnog smanjenja učinka interferencije.

U ovom trenutku vrijedi se ponovno prisjetiti - siRNA su otkrivene samo kod biljaka, beskralježnjaka i jednostaničnih organizama; Iako su homolozi proteina za interferenciju RNA (Dicer, RISC kompleks) također prisutni u viših životinja, siRNA nisu otkrivene konvencionalnim metodama. Kakvo je to bilo iznenađenje kada umjetno uveden sintetski analozi siRNA uzrokovali su snažan specifičan učinak ovisan o dozi u kulturama stanica sisavaca! To je značilo da u stanicama kralježnjaka RNA interferencija nije zamijenjena složenijim imunološkim sustavima, već je evoluirala zajedno s organizmima, pretvarajući se u nešto "naprednije". Posljedično, kod sisavaca nije bilo potrebno tražiti točne analoge siRNA, već njihove evolucijske nasljednike.

Igrač #2 - mikroRNA

Dapače, na temelju evolucijski prilično drevnog mehanizma interferencije RNA, u razvijenijim organizmima pojavila su se dva specijalizirana sustava za kontrolu rada gena, svaki koristeći svoju skupinu malih RNA - mikroRNA(mikroRNA) i piRNA(piRNA, Piwi-interacting RNA). Oba sustava pojavila su se u spužvama i crijevima te su evoluirala zajedno s njima, istiskujući siRNA i mehanizam "gole" RNA interferencije. Njihova uloga u stvaranju imuniteta je sve manja, budući da su tu funkciju preuzeli napredniji mehanizmi stanične imunosti, posebice interferonski sustav. Međutim, ovaj sustav je toliko osjetljiv da pokreće i samu siRNA: pojava male dvolančane RNA u stanici sisavaca pokreće "signal za uzbunu" (aktivira lučenje interferona i uzrokuje ekspresiju gena ovisnih o interferonu, koji u potpunosti blokira sve procese prevođenja). S tim u vezi, mehanizam RNA interferencije kod viših životinja posredovan je uglavnom mikroRNA i piRNA - jednolančanim molekulama specifične strukture koje interferonski sustav ne detektira.

Kako je genom postajao složeniji, mikroRNK i piRNK su se sve više uključivale u regulaciju transkripcije i translacije. S vremenom su se pretvorili u dodatni, precizan i suptilan sustav regulacije genoma. Za razliku od siRNA, mikroRNA i piRNA (otkrivene 2001., vidi Okvir 3) ne proizvode se iz stranih dvolančanih molekula RNA, već su inicijalno kodirane u genomu domaćina.

Upoznajte: mikroRNA

Prekursor mikroRNA se transkribira s oba lanca genomske DNK pomoću RNA polimeraze II, što rezultira pojavom intermedijarnog oblika - pri-mikroRNA - koji nosi značajke obične mRNA - m 7 G-cap i polyA tail. Ovaj prekursor tvori petlju s dva jednolančana "repa" i nekoliko nesparenih nukleotida u središtu (slika 3). Takva se petlja podvrgava obradi u dvije faze (slika 4): prvo endonukleaza Drosha odsiječe jednolančane "repove" RNA s ukosnice, nakon čega se izrezana ukosnica (pre-microRNA) izvozi u citoplazmu, gdje se je prepoznao Dicer, koji je napravio još dva reza (dvolančani dio je izrezan, označen bojom na slici 3). U ovom obliku, zrela mikroRNA, slična siRNA, uključena je u RISC kompleks.

Slika 3. Struktura dvolančane molekule prekursora mikroRNA. Glavne značajke: prisutnost očuvanih sekvenci koje tvore ukosnicu; prisutnost komplementarne kopije (microRNA*) s dva "dodatna" nukleotida na 3′ kraju; specifična sekvenca (2-8 bp) koja tvori mjesto prepoznavanja za endonukleaze. Sama mikroRNA označena je crvenom bojom - to je ono što Dicer izrezuje.

Mehanizam djelovanja mnogih mikroRNA sličan je djelovanju siRNA: kratka (21-25 nukleotida) jednolančana RNA kao dio proteinskog kompleksa RISC veže se s visokom specifičnošću na komplementarno mjesto u 3' neprevedenoj regiji ciljna mRNA. Vezanje dovodi do cijepanja mRNA proteinom Ago. Međutim, aktivnost mikroRNA (u usporedbi sa siRNA) već je više diferencirana - ako komplementarnost nije apsolutna, ciljna mRNA možda neće biti degradirana, već samo reverzibilno blokirana (neće biti translacije). Može se koristiti i isti RISC kompleks umjetno uveden siRNA. Ovo objašnjava zašto su siRNA napravljene po analogiji s protozoama također aktivne kod sisavaca.

Dakle, ilustraciju mehanizma djelovanja RNA interferencije u višim (bilateralno simetričnim) organizmima možemo dopuniti kombinacijom na jednoj slici akcijskog dijagrama mikroRNA i biotehnološki uvedenih siRNA (slika 5).

Slika 5. Generalizirana shema djelovanja umjetnih mikroRNA i siRNA(umjetne siRNA uvode se u stanicu pomoću specijaliziranih plazmida - ciljanje siRNA vektora).

Funkcije mikroRNA

Fiziološke funkcije mikroRNA iznimno su raznolike - zapravo, one djeluju kao glavni neproteinski regulatori ontogeneze. mikroRNA ne poništavaju, već nadopunjuju “klasičnu” shemu regulacije gena (induktori, supresori, zbijanje kromatina itd.). Osim toga, sama sinteza mikroRNA složeno je regulirana (određene skupine mikroRNA mogu uključiti interferoni, interleukini, faktor nekroze tumora α (TNF-α) i mnogi drugi citokini). Kao rezultat, nastaje višerazinska mreža ugađanja "orkestra" tisuća gena, nevjerojatna u svojoj složenosti i fleksibilnosti, ali tu nije kraj.

mikroRNA su "univerzalnije" od siRNA: "ward" geni ne moraju biti 100% komplementarni - regulacija se također provodi kroz djelomičnu interakciju. Danas je jedna od najvrućih tema u molekularnoj biologiji potraga za mikroRNA koje djeluju kao alternativni regulatori poznatih fizioloških procesa. Na primjer, mikroRNA uključene u regulaciju staničnog ciklusa i apoptoze u biljaka, drozofila i nematoda već su opisane; kod ljudi mikroRNA reguliraju imunološki sustav i razvoj hematopoetskih matičnih stanica. Korištenje tehnologija temeljenih na biočipu (probir mikronizova) pokazalo je da se cijeli skup malih RNA uključuje i isključuje u različitim fazama života stanice. Deseci specifičnih mikroRNK identificirani su za biološke procese, čija se razina ekspresije pod određenim uvjetima mijenja tisućama puta, naglašavajući iznimnu mogućnost kontrole tih procesa.

Donedavno se vjerovalo da mikroRNA samo potiskuju – potpuno ili djelomično – rad gena. Međutim, nedavno se pokazalo da se djelovanje mikroRNA može radikalno razlikovati ovisno o stanju stanice! U stanici koja se aktivno dijeli, mikroRNA se veže na komplementarnu sekvencu u 3′ regiji mRNA i inhibira sintezu proteina (translaciju). Međutim, u stanju mirovanja ili stresa (primjerice, kada raste u lošoj okolini), isti događaj dovodi do potpuno suprotnog učinka - povećane sinteze ciljnog proteina!

Evolucija mikroRNA

Broj varijanti mikroRNA u višim organizmima još nije u potpunosti utvrđen - prema nekim podacima, prelazi 1% od broja gena koji kodiraju proteine ​​(kod ljudi, na primjer, kažu da postoji 700 mikroRNA, a taj broj je stalno raste). mikroRNA reguliraju aktivnost oko 30% svih gena (mete za mnoge od njih još nisu poznate), a postoje i sveprisutne i tkivno specifične molekule - na primjer, jedan takav važan skup mikroRNA regulira sazrijevanje krvnog stabla Stanice.

Široki profil ekspresije u različitim tkivima različitih organizama i biološka prevalencija mikroRNA ukazuju na evolucijsko drevno podrijetlo. MikroRNA su prvi put otkrivene u nematodama, a dugo se vjerovalo da se te molekule pojavljuju samo u spužvama i crijevima; međutim, kasnije su otkriveni u jednostaničnim algama. Zanimljivo, kako organizmi postaju složeniji, broj i heterogenost skupa miRNA također se povećava. To neizravno ukazuje na to da je složenost ovih organizama osigurana, posebice, funkcioniranjem mikroRNA. Moguća evolucija miRNA prikazana je na slici 6.

Slika 6. Raznolikost mikroRNA u različitim organizmima.Što je organizam viši, to se u njemu nalazi više mikroRNK (broj u zagradama). Vrste u kojima su pronađeni označene su crvenom bojom. singl mikroRNA.

Između siRNA i mikroRNA može se povući jasna evolucijska veza na temelju sljedećih činjenica:

• djelovanje obje vrste je međusobno zamjenjivo i posredovano je homolognim proteinima;
• siRNA uvedene u stanice sisavaca specifično "isključuju" željene gene (unatoč određenoj aktivaciji interferonske zaštite);
• mikroRNA se otkrivaju u sve više drevnih organizama.

Ovi i drugi podaci upućuju na podrijetlo oba sustava od zajedničkog "pretka". Također je zanimljivo primijetiti da "RNK" imunitet kao nezavisni prekursor proteinskih antitijela potvrđuje teoriju o podrijetlu prvih oblika života temeljenih na RNK, a ne proteinima (podsjetimo da je to omiljena teorija akademika A.S. Spirina) .

Što dalje idete, postaje sve zbunjujuće. Igrač #3 - piRNA

Dok su u areni molekularne biologije postojala samo dva "igrača" - siRNA i mikroRNA - glavna "svrha" interferencije RNA činila se potpuno jasnom. Doista: skup homolognih kratkih RNA i proteina u različitim organizmima obavlja slične radnje; Kako organizmi postaju složeniji, tako raste i funkcionalnost.

Međutim, priroda je u procesu evolucije stvorila još jedan, evolucijski najnoviji i visoko specijalizirani sustav koji se temelji na istom uspješnom principu RNA interferencije. Govorimo o piRNA (piRNA, od Piwi-interakcija RNA).

Što je genom složenije organiziran, to je organizam razvijeniji i prilagođeniji (ili obrnuto? ;-). Međutim, povećanje složenosti genoma ima i lošu stranu: složen genetski sustav postaje nestabilan. To dovodi do potrebe za mehanizmima koji su odgovorni za održavanje integriteta genoma - inače će ga spontano "miješanje" DNK jednostavno onemogućiti. Mobilni genetski elementi ( MGE) – jedan od glavnih čimbenika nestabilnosti genoma – su kratke nestabilne regije koje se mogu autonomno transkribirati i migrirati kroz cijeli genom. Aktivacija takvih prenosivih elemenata dovodi do višestrukih lomova DNA u kromosomima, što može imati smrtonosne posljedice.

Broj MGE raste nelinearno s veličinom genoma i njihova se aktivnost mora suzdržati. Da bi to učinile, životinje, počevši od koelenterata, koriste isti fenomen interferencije RNA. Tu funkciju također obavljaju kratke RNA, ali ne one o kojima je već bilo riječi, već treća njihova vrsta - piRNA.

“Portret” piRNA

Funkcije piRNA

Glavna funkcija piRNA je suzbijanje aktivnosti MGE na razini transkripcije i translacije. Vjeruje se da su piRNA aktivne samo tijekom embriogeneze, kada je nepredvidivo miješanje genoma posebno opasno i može dovesti do smrti embrija. To je logično - kada imunološki sustav još nije počeo raditi, stanice embrija trebaju jednostavnu, ali učinkovitu zaštitu. Embrij je pouzdano zaštićen od vanjskih patogena posteljicom (ili ljuskom jajeta). Ali osim toga, potrebna je i obrana od endogenih (unutarnjih) virusa, prije svega MGE.

Ova uloga piRNA potvrđena je iskustvom - "nokaut" ili mutacije gena Ago3, Piwi ili Aub dovode do ozbiljnih razvojnih poremećaja (i naglog povećanja broja mutacija u genomu takvog organizma), a također uzrokuju neplodnost zbog poremećaja razvoja zametnih stanica.

Distribucija i evolucija piRNA

Prve piRNA već se nalaze u morskim anemonama i spužvama. Biljke su očito krenule drugim putem - u njima nisu pronađeni Piwi proteini, a ulogu "brnjice" za transpozone obavljaju endonukleaza Ago4 i siRNA.

Kod viših životinja - uključujući ljude - piRNA sustav je vrlo dobro razvijen, ali se može naći samo u embrionalnim stanicama i u amnionskom endotelu. Zašto je distribucija piRNA u tijelu toliko ograničena, ostaje za vidjeti. Može se pretpostaviti da su, kao i svako moćno oružje, piRNA korisne samo u vrlo specifičnim uvjetima (tijekom fetalnog razvoja), au tijelu odrasle osobe njihova će aktivnost uzrokovati više štete nego koristi. Ipak, broj piRNA je red veličine veći od broja poznatih proteina, a nespecifične učinke piRNA u zrelim stanicama je teško predvidjeti.

Zaključak

U zaključku bih želio pružiti tablicu koja ilustrira evoluciju proteinskog aparata koji je uključen u interferenciju RNA (slika 9). Vidljivo je da protozoe imaju najrazvijeniji sustav siRNA (porodice proteina Ago, Dicer), a kako organizmi postaju složeniji, naglasak se pomiče na specijaliziranije sustave - broj izoformi proteina za mikroRNA (Drosha, Pasha) i piRNA ( Piwi, Hen1) povećava. Istodobno se smanjuje raznolikost enzima koji posreduju u djelovanju siRNA.

Slika 9. Raznolikost proteina uključenih u RNA interferenciju(brojevi označavaju broj proteina svake skupine). Plava istaknuti su elementi karakteristični za siRNA i mikroRNA, i Crvena- bjelančevine I povezane s piRNA.

Fenomen RNA interferencije počeli su koristiti najjednostavniji organizmi. Na temelju tog mehanizma priroda je stvorila prototip imunološkog sustava, a kako organizmi postaju sve složeniji, RNA interferencija postaje neizostavan regulator aktivnosti genoma. Dva različita mehanizma plus tri tipa kratkih RNA ( cm. tab. 1) - kao rezultat vidimo tisuće finih regulatora raznih metaboličkih i genetskih putova. Ova upečatljiva slika ilustrira svestranost i evolucijsku prilagodbu molekularnih biološki sustavi. Kratke RNA još jednom dokazuju da unutar stanice nema “sitnica” - postoje samo male molekule, čiju punu ulogu tek počinjemo shvaćati.

(Istina, takva fantastična složenost prije sugerira da je evolucija "slijepa" i djeluje bez prethodnog odobrenja " glavni plan» »;

Znanstvenici vjeruju da je neispravna ekspresija malih RNA jedan od uzroka niza bolesti koje ozbiljno ugrožavaju zdravlje mnogih ljudi diljem svijeta. Te bolesti uključuju kardiovaskularne 23 i rak 24 . Što se potonjeg tiče, to nije iznenađujuće: rak ukazuje na abnormalnosti u razvoju stanica i njihovoj sudbini, a male RNA igraju ključnu ulogu u odgovarajućim procesima. Ovdje je jedan od najznačajnijih primjera ogromnog utjecaja koji male RNA imaju na tijelo tijekom raka. Riječ je o zloćudnom tumoru, koji je karakteriziran neispravnom ekspresijom onih gena koji djeluju tijekom početnog razvoja organizma, a ne u postnatalnom razdoblju. Ovo je vrsta dječjeg tumora mozga koji se obično pojavljuje prije druge godine života. Nažalost, radi se o vrlo agresivnom obliku raka, a prognoza je ovdje čak i uz intenzivno liječenje nepovoljna. Onkološki proces se razvija zbog nepravilne preraspodjele genetskog materijala u stanicama mozga. Promotor koji normalno pokreće jaku ekspresiju jednog od gena za kodiranje proteina podvrgava se rekombinaciji sa specifičnim klasterom malih RNA. Zatim se cijela ova preuređena regija podvrgava amplificiranju: drugim riječima, mnoge kopije se stvaraju u genomu. Posljedično, male RNA smještene "nizvodno" od premještenog promotora izražene su mnogo jače nego što bi trebale biti. Razina aktivnih malih RNA približno je 150-1000 puta viša od normalne.

Riža. 18.3. Male RNA aktivirane alkoholom mogu se kombinirati s glasničkim RNA koje ne utječu na otpornost tijela na učinke alkohola. Ali ove male RNA ne vežu se na molekule glasničke RNA koje potiču takvu otpornost. To rezultira relativnom prevlašću udjela glasničkih RNA molekula koje kodiraju varijacije proteina povezane s tolerancijom na alkohol.

Ovaj klaster kodira više od 40 različitih malih RNA. Zapravo, ovo je općenito najveći od takvih klastera pronađenih kod primata. Obično se izražava tek rano u ljudskom razvoju, u prvih 8 tjedana embrionalnog života. Njegova snažna aktivacija u mozgu dojenčadi dovodi do katastrofalnih učinaka na genetsku ekspresiju. Jedna od posljedica je ekspresija epigenetskog proteina koji dodaje modifikacije DNK. To dovodi do raširenih promjena u cijelom obrascu metilacije DNK, a time i do abnormalne ekspresije svih vrsta gena, od kojih bi se mnogi trebali eksprimirati samo kada se nezrele moždane stanice dijele tijekom ranih faza razvoja. Ovako počinje program raka u bebinim stanicama 25.

Takva komunikacija između malih RNA i epigenetskih strojeva stanice može imati značajan utjecaj na druge situacije kada stanice razviju predispoziciju za rak. Ovaj mehanizam vjerojatno rezultira učinkom poremećaja ekspresije male RNA koji je pojačan promjenama u epigenetskim modifikacijama koje se prenose na stanice kćeri s majke. To može stvoriti obrazac potencijalno opasnih promjena u obrascu ekspresije gena.

Do sada znanstvenici nisu shvatili sve faze interakcije malih RNA s epigenetskim procesima, ali još uvijek mogu dobiti neke naznake o značajkama onoga što se događa. Na primjer, pokazalo se da određena klasa malih RNA, koje pojačavaju agresivnost raka dojke, cilja na određene enzime u messenger RNA koji uklanjaju ključne epigenetske modifikacije. Ovo mijenja obrazac epigenetskih modifikacija u stanici raka i dodatno ometa genetsku ekspresiju 26 .

Mnoge oblike raka teško je pratiti kod bolesnika. Onkološki procesi mogu se pojaviti na teško dostupnim mjestima, što komplicira postupak uzorkovanja. U takvim slučajevima liječniku nije lako pratiti razvoj procesa raka i odgovor na liječenje. Često su liječnici prisiljeni oslanjati se na neizravna mjerenja - recimo, tomografski pregled tumora. Neki istraživači vjeruju da bi male molekule RNK mogle pomoći u stvaranju nove tehnike za praćenje razvoja tumora, koja bi također mogla proučavati njegovo porijeklo. Kada stanice raka umru, male RNA napuštaju stanicu kada ona pukne. Ove male nepotrebne molekule često tvore komplekse sa staničnim proteinima ili su omotane u fragmente staničnih membrana. Zbog toga su vrlo stabilne u tjelesnim tekućinama, što znači da se takve RNA mogu izolirati i analizirati. Budući da su njihove količine male, istraživači će morati koristiti vrlo osjetljive metode analize. Međutim, ovdje ništa nije nemoguće: sekvenciranje osjetljivosti nukleinske kiseline stalno raste 27. Objavljeni su podaci koji potvrđuju obećanje ovog pristupa u odnosu na rak dojke 28 , rak jajnika 29 i niz drugih onkoloških bolesti. Analiza malih cirkulirajućih RNA kod bolesnika s rakom pluća pokazala je da te RNA pomažu u razlikovanju između pacijenata sa pojedinačnim plućnim čvorovima (koji ne zahtijevaju terapiju) i pacijenata kod kojih se razviju maligni tumorski čvorovi (koji zahtijevaju liječenje) 30 .

), sprječavajući translaciju mRNA na ribosomima u protein koji kodira. U konačnici, učinak male interferirajuće RNA identičan je onom jednostavnog smanjenja ekspresije gen.

Male interferirajuće RNA otkrivene su u 1999. godine Grupa David Balcombe ( Engleski David Baulcombe) u Velikoj Britaniji kao komponenta posttranskripcijskog sustava utišavanje gena u biljkama ( Engleski PTGS hr:posttranskripcijsko utišavanje gena ). Skupina je svoje nalaze objavila u časopisu Znanost.

Dvolančane RNA mogu poboljšati ekspresiju gena kroz mehanizam koji se naziva aktivacija gena ovisna o RNA ( Engleski RNAa, mala RNA-inducirana aktivacija gena). Dokazano je da dvolančane RNA komplementarne promotorima ciljnih gena uzrokuju aktivaciju odgovarajućih gena. Aktivacija ovisna o RNK nakon primjene sintetičke dvolančane RNK dokazana je za ljudske stanice. Nije poznato postoji li sličan sustav u stanicama drugih organizama.

Omogućujući mogućnost isključivanja praktički bilo kojeg gena po želji, mala interferirajuća RNA-bazirana RNA interferencija izazvala je ogroman interes u osnovnoj i primijenjenoj biologiji. Broj širokih testova temeljenih na RNAi za identifikaciju važnih gena u biokemijskim putovima raste. Budući da je razvoj bolesti određen i aktivnošću gena, očekuje se da u nekim slučajevima isključivanje gena pomoću male interferirajuće RNA može imati terapeutski učinak.

Međutim, primjena RNA interferencije male interferirajuće RNA na životinje, a posebno na ljude, suočava se s mnogim poteškoćama. Eksperimenti su pokazali da se učinkovitost male interferirajuće RNA razlikuje za različite vrste stanica: neke stanice lako reagiraju na utjecaj male interferirajuće RNA i pokazuju smanjenje ekspresije gena, dok se kod drugih to ne opaža, unatoč učinkovitoj transfekcija. Razlozi za ovu pojavu još uvijek su slabo shvaćeni.

Rezultati prve faze ispitivanja prva dva terapijska lijeka koji djeluju putem mehanizma RNA interferencije (namijenjena liječenju makularna degeneracija), objavljen krajem 2005., pokazuju da pacijenti lako podnose male interferirajuće RNA lijekove i da imaju prihvatljiva farmakokinetička svojstva.

Preliminarna klinička ispitivanja ciljanja malih interferirajućih RNA virus ebole, pokazuju da bi mogli biti učinkoviti za postekspozicijsku profilaksu bolesti. Ovaj je lijek omogućio cijeloj skupini pokusnih primata da prežive nakon što su primili smrtonosnu dozu Zaire Ebolavirusa

Duljina siRNA je 21-25 bp, nastaju iz dsRNA. Izvor takvih RNA mogu biti virusne infekcije, genetski konstrukti uneseni u genom, duge ukosnice u transkriptima i dvosmjerna transkripcija mobilnih elemenata.
dsRNA se reže pomoću RNase Dicer na fragmente duge 21-25 bp. s 3" krajevima koji strše za 2 nukleotida, nakon čega je jedan od lanaca dio RISC-a i usmjerava rezanje homolognih RNA. RISC sadrži siRNA koje odgovaraju i plus i minus lancima dsRNA. siRNA nemaju vlastite gene i predstavljaju fragmenti dužih RNA.siRNA usmjeravaju rezanje ciljne RNA, budući da su s njom potpuno komplementarne.U biljkama, gljivama i nematodama, RNA-ovisne RNA polimeraze uključene su u proces supresije genske ekspresije, za što siRNA također služe kao početnice (sjeme za sintezu nove RNA Rezultirajuća dsRNA se reže Dicerom, nastaju nove siRNA, koje su sekundarne, čime se pojačava signal.

RNA interferencija

Godine 1998. Craig C. Mello i Andrew Fire objavili su u časopisu Nature, koji je naveo da je dvolančana RNA (dsRNA) sposobna potisnuti ekspresiju gena. Kasnije se pokazalo da je aktivni princip u ovom procesu kratka jednolančana RNK. Mehanizam supresije ekspresije gena pomoću ovih RNA naziva se
RNA interferencija, kao i RNA silencing. Ovaj mehanizam nalazimo u svim velikim taksonima eukariota: kralježnjacima i beskralješnjacima, biljkama i gljivama. Za ovo otkriće 2006. godine dobio je Nobelovu nagradu.
Potiskivanje ekspresije može se dogoditi na transkripcijskoj razini ili posttranskripcijski. Ispostavilo se da je u svim slučajevima potreban sličan skup proteina i kratkih (21-32 bp) RNA.
siRNA reguliraju aktivnost gena na dva načina. Kao što je gore spomenuto, oni usmjeravaju rezanje ciljnih RNA. Ovaj fenomen se naziva "supresija" ( ugušivanje) u gljivama, " posttranslacijsko utišavanje gena"u biljkama i" RNA interferencija "kod životinja. u te procese uključene su siRNA duge 21-23 bp. Druga vrsta učinka je da siRNA mogu potisnuti transkripciju gena koji sadrže homologne sekvence siRNA. Taj fenomen je tzv. utišavanje transkripcijskih gena (TGS) i nalazi se u kvascima, biljkama i životinjama. siRNA također usmjeravaju metilaciju DNA, što dovodi do stvaranja heterokromatina i potiskivanja transkripcije. TGS je najbolje proučavan u kvascu S. pombe, gdje je utvrđeno da su siRNA integrirane u RISC-u sličan kompleks proteina, pod nazivom RITS. U njegovom slučaju, kao iu slučaju RISC, siRNA stupa u interakciju s proteinom iz obitelji AGO. Vjerojatno je da siRNA može usmjeriti ovaj kompleks na gen koji sadrži homologni fragment siRNA. Nakon toga, RITS proteini regrutiraju metiltransferaze, uslijed čega nastaje heterokromatin u lokusu koji kodira ciljni gen siRNA, te prestaje aktivna ekspresija gena.

Uloga u staničnim procesima

Kakvo je značenje siRNA u stanici?
siRNA sudjeluju u zaštiti stanica od virusa, potiskivanju transgena, regulaciji određenih gena i stvaranju centromernog heterokromatina. Važna funkcija siRNA je supresija ekspresije mobilnih genetskih elemenata. Takvo se potiskivanje može dogoditi i na transkripcijskoj razini i posttranskripcijski.
Genom nekih virusa sastoji se od DNA, dok se drugi sastoje od RNA, a RNA virusa može biti jednolančana ili dvolančana. Proces rezanja strane (virusne) mRNA u ovom slučaju odvija se na isti način kao što je gore opisano, odnosno aktivacijom RISC enzimskog kompleksa. Međutim, za veću učinkovitost, biljke i insekti izumili su jedinstveni način za pojačavanje zaštitnog učinka siRNA. Spajanjem lanca mRNA, dio siRNA može, uz pomoć kompleksa enzima DICER, najprije dovršiti drugi lanac mRNA, a zatim ga prerezati na različitim mjestima, stvarajući tako razne "sekundarne" siRNA. Oni, zauzvrat, formiraju RISC i nose mRNA kroz sve gore spomenute faze, sve do njenog potpunog uništenja. Takve "sekundarne" molekule moći će se specifično vezati ne samo na dio virusne mRNA na koji je usmjerena "primarna" molekula, već i na druga područja, što dramatično povećava učinkovitost stanične obrane.

Stoga su u biljkama i nižim životinjskim organizmima siRNA važan dio neke vrste "unutarstaničnog imuniteta" koji im omogućuje prepoznavanje i brzo uništavanje strane RNA. Ako je RNA koja sadrži virus ušla u stanicu, takav zaštitni sustav spriječit će njezino razmnožavanje. Ako virus sadrži DNA, sustav siRNA spriječit će ga u proizvodnji virusnih proteina (budući da će za to biti prepoznata i izrezana potrebna mRNA), a korištenje ove strategije usporit će njegovo širenje po tijelu.

Sisavci, za razliku od kukaca i biljaka, imaju drugačiji obrambeni sustav. Kada strana RNA, čija je duljina veća od 30 bp, uđe u "zrelu" (diferenciranu) stanicu sisavca, stanica počinje sintetizirati interferon. Interferon, vezanjem na specifične receptore na površini stanice, može stimulirati čitavu skupinu gena u stanici. Kao rezultat toga, u stanici se sintetizira nekoliko vrsta enzima koji inhibiraju sintezu proteina i razgrađuju virusnu RNK. Osim toga, interferon može djelovati i na susjedne, još neinficirane stanice, blokirajući tako moguće širenje virusa.

Kao što vidite, oba su sustava na mnogo načina slična: imaju zajednički cilj i "metode" rada. Čak i sami nazivi "interferon" i "(RNA) interferencija" potječu od zajedničkog korijena. No, imaju i jednu vrlo značajnu razliku: ako interferon, na prve znakove invazije, jednostavno "zamrzne" rad stanice, ne dopuštajući (za svaki slučaj) proizvodnju mnogih, uključujući i "nedužnih" proteina u stanici, onda je siRNA sustav izuzetno razumljiv: svaka siRNA će prepoznati i uništiti samo svoju specifičnu mRNA. Zamjena samo jednog nukleotida unutar siRNA dovodi do oštrog smanjenja učinka interferencije . Nijedan od do sada poznatih genskih blokatora nema tako iznimnu specifičnost za svoj ciljni gen.

Otkriće RNA interferencije dalo je novu nadu u borbi protiv AIDS-a i raka. Moguće je da se upotrebom siRNA terapije zajedno s tradicionalnom antivirusnom terapijom može postići pojačani učinak, pri čemu dva tretmana rezultiraju većim terapijskim učinkom od jednostavnog zbroja svakog pojedinačno datog.
Kako bi se koristio mehanizam interferencije siRNA u stanicama sisavaca, u stanice se moraju unijeti gotove dvolančane molekule siRNA. Optimalna veličina takve sintetičke siRNA je istih 21-28 nukleotida. Ako povećate njegovu duljinu, stanice će odgovoriti proizvodnjom interferona i smanjenjem sinteze proteina. Sintetske siRNA mogu ući iu zaražene i u zdrave stanice, a smanjenje proizvodnje proteina u nezaraženim stanicama bilo bi vrlo nepoželjno. S druge strane, ako pokušate koristiti siRNA manju od 21 nukleotida, specifičnost njenog vezanja na željenu mRNA i sposobnost stvaranja RISC kompleksa naglo se smanjuju.

Ako je moguće isporučiti siRNA na ovaj ili onaj način koji ima sposobnost vezanja na bilo koji dio HIV genoma (koji se, kao što je poznato, sastoji od RNA), može se pokušati spriječiti njezina integracija u DNA domaćina ćelija. Osim toga, znanstvenici razvijaju načine utjecaja na različite faze reprodukcije HIV-a u već zaraženoj stanici. Potonji pristup neće pružiti lijek, ali može značajno smanjiti stopu reprodukcije virusa i dati stjeranom imunološkom sustavu priliku da se "odmori" od napada virusa i pokuša se nositi s ostacima same bolesti. Na slici su dvije faze reprodukcije HIV-a u stanici, za koje se znanstvenici nadaju da se mogu blokirati pomoću siRNA, označene crvenim križićima (faze 4-5 - integracija virusa u kromosom i faze 5-6 - sklapanje virus i izlazak iz stanice).


Danas se pak sve navedeno odnosi samo na područje teorije. U praksi siRNA terapija nailazi na poteškoće koje znanstvenici još nisu uspjeli prevladati. Na primjer, u slučaju antivirusne terapije, visoka specifičnost siRNA može odigrati okrutnu šalu: kao što je poznato, virusi imaju sposobnost brze mutacije, tj. promijeniti sastav svojih nukleotida. U tome je posebno uspio HIV, čija je učestalost promjena tolika da osoba zaražena jednim podtipom virusa nakon nekoliko godina može razviti potpuno drugi podtip. U tom će slučaju modificirani soj HIV-a automatski postati neosjetljiv na siRNA odabranu na početku terapije.

Starenje i karcinogeneza

Kao i svaki epigenetski faktor, siRNA utječu na ekspresiju gena koji su utišani. Sada postoje radovi koji opisuju eksperimente o isključivanju gena povezanih s tumorima. Geni se isključuju (obore) pomoću siRNA. Na primjer, kineski znanstvenici su pomoću siRNA isključili gen transkripcijskog faktora 4 (TCF4), čija aktivnost uzrokuje Pitt-Hopkinsov sindrom (vrlo rijetka genetska bolest koju karakterizira mentalna retardacija i epizode hiperventilacije i apneje) i druge psihičke bolesti. U ovom smo radu proučavali ulogu TCF4 u stanicama raka želuca. Ektopična ekspresija TCF4 smanjuje rast stanica u staničnoj liniji raka želuca, izbacivanje gena TCF4 pomoću siRNA povećava migraciju stanica. Stoga možemo zaključiti da epigenetsko isključivanje (utišavanje) gena TCF4 ima važnu ulogu u nastanku i razvoju tumora.

Prema istraživanju na Odjelu za onkologiju, Albert Einstein Cancer Center, pod vodstvom Leonarda H. Augenlichta, siRNA je uključena u isključivanje gena HDAC4, koji uzrokuje inhibiciju rasta raka debelog crijeva, apoptozu i povećanu transkripciju p21. HDAC4 je histon deacetilaza koja je tkivno specifična, inhibira diferencijaciju stanica, a njezina ekspresija je potisnuta tijekom procesa diferencijacije stanica. Rad pokazuje da je HDAC4 važan regulator proliferacije stanica debelog crijeva (što je važno u procesu raka), a njega, pak, regulira siRNA.

Odjel za patologiju Medicinskog fakulteta Nara Medical University u Japanu proveo je istraživanje raka prostate. Replikativno starenje stanica je prepreka nekontroliranoj diobi i karcinogenezi. Kratkoživuće stanice koje se dijele (TAC) dio su stanične populacije prostate iz koje nastaju tumori. Japanski znanstvenici proučavali su razloge zašto te stanice pobjeđuju starenje. Stanice prostate u kulturi su transficirane s junB siRNA. U tim se stanicama opaža povećana razina ekspresija p53, p21, p16 i pRb, otkrivena tijekom starenja. Stanice u kulturi koje su pokazale smanjene razine p16 korištene su za sljedeći korak. Ponovljena transfekcija siRNA u TAC omogućila je stanicama da izbjegnu starenje nakon inaktivacije p16/pRb. Osim toga, utišavanje junB proto-onkogena junB siRNA uzrokuje invaziju stanica. Na temelju toga zaključeno je da je junB element za p16 i potiče stanično starenje, sprječavajući TAC malignost. Prema tome, junB je regulator karcinogeneze prostate i može biti meta za terapijsku intervenciju. A njegova se aktivnost može regulirati pomoću siRNA.

Provode se mnoge slične studije. Trenutno siRNA nije samo predmet, već i alat u rukama istraživača – liječnika, biologa, onkologa, gerontologa. Proučavanje veze između siRNA i raka te ekspresije gena povezanih sa starenjem najvažniji je zadatak znanosti. Prošlo je vrlo malo vremena od otkrića siRNA, no pojavilo se mnogo zanimljivih studija i publikacija vezanih uz njih. Nema sumnje da će njihova studija biti jedan od koraka čovječanstva prema pobjedi nad rakom i starenjem...