isoljavanje: taloženje solima alkalijskih, zemnoalkalijskih metala (natrijev klorid, magnezijev sulfat), amonijev sulfat; nije prekršeno primarna struktura vjeverica;
taloženje: upotreba sredstava za uklanjanje vode: alkohol ili aceton na niskim temperaturama (oko –20 S).
Kada se koriste ove metode, proteini gube svoju hidratacijsku ljusku i talože se u otopini.
Denaturacija- kršenje prostorne strukture proteina (očuvana je primarna struktura molekule). Može biti reverzibilan (struktura proteina se obnavlja nakon uklanjanja sredstva za denaturaciju) ili ireverzibilan (prostorna struktura molekule se ne obnavlja, na primjer, kada se proteini talože koncentriranim mineralnim kiselinama, solima teških metala).
Metode odvajanja proteina Odvajanje proteina od nečistoća niske molekulske mase
Dijaliza
Koristi se posebna polimerna membrana koja ima pore određene veličine. Male molekule (nečistoće niske molekulske mase) prolaze kroz pore u membrani, a velike molekule (proteini) se zadržavaju. Tako se proteini ispiru od nečistoća.
Razdvajanje proteina prema molekulskoj masi
Gel kromatografija
Kromatografska kolona je ispunjena granulama gela (Sephadex), koji ima pore određene veličine. Mješavina proteina se dodaje u kolonu. Proteini čija je veličina manja od veličine pora Sephadexa zadržavaju se u stupcu jer su “zapeli” u porama, dok ostali slobodno izlaze iz stupca (slika 2.1). Veličina proteina ovisi o njegovoj molekulskoj masi.
Riža. 2.1. Odvajanje proteina gel filtracijom
Ultracentrifugiranje
Ova se metoda temelji na različitim brzinama sedimentacije (taloženja) proteinskih molekula u otopinama s različitim gradijentima gustoće (saharozni pufer ili cezijev klorid) (slika 2.2).
Riža. 2.2. Odvajanje proteina ultracentrifugiranjem
elektroforeza
Ova se metoda temelji na različitim brzinama migracije proteina i peptida u električnom polju ovisno o naboju.
Gelovi, celulozni acetat i agar mogu poslužiti kao nosači za elektroforezu. Odvojene molekule kreću se u gelu ovisno o njihovoj veličini: one koje su veće bit će odgođene dok prolaze kroz pore gela. Manje molekule naići će na manji otpor i stoga će se kretati brže. Kao rezultat toga, nakon elektroforeze, veće će molekule biti bliže početku nego manje (slika 2.3).
Riža. 2.3. Razdvajanje proteina elektroforezom u gelu
Elektroforeza se također može koristiti za razdvajanje proteina prema molekularnoj težini. Za ovo koriste PAGE elektroforeza u prisutnosti natrijevog dodecil sulfata (SDS-Na).
Izolacija pojedinačnih proteina
Afinitetna kromatografija
Metoda se temelji na sposobnosti proteina da se snažno vežu na različite molekule putem nekovalentnih veza. Koristi se za izolaciju i pročišćavanje enzima, imunoglobulina i receptorskih proteina.
Molekule tvari (ligandi), na koje se specifično vežu određeni proteini, kovalentno se spajaju s česticama inertne tvari. Mješavina proteina je dodana u kolonu, a željeni protein je čvrsto vezan za ligand. Preostali proteini slobodno napuštaju kolonu. Zadržani protein se zatim može isprati iz kolone pomoću puferske otopine koja sadrži slobodni ligand. Ova vrlo osjetljiva metoda omogućuje izoliranje vrlo malih količina proteina u čistom obliku iz ekstrakta stanica koji sadrži stotine drugih proteina.
Izoelektrično fokusiranje
Metoda se temelji na različitim IET vrijednostima proteina. Proteini se odvajaju elektroforezom na ploči s amfolinom (to je tvar u kojoj je prethodno formiran pH gradijent u rasponu od 3 do 10). Tijekom elektroforeze, proteini se odvajaju prema njihovoj IET vrijednosti (u IET, naboj proteina će biti nula, i neće se kretati u električnom polju).
2D elektroforeza
To je kombinacija izoelektričnog fokusiranja i elektroforeze sa SDS-Na. Elektroforeza se najprije provodi u vodoravnom smjeru na ploči s amfolinom. Proteini se odvajaju prema naboju (IET). Zatim se ploča tretira s otopinom SDS-Na i provodi se elektroforeza u okomitom smjeru. Proteini se odvajaju na temelju molekularne težine.
Imunoelektroforeza (Western blot)
Analitička metoda koja se koristi za identifikaciju specifičnih proteina u uzorku (Slika 2.4).
Izolacija proteina iz biološkog materijala.
Razdvajanje proteina prema molekulskoj masi elektroforezom u PAGE sa SDS-Na.
Prijenos proteina iz gela na polimernu ploču radi lakšeg daljnjeg rada.
Obrada ploče s otopinom nespecifičnog proteina za popunjavanje preostalih pora.
Tako se nakon ove faze dobiva ploča čije pore sadrže izdvojene proteine, a prostor između njih je ispunjen nespecifičnim proteinom. Sada treba utvrditi postoji li među proteinima onaj koji tražimo, a koji je odgovoran za neku bolest. Za otkrivanje se koristi liječenje protutijelima. Primarna antitijela su antitijela na protein od interesa. Sekundarna antitijela znače antitijela na primarna antitijela. Dodatna posebna oznaka (tzv. molekularna sonda) dodaje se sekundarnim antitijelima kako bi se rezultati mogli vizualizirati. Radioaktivni fosfat ili enzim čvrsto vezan na sekundarno protutijelo koristi se kao oznaka. Vezanje prvo na primarna, a potom i na sekundarna antitijela ima dvije svrhe: standardizaciju metode i poboljšanje rezultata.
Tretman otopinom primarnih protutijela do vezivanja dolazi na mjestu ploče gdje se nalazi antigen (željeni protein).
Uklanjanje nevezanih protutijela (ispiranje).
Tretman otopinom obilježenih sekundarnih antitijela za kasniji razvoj.
Uklanjanje nevezanih sekundarnih protutijela (ispiranje).
Riža. 2.4. Imunoelektroforeza (Western blot)
Ako je željeni protein prisutan u biološkom materijalu, na ploči se pojavljuje traka koja ukazuje na vezanje tog proteina na odgovarajuća antitijela.
Naslov
2
2
Izolacija i pročišćavanje proteina provodi se u fazama.
1. Homogenizacija- to je pažljivo mljevenje predmeta biokemijskih istraživanja do homogenog, odnosno homogenog stanja, odnosno proteini se podvrgavaju temeljitoj dezintegraciji sve do razaranja stanične stijenke.
U ovom slučaju koriste se:
A) Homogenizatori s noževima Warring tipa;
b) Potter-Elweheim homogenizatori s tučkom;
V) mlinovi s kuglicama i valjcima - za gušće predmete;
G) metoda naizmjeničnog smrzavanja i odmrzavanja, u kojoj dolazi do pucanja stanične stijenke pod utjecajem ledenih kristala;
d) metoda "dušikove bombe" - pod visokim pritiskom, stanice su zasićene dušikom, zatim se pritisak naglo oslobađa, oslobađa se plin dušik, koji kao da eksplodira stanicu iznutra;
e) Ultrazvuk, razne press metode, probava staničnih stijenki enzimima. U većini slučajeva homogenizacijom se stvara toplina, a mnogi proteini mogu biti inaktivirani, pa se svi postupci provode u rashladnim prostorijama na t 0 ili se sirovine hlade ledom. Istodobno se pažljivo kontrolira volumen i vrijeme razaranja stanica te radni tlak. Idealan homogenizat je onaj koji se može podvrgnuti daljnjoj ekstrakciji.
2. Ekstrakcija proteina, odnosno njihov prijenos u otopljeno stanje; Najčešće se ekstrakcija provodi zajedno s mljevenjem u isto vrijeme.
Ekstrakcija se provodi:
A) otapanje u 8-10% otopinama soli;
b) pomoću puferskih otopina s pH od kiselog do blago alkalnog (boratni, fosfatni, citratni, tris pufer: mješavina trisaminometana s NH2 – CH3 + HCl;
V) taloženje proteina organskim otapalima (etanol, metanol, butanol, aceton i njihove kombinacije), pri čemu dolazi do razgradnje proteinsko-lipidne i proteinsko-proteinske komponente, odnosno do destrukcije BSP.
3. Pročišćavanje i frakcioniranje proteina. Nakon ekstrakcije smjesa se odvaja ili frakcionira na pojedinačne proteine i njihovo daljnje pročišćavanje:
a) soljenje je proces taloženja proteina neutralnim otopinama soli alkalijskih i zemnoalkalijskih metala.
Mehanizam za soljenje– dodani anioni i kationi uništavaju hidratizirani proteinski omotač proteina, koji je jedan od faktora stabilnosti proteinskih otopina. Najčešće korištene otopine su Na i amonijev sulfat. Mnogi se proteini razlikuju po veličini svoje hidratacijske ljuske i količini naboja koju imaju. Svaki protein ima svoju zonu za soljenje. Nakon uklanjanja agensa za soljenje, protein zadržava svoju biološku aktivnost i fizikalno-kemijska svojstva. U kliničkoj praksi se metoda isoljavanja koristi za odvajanje globulina (talog nastaje kada se doda 50% otopina amonijevog sulfata (NH 4)2SO 4) i albumina (talog nastaje kada se doda 100% otopina amonijevog sulfata ( doda se NH4)2SO4).
Na količinu soljenja utječu:
1) prirodu i koncentraciju soli;
2) pH okoline;
3) temperatura.
Glavnu ulogu ima valencija iona. Stoga se učinak soli procjenjuje ionskom jakošću otopine μ:
, odnosno ionska jakost otopine (μ) jednaka je umnošku ½ koncentracije svakog iona (C) s kvadratom njegove valencije (V).
Kohnova metoda je varijanta soljenja. Istodobno dolazi do ekstrakcije i taloženja komponenti. Uzastopnom promjenom temperature (obično niske t o –0+8 o C), pH otopine i koncentriranog etanola, iz krvne plazme se uzastopno izdvaja do 18 proteinskih frakcija.
Kohnova metoda koristi se u farmaceutskoj proizvodnji za proizvodnju krvnih nadomjestaka;
b) metode kromatografije. Utemeljiteljem razvoja kromatografskih metoda analize smatra se ruski znanstvenik Mihail Cvet (1903.). Trenutno postoje mnoge njegove sorte. Metoda se temelji na sposobnosti tvari da se specifično adsorbiraju na adsorbensu zatvorenom u koloni ili postavljenom na bilo koji nosač. U ovom slučaju, analizirane tvari se odvajaju i koncentriraju u strogo definiranom sloju adsorbensa. Zatim se kroz kolonu propuštaju odgovarajući eluenti (otapala) koji slabe adsorpcijske sile i ispiru adsorbirane tvari iz kolone. Tvari se skupljaju u kolektor frakcija.
Temeljno u kromatografiji je koeficijent distribucije, što je jednako omjeru koncentracije tvari u mobilna faza na koncentraciju tvari u stacionarna faza(ili stacionarna faza).
Stacionarna faza– može biti kruto ili tekuće ili mješavina krutog i tekućeg.
Mobilna faza- tekući ili plinoviti, teče duž ili prolazi kroz stacionarnu.
Ovisno o vrsti stacionarne i mobilne faze, postoje različite modifikacije kromatografske analize.
Adsorpcija– temelji se na različitim stupnjevima adsorpcije proteina adsorbensom i njihovoj topivosti u odgovarajućem otapalu.
Korišteni adsorbenti su silicijeva kiselina, Al 2 O 3, CaCO 3, MgO, drveni ugljen. Adsorbent u obliku suspenzije s otapalom (obično puferskom otopinom) pakiran je u kolonu (staklenu okomitu cijev). Uzorak se nanosi na kolonu, zatim se kroz nju propušta otapalo ili mješavina otapala.
Razdvajanje se temelji na činjenici da tvari s višom raspodjelom K. (B), kretati se duž kolone većom brzinom. Frakcije se prikupljaju pomoću kolektora frakcija.
Razdjelna kromatografija– temelji se na raspodjeli smjese proteina između dvije tekuće faze. Razdvajanje se može odvijati na posebnom kromatografskom papiru, kao iu kolonama, poput adsorpcijskih. Čvrsta faza u ovom slučaju služi samo kao potpora tekućoj stacionarnoj fazi. Kromatografski papir ima svojstvo zadržavanja vode između svojih celuloznih vlakana. Ova voda je stacionarna faza. Kada se nevodeno otapalo (mobilna faza) kreće kroz papir pod djelovanjem kapilarnih sila, molekule tvari nataložene na papiru se raspoređuju između dviju faza u skladu s njihovim koeficijentom raspodjele. Što je veća topljivost tvari u mobilnoj fazi, to će se dalje kretati duž papira zajedno s otapalom.
Kod distribucijske kromatografije na koloni nosioci su celuloza, škrob, silikagel i dr., stacionarna faza je voda. Kada se nanese na stupac, tvari u smjesi kreću se duž stupca s različitim brzinama uzimajući u obzir Kraspr.
Rf za svaku vezu pod standardnim uvjetima je konstantna vrijednost.
Kromatografija ionske izmjene temelji se na privlačenju suprotno nabijenih čestica. Za to se koriste različite smole ionske izmjene: smole kationske izmjene - sadrže negativno nabijene skupine - sulfonirani stiren i CMC, koji privlače pozitivno nabijene ione ispitivanih tvari. Također se nazivaju kiseli ionski izmjenjivači.
Anionske izmjenjivačke smole ili osnovni ionski izmjenjivači sadrže pozitivno nabijene skupine koje privlače negativno nabijene proteinske molekule
Trimetilaminostiren je derivat stirena i celuloze.
Ovisno o q proteina koji se izdvajaju, koriste se odgovarajući ionski izmjenjivači s kojima pojedini proteini stupaju u interakciju, dok drugi slobodno izlaze iz kolone. Proteini "precipitirani" na koloni uklanjaju se korištenjem koncentriranijih otopina soli ili promjenom pH vrijednosti eluensa.
Afinitetna kromatografija (ili afinitetna kromatografija) temelji se na principu selektivne interakcije proteina ili drugih makromolekula sa specifičnim tvarima imobiliziranim na nosačima - ligandima (to može biti koenzim ako se izolira enzim, protutijelo, antigen i sl. Zbog visoka specifičnost proteina, veže se na imobilizirane ligande samo se jedan protein iz smjese ispire puferskim smjesama s promijenjenim pH ili promijenjenom ionskom jakošću.
Prednost je mogućnost izolacije određene tvari u jednom koraku visok stupanjčistoća.
Metoda gel filtracije ili metoda molekularnog sita vrsta je permeacijske kromatografije.
Razdvajanje molekula po veličini i obliku temelji se na svojstvima molekularnog sita koje imaju mnogi porozni materijali, poput organskih polimera, koji imaju trodimenzionalnu mrežnu strukturu koja im daje svojstva gela. Gel filtracija je odvajanje tvari pomoću gelova na temelju razlika u veličini molekula (Sepharose, Sephadex, Sephacryl, biogelovi itd.). Pod utjecajem epiklorohidrina, polisaharidni lanci dekstrana (sintetizirani od strane mikroorganizama) umreženi su u mrežnu strukturu, postaju netopljivi u vodi, ali zadržavaju visok afinitet prema njoj. Zbog ove hidrofilnosti, dobivena zrnca (zvana Sephadex) jako bubre stvarajući gel koji ispunjava stupac. Metoda se temelji na činjenici da velike molekule ne prodiru u unutarnju vodenu fazu, a manje molekule prvo prodiru u pore “sita”, kao da su zaglavljene u njima, te se stoga kreću manjom brzinom. Prema tome, proteini s većim Mr prvi dolaze do prijemnika. Nedavno se porozne staklene granule sve više koriste kao molekularna sita u penetrirajućoj kromatografiji.
Elektroforetska metoda u biokemiji temelji se na razlici u brzini gibanja molekula u električnom polju (aminokiseline, peptidi, proteini, nukleinske kiseline).
Razlika u brzini ovisi o:
1. od q molekule: što je veći ukupni q, to je veća pokretljivost molekula. Vrijednost q ovisi o pH;
2. na veličinu molekula: što su molekule veće, njihova pokretljivost je manja. To je zbog povećanja sila trenja i elektrostatskih interakcija velikih molekula s okoliš;
3. na oblik molekula: molekule iste veličine, ali različitih oblika, na primjer, proteinske fibrile i globule imaju različite brzine. To je zbog razlika u silama trenja i elektrostatskom međudjelovanju.
Vrste elektroforeze
a) Izoelektrično fokusiranje. Razdvajanje se događa na okomitom stupcu u stupnjevima. i pH i napon. Uz pomoć posebnih nosača amfolita tuča se uspostavlja u stupcu. pH od 0 do 14. Smjesa tvari se stavi u kolonu, te se priključi električna struja. Svaka od komponenti kreće se u onaj dio kolone gdje pH vrijednost odgovara njezinoj izoelektričnoj točki i tu se zaustavlja, odnosno fokusira.
Prednost: odvajanje, pročišćavanje i identifikacija proteina odvija se u jednom koraku. Metoda ima visoku rezoluciju (0,02 pI).
b) Izotakoforeza je elektroforeza na podlozi. Nakon uključivanja električne struje, ioni s najvećom pokretljivošću prvi se kreću prema odgovarajućoj elektrodi, oni s najmanjom pokretljivošću su posljednji, a oni s srednjom pokretljivošću nalaze se u sredini.
c) Disk elektroforeza - uređaj se sastoji od dvije posude s puferom - gornje i donje, spojene okomitim cjevčicama u kojima se nalazi višeporozni gel. Kako se ionizirane čestice gibaju pod utjecajem električne struje. Veća poroznost je u gornjem dijelu gela.
d) Imunoelektroforeza - metoda koja kombinira elektroforezu s imunodifuzijom (za dokazivanje antigena u složenim fiziološkim smjesama). Mješavina antigena i mješavina antitijela postavljaju se okomito jedna na drugu na poseban nosač. Kada se uključi električna struja, one se razdvajaju u pojedinačne tvari i difundiraju na nosač gela. Na mjestu gdje se antigen susreće s odgovarajućim antitijelom dolazi do specifične reakcije taloženja u obliku luka. Broj formiranih lukova odgovara broju antigena.
Metode određivanja Mr proteina
Veliki broj proteina kemijski sastav a sekvenca aminokiselina nije utvrđena (1010–1012 proteina) pa se za takve proteine određuje Mr. U ovom slučaju koriste se različite metode.
a) Metoda sedimentacije - određivanje Mr provodi se u posebnim centrifugama (prvu centrifugu predložio je švedski biokemičar Svedberg), u kojima je moguće stvoriti centrifugalno ubrzanje koje je 200 tisuća ili više puta veće od ubrzanja gravitacije. Mr se određuje V sedimentacijom molekula. Kako se molekule kreću od središta prema periferiji, formira se oštra granica protein-otapalo. Brzina sedimentacije izražava se kroz konstantu sedimentacije (S):
gdje je V brzina kretanja granice protein-otapalo (cm/s);
– kutna brzina rotor (rad/s);
– udaljenost od središta rotora do sredine ćelije s otopinom proteina (cm).
Vrijednost konstante sedimentacije S, koja je jednaka 110–13 C, konvencionalno se uzima kao 1 i naziva se 1 Svedberg (S). S za proteine kreće se od 1-50 S, ponekad i do 100 S.
Mr proteina određuje se Svedbergovom jednadžbom:
gdje je R univerzalna plinska konstanta;
T – apsolutna temperatura u Kelvinima;
S – konstanta sedimentacije;
D – koeficijent difuzije;
– gustoća otapala;
V – parcijalni specifični volumen plina.
Ova metoda je skupa zbog opreme koja se koristi.
Jednostavnije i jeftinije:
b) Gel filtracija u tankom sloju Sephadexa.
Duljina puta proteina (u mm) je logaritamska funkcija Mr.
X – Mr željenog proteina na kalibracijskom grafikonu.
c) Disk elektroforeza u sloju poliakrilamida - također postoji odnos između logaritma Mr kalibracijskih proteina i njihove duljine puta.
Metode određivanja homogenosti proteina
Čistoća izoliranog proteina određena je:
- ultracentrifugiranje;
- metoda disk elektroforeze;
- razne imunokemijske metode;
- određivanje topljivosti proteina (Northropova metoda) temelji se na faznom pravilu, prema kojem topljivost čiste tvari u danim eksperimentalnim uvjetima ovisi samo o temperaturi, ali ne ovisi o koncentraciji tvari u čvrstoj fazi.
Ako je protein homogen, tada se na grafu vidi jedan zavoj (a), ako ima proteinskih nečistoća (b, c), tada se dobiva nekoliko zavoja krivulje zasićenja. Svi proteini imaju svoje individualne krivulje topljivosti.
Pokrivena pitanja:Metode izolacije organela i membrana iz tkiva i stanica.
Faze subcelularne frakcioniranja: ekstrakcija,
homogenizacija i centrifugiranje, njihove značajke.
Metode odvajanja i pročišćavanja substaničnih komponenti.
Izolacija membranskih čestica.
Identifikacija membranskih frakcija, kriteriji za njihovo pročišćavanje.
Praćenje prisutnosti nečistoća pomoću svjetla i
elektronska mikroskopija, analiza sastava lipida odn
određivanje aktivnosti enzima markera.
Određivanje sastava proteina u izoliranim membranama
frakcije. Određivanje enzimske aktivnosti markera
određena vrsta izolirane frakcije membrane. Dobivanje pojedinih staničnih komponenti omogućuje proučavanje
njihove biokemijske i funkcionalne karakteristike. Na primjer, možete stvoriti
sustav bez stanica za ribosome koji će sintetizirati protein
prema glasničkoj RNK koju je odredio eksperimentator. Odabran
Mitohondriji pod odabranim uvjetima mogu izvršiti sintezu ATP-a, pri
izolirani kromatin uz sudjelovanje odgovarajućih enzima može
Dolazi do sinteze RNA, itd.
Nedavno su se za rekreaciju koristili sustavi bez stanica
stanične supramolekularne strukture. Dakle, koristeći pročišćeni
granule žumanjka, ekstrakti citoplazme jaja vodozemaca ili morskih jaja
hedgehogs, možete dobiti jezgre s nuklearnom ovojnicom od one uvedene u ovo
bezstanični sustav strane DNA (na primjer, DNA bakteriofaga).
Takva se DNK veže za proteine gastona, kojih ima u izobilju
u takvom ekstraktu nastaje kromatin (dezoksiribonukleoprotein),
koji je prekriven dvostrukom membranskom ljuskom, noseći čak
nuklearne pore. Takvi sustavi modela pomažu u proučavanju suptilnih,
intimni procesi, na primjer transport makromolekula iz citoplazme u
jezgra, i obrnuto. U citoplazmatskim ekstraktima jaja vodozemaca i
Kod bodljikaša se takve jezgre mogu povremeno dijeliti mitozom. ove
modeli su dali ogroman doprinos dešifriranju prirode regulacije
staničnog ciklusa. Za izolaciju staničnih organela,
ispitni uzorak se usitnjava i
zatim homogenizira u puferiranom mediju sa
koristeći Potter-Elvegem homogenizator
(Teflonski tučak koji se okreće u staklu
cilindar). Ovo je relativno nježna metoda koja
posebno poželjno za izdvajanje labilnih
molekule i ultrastrukture. Druge tehnike uništavanja
stanice uključuju enzimsku lizu koja uništava
stanične stijenke ili mehaničko uništenje
smrznuto tkivo (mljevenjem ili korištenjem
rotirajući noževi; pod velikim pritiskom;
osmotski šok; višestruka izmjena
smrzavanje i otapanje). Za izolaciju intaktnih organela važno je da okolina u kojoj
provedena homogenizacija, bila je izotonična, tj.
osmotski tlak pufera mora odgovarati tlaku
unutar ćelije. Ako je otopina hipotonična, organele će
"upiti" dodatnu vodu i prsnuti, a u
U hipertoničnim otopinama, naprotiv, smanjuju se.
Nakon homogenizacije slijedi filtracija za uklanjanje
netaknute stanice i vezivna tkiva. Zapravo
frakcioniranje staničnih organela provodi se pomoću
diferencijalno centrifugiranje, tj. centrifugiranje
pri različitim brzinama rotora. U isto vrijeme, korak po korak
povećanje centrifugalne sile (koja je obično izražena
višekratnik normalnog ubrzanja slobodan pad g
= 9,81 m/s2) dovodi do sekvencijalnog taloženja raznih
organele, tj. njihova podjela prema gustoći i
veličina. Jedan od glavnih načina izolacije staničnih struktura je
diferencijalno (separacijsko) centrifugiranje. Njegov princip
primjene je da vrijeme taloženja čestica u homogenatu ovisi o njihovoj
veličina i gustoća: što je čestica veća ili teža, to je brža
taložit će se na dno epruvete. Da biste ubrzali proces taloženja, mijenjajte
ubrzanja koja stvara centrifuga.
Tijekom centrifugiranja prvo će se taložiti jezgre i to pri malim ubrzanjima.
i nerazorenih stanica, na 15-30 tisuća g velike čestice će se taložiti,
makrosomi koji se sastoje od mitohondrija, malih plastida, peroksisoma,
lizosoma itd., na 50 tisuća g mikrosoma, fragmenata vakuola
stanični sustavi.
Pri ponovljenom frakcijskom centrifugiranju ovih miješanih podfrakcija
mogu se dobiti čiste frakcije. Dakle, pri diobi makrosomalnog
podfrakcije se dobivaju zasebno: mitohondriji, lizosomi i peroksisomi. Na
odvajanjem mikrosoma moguće je dobiti frakciju membrana Golgijevog aparata,
fragmenti plazma membrane, vakuole, granularni retikulum. U
u slučajevima finijeg odvajanja frakcija koristi se centrifugiranje
gradijent gustoće saharoze, koji omogućuje dobro odvajanje komponenti,
čak se malo razlikuju jedni od drugih u specifičnoj težini. Izolacija staničnih organela obično se provodi na niskim
temperature (0-5°C) kako bi se smanjio stupanj
degradacija materijala uslijed kataliziranih reakcija
enzimi; potonji se oslobađaju tijekom procesa uništenja
tkanine. Dodavanje tiola i kelatnih sredstava je neophodno za
zaštita funkcionalnih SH skupina od oksidacije.
Prije nego što se izolirane frakcije analiziraju biokemijski
metode, potrebno je provjeriti njihovu čistoću pomoću
elektronski mikroskop.
Dobivanje pojedinačnih staničnih komponenti omogućuje
proučavati njihove biokemijske i funkcionalne značajke. Dakle, moguće je
stvoriti sustav bez stanica za ribosome koji će
sintetizirati protein kako je odredio eksperimentator
messenger RNA. Izolirani mitohondriji u odabranim
uvjetima može izvesti sintezu ATP-a na izoliranom kromatinu
uz sudjelovanje odgovarajućih enzima može doći do
sinteza RNA itd. Osnove metode centrifugiranja
Čestice u otopini se talože (sedimentacija),
kada im je gustoća veća od gustoće otopine, odn
plutaju (flotacija) kada im je gustoća manja
gustoća otopine. Što je veća razlika u
gustoće, brže dolazi do raspodjele čestica.
Kada su gustoće čestica i otopine iste
(izopiknički uvjeti), čestice ostaju
nepomična. Za male razlike u gustoći
čestice se mogu odvojiti samo u centrifugi,
što mnogo puta stvara centrifugalnu silu
prekoračenje sile gravitacije. odnos između gustoće i koeficijenta taloženja za
razne čestice u otopini cezijevog klorida (CsCI). Brzina sedimentacije čestica (ν) ovisi o kutu
brzina (ω), efektivni radijus rotora reff (udaljenost od
os rotacije) i sedimentacijska svojstva čestica.
Sedimentacijska svojstva čestice
karakteriziran koeficijentom taloženja S i
izraženo u Svedbergovim jedinicama (1S = 10-13s).
Vrijednost S može jako varirati. Za
usporedba koeficijenata sedimentacije u različitim medijima
obično se prilagođavaju gustoći i viskoznosti vode kada
20oC (S20w).
Koeficijent sedimentacije ovisi o molekulskoj masi
(M) čestice, njihovi oblici (koeficijent trenja f),
parcijalni specifični volumen ΰ (vrijednost, recipročna
gustoća čestica).
Centrifugiranje s gradijentom gustoće
Makromolekule ili organele koje malo variraju u veličini ili gustoći
mogu se odvojiti centrifugiranjem u gradijentu gustoće. Za ove svrhe, dva
metoda.
U zonskom centrifugiranju, uzorak koji se analizira (na primjer, proteini ili stanice)
naslaganih u tankom sloju na pufersku otopinu. Tijekom procesa centrifugiranja čestice
prolaze kroz otopinu, jer je njihova gustoća veća od gustoće otopine. Brzina putovanja
ovisi o masi i obliku čestica (vidi formule na dijagramu A). Centrifugiranje se zaustavlja
prije nego što čestice dospiju na dno centrifugalne cijevi. Zatim se probuši dno i
skuplja se niz frakcija koje sadrže različite čestice. Stabilnost gradijenta gustoće u
proces centrifugiranja postiže se upotrebom otopina ugljikohidrata ili koloida
silika gel čija koncentracija raste od površine prema dnu epruvete. Gradijent gustoće
sprječava stvaranje konvekcijskih struja koje smanjuju kvalitetu odvajanja.
Kod izopikničkog centrifugiranja uzorak (kao što je DNA, RNA ili virusi) je ravnomjerno
raspoređen po cijelom volumenu otopine (obično CsCI). U ovom slučaju podjela se nastavlja
značajno duže nego kod zonskog centrifugiranja. Gradijent gustoće se stvara u
proces centrifugiranja zbog sedimentacije i difuzije. S vremenom svaka čestica
pada u područje koje odgovara njegovoj vlastitoj gustoći uzgona. Centrifugiranje
zaustaviti kada se uspostavi ravnoteža. Rezultirajuće frakcije su analizirane pomoću
odgovarajuću mjernu tehnologiju. Molekule markera
Tijekom procesa frakcioniranja važno je
kontrolirati čistoću frakcija. Prisutnost
u određenoj frakciji jednog ili drugog
organele i prisutnost drugih komponenti
određuje pomoću molekula markera.
Oni su obično specifični za organele
enzimi (marker enzimi).
Raspodjela enzima markera u stanici
odražava lokalizaciju u njemu
odgovarajuće katalitičke reakcije. Funkcije i sastav biomembrana
Najvažnije membrane u životinjskim stanicama
su plazma membrana, unutarnja i
vanjska nuklearna membrana, opna
endoplazmatski retikulum i Golgijev aparat
, unutarnje i vanjske mitohondrije
membrane. Lizosomi, peroksisomi, razni
vezikule su također odvojene od citoplazme membranama
. Biljne stanice sadrže dodatne membrane
kloroplasti, leukoplasti i vakuole. svi
membrane su polarne, tj. postoji razlika u
kompozicije unutarnje i vanjske u odnosu na
slojeva citoplazme. Biomembrane i njihove komponente obavljaju sljedeće funkcije:
1. Restrikcija i izolacija stanica i organela. Odvajanje stanica od međustaničnog
okruženje osigurava plazma membrana koja štiti stanice od
mehanički i kemijski utjecaji. Plazma membrana osigurava
također održavajući razliku u koncentracijama metabolita i anorganskih iona između
unutarstaničnom i vanjskom okruženju.
2. Kontrolirani transport metabolita i iona određuje unutarnji okoliš, koji
neophodan za homeostazu, tj. održavanje stalne koncentracije metabolita i
anorganski ioni i drugi fiziološki parametri. Podesivi i
selektivni transport metabolita i anorganskih iona kroz pore i
kroz nosače postaje moguća zbog odvajanja stanica i
organele pomoću membranskih sustava.
3. Percepcija izvanstaničnih signala i njihov prijenos u stanicu, te inicijacija
signale.
4. Enzimska kataliza. U membranama na granici između lipidne i vodene faze
enzimi su lokalizirani. Tu dolazi do reakcija s nepolarnim tvarima
podloge. Primjeri uključuju biosintezu lipida i metabolizam nepolarnih lipida
ksenobiotici. Najvažnije energetske reakcije su lokalizirane u membranama
metabolizam, poput oksidativne fosforilacije (respiracijski lanac) i fotosinteze.
5. Kontaktna interakcija s međustaničnim matriksom i interakcija s drugima
stanica tijekom spajanja stanica i stvaranja tkiva.
6. Učvršćivanje citoskeleta, osiguravajući održavanje oblika stanica i organela
i pokretljivost stanica. Nakon homogenizacije uzorka, centrifugiranje homogenata sa
odvojene frakcije koje sadrže
stanične jezgre, mitohondrije i druge organele, kao i
supernatant tekućina koja sadrži topljive tvari
proteini staničnog citosola.
Ekstrakcija i razgradnja proteina povezana s membranom
oligomerne proteine u protomere
Ako je željeni protein čvrsto vezan za bilo koje strukture
stanica, mora se prenijeti u otopinu.
Razbiti hidrofobne interakcije između proteina
i membranskih lipida u otopinu se dodaju deterdženti: Češće
Koristi se Triton X-100 ili natrijev dodecil sulfat.
Kada su izloženi deterdžentima, hidrofobna svojstva obično se uništavaju.
interakcije između protomera u oligomernim proteinima Uklanjanje neproteinskih tvari iz otopine
Nukleinske kiseline, lipidi i drugi
neproteinske tvari mogu se ukloniti iz otopine pomoću njihovih posebnih fizikalno-kemijskih
Svojstva. Dakle, lipidi su laki
se brišu
iz
riješenje
dodajući
organski
otapala,
Na primjer
aceton. Međutim, utjecaj bi trebao biti
kratkoročni. budući da aceton uzrokuje
denaturacija nekih proteina. Nukleinska
kiseline se talože dodavanjem u otopinu
streptomicin. Izolacija membranskih lipida provodi se odmah nakon dobivanja membrane
frakcija koja mora biti zaštićena od djelovanja proteo- i lipolitika
enzimi, autooksidacija.
Tipično, svi postupci se provode na niskim temperaturama, održavajući određene
vrijednosti pH i ionske jakosti. Za ekstrakciju lipida, smjesa kloroform-
metanol Za istovremenu ekstrakciju proteina i lipida iz sjena crvenih krvnih stanica
ekstrahiran mješavinom butanola i vode. U ovom slučaju, većina proteina se prenosi na
vodeni, a lipid u butanolni sloj.
Provodi se kvantitativna analiza složenih smjesa fosfolipida
kromatografske metode. Uglavnom se koristi u medicinske svrhe
kolonska kromatografija. Uspješan za mikroanalitičke studije
Za odvajanje se koristi tankoslojna kromatografija
gotovo sve klase lipida, lokalizirati ih i identificirati kada
pomoću posebnih reagensa.
Prema sposobnosti eluiranja, otapala su raspoređena sljedećim redoslijedom:
uzlaznim redoslijedom petrol eter, cikloheksan, ugljikov tetraklorid,
toluen, benzen, kloroform, dietil eter, etil acetat, aceton, n-propanol,
etanol, metanol, voda. Nakon prolaska kroz otapala, ploča se suši
zraka i identificirati lipide pomoću specifičnog bojenja
reagensi. Za kvantitativno određivanje fosfolipida odvojenih
tankoslojnom kromatografijom, spektrofotometrijskim metodama. Istraživanje membrana je velikim dijelom
temelje se barem na dva glavna
metodološke tehnike: ovo je rastavljanje
nativna (tj. prirodna) membrana na
njegovi sastavni elementi i naknadni
puna ili djelomična montaža umjetnih
membrane koristeći sve ili
dijelovi originalnih komponenti membrane.
Primijenjeno na membrane, ove tehnike
naziva "solubilizacija" i
"rekonstrukcija". Za solubilizaciju je bolje koristiti deterdžente sa
nizak CMC, jer su takvi deterdženti lakši
ugrađuju se u membranu i uzrokuju je brže
razgradnja u miješane micele. U ovom svojstvu
ionski deterdženti su najučinkovitiji.
Kao parametri koji karakteriziraju sposobnost
deterdženti do micelizacije, obično
koristiti kritičnu koncentraciju
formiranje micela (MCM) i agregacijski broj. KKM –
ovo je koncentracija pri kojoj deterdžent počinje
tvore micele. Prije toga je u vodi
u monomernom obliku u pravom stanju
riješenje. Zbirni broj pokazuje koliko
molekula deterdženta po micelu. Postoje četiri glavne metode uklanjanja koje se najčešće koriste
deterdžent: dijaliza, gel filtracija, visoko razrjeđenje
solubilizat i adsorpcija deterdženta na hidrofobnim polimerima.
Brža metoda temelji se na uklanjanju deterdženta pomoću
gel filtracija, kada se solubilizat propusti kroz inert
gel čija je veličina pora dovoljno velika da drži
molekule deterdženta, ali male u usporedbi s onima koje nastaju
čestice membrane koje slobodno prolaze između
gel granule.
Deterdžent se može potpuno ukloniti s membrane
svojom adsorpcijom na hidrofobne polimere. Ova metoda
posebno dobro za uklanjanje ostataka deterdženta s
već formirane čestice membrane. Međutim, za uklanjanje
deterdžent iz početnog solubilizata, malo je koristan, budući da je
Tijekom početnih faza rekonstrukcije, uklanjanje deterdženta može
praćeno adsorpcijom značajnih količina proteina i lipida
na polimeru. Stoga se ova metoda obično koristi u kombinaciji s
drugim sredstvima u završnoj fazi uklanjanja deterdženta.
visok kapacitet skladištenja, koji jamči njihovo aktivno biološko podrijetlo.
KNJIŽEVNOST
1. Klychkova G.Yu. Razvoj tehnologije za složeni pripravak iz hrskavičnog tkiva lignje, lososa i jesetre // Materijali cijele Rusije. Internet konf. mladi znanstvenici. - Vladivostok: TIN-RO-Centar, 2004. - P. 164-170.
2. Metzler D. Biokemija. T. 2. - M., 1980. - 605 str.
3. Sukhoverkhova G.Yu. Biokemijske karakteristike hrskavičnog tkiva hidrobionata i tehnologija dodataka prehrani: Dis. ...kand. tehn. Sci. - Vladivostok, 2006. - 157 str.
4. Sytova M.V. Znanstveno utemeljenje složene prerade ribe amurske jesetre: autorski sažetak. dis. ...kand. tehn. znanosti
M.: VNIRO, 2005. - 24 str.
Zavod za prehrambenu biotehnologiju
Primljeno 07.02.07
IDENTIFIKACIJA PROTEINSKIH KOMPONENTI KERA THIN ENZIMSKOG HIDROLIZATA
Ch.Yu. SHAMKHANOV, L.V. ANTIPOVA
Grozni Državni naftni institut Voronješka državna tehnološka akademija
Jedan od naj učinkovite načine obrada sekundarnih sirovina industrije mesa i peradi je korištenje suvremenih biotehnoloških metoda za dobivanje prehrambenih hidrolizata. Funkcionalna i tehnološka svojstva dobivenih proizvoda ovise o biokemijskom sastavu i molekularnoj masi njegovih proteinskih komponenti.
Korištenje fizikalne i kemijske metode za određivanje molekularne težine proteina, rezultat ne ovisi samo o masi, već io električno punjenje i oblik proteinske molekule, posebno kada se mijenja brzina difuzije proteina, brzina taloženja u gravitacijskom polju. S tim u vezi, prilikom utvrđivanja molekularne težine Za proteine je poželjno koristiti statističke metode kada je otopina proteina u stanju ravnoteže, na primjer, kada prolazi kroz kolonu napunjenu gelom.
Svrha rada je odrediti molekulsku masu M proteinskih komponenti enzimskog hidrolizata keratina i njegov biokemijski sastav.
Za određivanje molekulske mase proteinskih komponenti hidrolizata keratina korištena je metoda gel filtracije. Korišten je Sephadex b-100 (prosjek, promjer čestica 40-120 µm) s granicama frakcioniranja od 4000-150000 Da.
Kolona 46,0 x 1,9 cm napunjena je Sefa-dexom tretiranim s 0,02 M univerzalnim puferom, pH 7,0. Na njega je naneseno 1,5 cm3 -7 mg/cm3 otopine keratin hidrolizata i isprano istim univerzalnim puferom brzinom od 12 cm3/h. Sakupljene su frakcije od 3 cm3 i potom je u njima spektrofotometrijski određen sadržaj proteina na SF-46 pri 280 nm. Kako bi se odredila molekularna težina frakcija keratin hidrolizata, Sephadex kolona je preliminarno kalibrirana pod istim uvjetima koristeći nekoliko čistih (markerskih) proteina s poznatim M. Kalibracijska krivulja je konstruirana pomoću linearnog odnosa između M i volumena
eluirati Ue koji izlazi iz kolone. U tablici Slika 1 prikazuje neke fizikalno-kemijske karakteristike proteina markera.
stol 1
Marker protein M, Da 1§ m V, cm3
Lizozim 13930 4,143 54
Tripsin 25700 4,409 48
Peroksidaza 34000 4,531 45
Goveđi albumin 68000 4,832 36
Plavi dekstran 2000000 6301 21
Frakcija topiva u vodi
keropeptid<10000 2,845 72
Vodotopljiva frakcija hidrolizata keratina napušta kolonu u značajno manjem volumenu od markera proteina lizozima s najnižom molekularnom težinom. Posljedično, u hidrolizatu keratina (keropeptid) nema proteinskih frakcija s M > 13930 Da. Procijenjena masa produkata hidrolize ispod je razine od 10 000 Da, određena gel filtracijom na marker proteinima Sephadex b-100. Linearna ovisnost između ^ M proteina i volumena eluata Ve oslobođenog iz kolone prikazano je na sl. 1 (1 - plavi dekstran; 2 - goveđi albumin; 3 - peroksidaza; 4 - tripsin; 5 - lizozim; 6 - frakcija keropeptida topiva u vodi).
Zbog nepostojanja proteina markera u proučavanom rasponu od 10000-5000 Da, traženje frakcije proteina topljive u vodi provedeno je pomoću poroznosti
tablica 2
M, Da Topljivi proteini i peptidi, mg/cm3 Ukupni peptidi i aminokiseline, μg/cm3 Tirozin, μmol/cm3 Reducirajuće tvari, μg/cm3
0-10000 5,64 7337 7,835 2815
0-5000 4,21 5278 5,960 2272
% od početnog 74,6 71,9 76,1 80,7
membrane marki UPM-100 i UAM-50 na laboratorijskoj jedinici za ultrafiltraciju (JSC NPO Tekhkon). Shema je uključivala samu instalaciju s 5% otopinom keropeptida, postavljenom na magnetsku mješalicu za njeno stalno miješanje. Kako bi se učinkovito odvojila otopina proteina, komprimirani zrak je doveden u gornji dio instalacije pod pritiskom.Produkti hidrolize su prolazili kroz porozne membrane, naizmjenično zamijenjene ovisno o željenoj molekularnoj težini ultrafiltrata, u donji dio instalacije i sakupljali se. u prihvatnom spremniku. U dobivenim ultrafiltratima određen je niz biokemijskih parametara koji su omogućili procjenu raspodjele produkata hidrolize po molekulskoj masi (Tablica 2).
Keropeptid sadrži proteine niske molekulske mase s M 5000-10000 Da. Njihov maseni udio procijenjen je kao razlika u očitanjima za frakcije 0-10000 i 0-5000 Da i iznosi 1,43 mg/cm3. Ova je frakcija također pozitivno reagirala na ninhidrinsku reakciju (2059 μg/cm3), tirozin (1,875 μmol/cm3) i redukcijske tvari (543 μg/cm3). Međutim, glavni udio produkata hidrolize koncentriran je u frakciji niže molekulske mase s M< 5000 Да, соответствующей по существующей классификации фракции пептидов. Массовая доля всех исследуемых показателей составляет более 7 0% от аналогичных значений во фракции 0-10000 Да.
Daljnje određivanje molekulske mase proteinskih frakcija keropeptida topivih u vodi provedeno je pomoću Sephadexa B-25 (prosjek, promjer čestice 50-150 μm), što omogućuje postavljanje unutar raspona frakcioniranja od 1000-5000 Da. Uvjeti gel filtracije ostali su nepromijenjeni. Po
Na temelju rezultata određivanja proteina u frakcijama konstruiran je elucijski profil. U svim je frakcijama, osim proteina, ninhidrinskom metodom određen sadržaj niskomolekularnih tvari, tirozina i reducirajućih tvari (RS), te je određena kvantitativna raspodjela proteinskih frakcija. Na sl. Slika 2 prikazuje gel kromatogram enzimatskog hidrolizata keratina kroz Sephadex B-25 (krivulja 1 - protein; 2 - ninhidrinski test; 3 - tirozin; 4 - PB).
U ovom slučaju, protein se detektira u obliku dva mala vrha gotovo u prvim frakcijama. Maseni udio proteina u frakcijama br. 1-8 od 3-24 cm3
ima dosta visoke vrijednosti i iznosi 0,12-0,18 mg/cm3 (krivulja 1).
Glavnina produkta izašla je iz kolone u obliku maksimalnog proteinskog pika s volumenom od 27 cm3 eluata (frakcija br. 9, po 3 cm3 eluata). Maseni udio proteina u ovoj frakciji zabilježen je na razini od 0,66 mg/cm3, što je 3-4 puta više nego u ostalim ispitivanim frakcijama.
Daljnjim eluiranjem keropeptida u rasponu volumena od 36-96 cm3 otkrivena su tri pika sa smanjenjem masenog udjela proteina za ne više od 0,08 mg/cm3. Kompletna otopina keropeptida je eluirana u konačnom volumenu od 96 cm3.
U frakciji br. 9 ukupna količina raspoložive radioaktivne tvari nalazi se u masenom udjelu od 66 μg/cm3 (krivulja 4). Ninhidrinska reakcija korištena je u gel kromatografiji za identifikaciju distribucije molekulske težine proizvoda hidrolize. Utvrđeno je da kada prekomjerna količina ninhidrina i proteinskih produkata stupi u interakciju sa slobodnom MH2 skupinom, ovisno o broju tih skupina, moguće je odrediti mjesto proteina
PB, µg/cm3 175 s G 5 o l s; ,7 0,
100 125 X - 3 kom. 0,5
80 § 100 2 _ n 0.4
60 1 isin, 7 riječi 0.3
40 1 l 5 o - (P 2 o I- 0,2
20 25 _ 2 ai O 0.1
6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 90 96 V, cm
derivata nakon eluiranja kroz Sephadex. Dakle, niski maseni udio ninhidrina (4-6 μg/cm3) vrlo točno odražava broj slobodnih amino skupina i određuje prisutnost visokomolekularnih peptida s M 3000-5000 Da u frakcijama J№ 1-8 (krivulja 2 ). Poznato je da u području mjerenja molekulske mase produkata hidrolize< 5000 Да входят только пептиды и аминокислоты. При больших концентрациях белка (фракция № 9) соответственно увеличивается окрашивание его свободных аминогрупп нингидрином -64 мкг/см3. Этот диапазон элюции характеризует наличие во фракциях № 8-12 среднемолекулярных пептидов с М 300-3000 Да. Определяемый с помощью маркерных белков по калибровочной кривой lg M керопептида 2,845 также указывает на его ориентировочную массу >700 Da. Daljnja analiza profila elucije pomoću uzorka ninhidrina (frakcije br. 12-36) otkrila je vrh koji nije odgovarao koncentraciji proteina, kao što je primijećeno za peptide u prethodnim frakcijama. Maseni udio tvari niske molekulske mase u frakciji br. 23 iznosio je 157 μg/cm3, što je više od 2 puta više od iste brojke za peptide u frakciji br. 9. Obrnuto proporcionalna ovisnost proteinskih indikatora i ninhidrinskog testa u frakcije br. 9 i 23 je indicirana kvalitativnom analizom na prisutnost produkata hidrolize u obliku slobodnih aminokiselina u zadnjoj frakciji. Njoj pripada i aminokiselina tirozin (0,06 µmol/cm3) što je još jedan dokaz navedenog stava.
Dakle, gel filtracija keratin hidrolizata kroz Sephadex G-100 i G-25 ukazuje na prisutnost otopine niske molekularne težine u njemu.
moj protein (< 10000 Да), составляющего 25% от его общего количества в гидролизате. Преобладающая часть белковых продуктов - 75% - представлена среднемолекулярными пептидами (300-3000 Да) с ориентировочной М >700 Da. U ovom slučaju proteinski lanci sadrže 5-20 aminokiselinskih ostataka. Važno je naglasiti da frakcija br. 9 istovremeno daje reakcije na biuretsku vezu, ninhidrin, tirozin i RV. Ova karakteristika sugerira prisutnost ugljikohidrata u proteinu keratina i njihovu izravnu povezanost s proteinom kao dijelom jedinstvenog kompleksa.
KNJIŽEVNOST
1. Antipova L.V., Pashchenko L.P., Shamkhanov Ch.Yu., Ku-rilova E.S. Priprema i svojstva prehrambenog keratinskog hidrolizata // Skladištenje i prerada poljoprivrednih sirovina. - 2003. - br. 7.
2. Antipova L.V., Shamkhanov Ch.Yu., Osminin O.S., Po-zhalova N.A. Biokemijske značajke procesa enzimatske hidrolize sirovina koje sadrže keratin u peradarskoj industriji Izv. sveučilišta Tehnologija hrane. - 2003. - br. 5-6.
3. Antipova L.V., Shamkhanov Ch.Yu., Osminin O.S. Ko -
unapređenje tehnologije za proizvodnju keropeptida iz pernatih sirovina // Mesna industrija. - 2004. - br. 3. - str. 44-47.
4. Rogov I.A., Antipova L.V., Dunchenko N.I., Zhereb-tsov N.A. Kemija hrane. U 2 knjige. Knjiga 1. Bjelančevine: struktura, funkcije, uloga u prehrani. - M.: Kolos, 2000. - 384 str.
5. Osterman L.A. Proteinska kromatografija i nukleinske kiseline. - M.: Nauka, 1985. - 536 str.
6. Kochetov G.A. Praktični vodič iz enzimologije. - 2. izdanje, revidirano. i dodatni - M.: Viši. škola, 1980. - 272 str.
Zavod za prehrambenu tehnologiju Zavod za tehnologiju mesa i mesnih proizvoda
Primljeno 0S.02.0? G.
TEORIJSKE OSNOVE MEHANIZMA KONZERVANTNOG DJELOVANJA KOMPONENTI EKSTRAKTA PUŠENJA
S.V. ZOLOTOKOPOVA, I.A. PALAGINA
Država Astrahan Tehničko sveučilište Astrahanski ogranak Saratovskog državnog društveno-ekonomskog sveučilišta
Važno područje istraživanja zadnjih godina je proučavanje učinka različitih prehrambenih aditiva ne samo na okus i miris, već i na produljenje roka trajanja prehrambenih proizvoda. Od davnina se za konzerviranje koriste začinsko bilje, kuhinjska sol, dimljenje i dr. Analize pokazuju da ekstrakti dima trenutno osvajaju tržište. Prehrambeni proizvodi s okusom dima posebno su popularni među stanovništvom, a tradicionalno dimljenje ustupa mjesto dimljenju bez dima.
Ekstrakti dobiveni u blagim uvjetima su ekološki korisni i obećavajući.
G.I. već desetljećima radi na poboljšanju tehnologije ekstrakcije. Kasyanov - počasni djelatnik znanosti i tehnologije Ruske Federacije, počasni izumitelj Ruske Federacije, doktor tehničkih znanosti, profesor, voditelj Odjela za tehnologiju mesnih i ribljih proizvoda države Kuban Tehnološko sveučilište. Znanstveno-pedagoška škola “Teorija i praksa prerade sirovina biljnog i životinjskog podrijetla ukapljenim i komprimiranim plinovima”, koja djeluje pri Državnom tehničkom sveučilištu Kuban i Krasnodarskom istraživačkom institutu za skladištenje i preradu poljoprivrednih proizvoda pod njegovim vodstvom, bavi se problemi povećanja učinkovitosti obrade različitih sirovina, omogućujući poboljšanje kvalitete proizvoda, smanjenje trajanja procesa obrade i istodobno smanjenje troškova energije.
Za identifikaciju proteina koriste se različiti sustavi pretraživanja u bazama podataka EMBL i Sequest, razvijeni unutar istraživačkih timova. Međutim, tražilica Mascot postala je standard za identifikaciju proteina. Kao i gotovo sve tražilice, koristi web sučelje, a sama tražilica je dostupna na internetu, ali se može kupiti i instalirati na računalo korisnika.
Mascot može raditi s raznim pluggable proteinskim i genomskim bazama podataka. To mogu biti opsežne javne baze podataka, kao što su NCBI ili SwissProt, komercijalne ili kreirane od strane korisnika.
U svim sustavima, identifikacija se provodi korištenjem masenih spektrometrijskih podataka dobivenih od strane istraživača, uspoređujući ih s poznatim proteinskim strukturama.
Uzimajući u obzir da se posljednjih desetljeća sekvencioniranje proteina u biti svelo na sekvencioniranje gena koji ih kodiraju, u praksi ima više smisla identificirati proteine usporedbom eksperimentalnih masenih spektrometrijskih podataka s poznatim genomima.
Postoje različiti algoritmi za identifikaciju proteina, ali su njihove mogućnosti ograničene trenutno poznatim genomima. Iako, s obzirom na to organizmi različiti tipovi Iako još uvijek imaju homologne proteine, često je moguće identificirati proteine iz organizama s nepoznatim genomom.
Različiti metodološki pristupi proteomskim studijama pružaju temeljne Različite vrste podataka, te zahtijevaju vlastite računalne pristupe prilikom obrade.
Najpristupačnija i najučinkovitija metoda je identifikacija specifične proteolitičke hidrolize pomoću masenih spektrometrijskih mapa peptida. U engleskoj literaturi poznat je kao Peptide Mass Fingerprint (PMF), a kao specifična proteaza najčešće se koristi tripsin. U prvoj fazi izolirani protein (na primjer, elektroforezom) prolazi proteolitičku hidrolizu. Kao rezultat ove hidrolize dobiva se smjesa peptida. S obzirom da se koristi visoko specifična proteaza, ovo će biti mješavina vrlo specifičnih peptida. Dakle, kada se koristi tripsin, protein će biti "izrezan" na arginin i lizin.
Sljedeća faza je snimanje masenog spektra dobivene smjese. Rezultat je skup ili popis molekulskih težina. Ne daje nikakve informacije o strukturi ili drugim svojstvima proizvoda; metoda se temelji samo na pretpostavci da su to molekularne težine peptida, a ti su peptidi nastali kao rezultat specifične hidrolize. Tu se krije glavna ideja pristupa - ako svaki protein ima svoj skup peptida i odgovarajući popis molekulskih masa, onda je sasvim moguće riješiti obrnuti problem - pronaći odgovarajući protein za rezultirajući popis molekulskih masa. A takav se problem doista često može riješiti.
Konkretno, to vam omogućuje stvaranje maskote.
