Курсова работа: Високоефективна течна хроматография на природни и отпадъчни води. Течна хроматография HPLC анализ хроматография

9885 0

HPLC е течна колонна хроматография, при която могат да се използват различни сорбционни механизми. По същество HPLC е съвременна форма на класическа течна колонна хроматография. По-долу са изброени някои от най-значимите качествени характеристики на HPFA:
- висока скорост на процеса, което позволи да се намали продължителността на разделяне от няколко часа и дни до минути;
- минималната степен на замъгляване на хроматографските зони, което прави възможно отделянето на съединения, които се различават малко по константите на сорбция;
- висока степен на механизация и автоматизация на разделянето и обработката на информацията, благодарение на което колонната течна хроматография достигна ново ниво на възпроизводимост и точност.

Интензивните изследвания през последните десетилетия, огромното количество натрупани експериментални данни позволяват днес да се говори за класификацията на вариантите в рамките на високоефективния метод на течна хроматография. Разбира се, в този случай класификацията според посочения по-горе сорбционен механизъм остава валидна.

Общата класификация се основава на сравнителната полярност на подвижната и неподвижната фаза. Прави се разлика между нормална и обратнофазова хроматография.

Нормалнофазовата хроматография (NPC) е вариант на HPLC, когато подвижната фаза е по-малко полярна от неподвижната фаза и има основание да се смята, че основният фактор, определящ задържането, е взаимодействието на сорбатите директно с повърхността или обема на сорбента .

Обратно-фазовата хроматография (RPC) е вариант на HPLC, когато подвижната фаза е по-полярна от стационарната, а задържането се определя чрез директен контакт на молекулите на сорбата с повърхността или обема на сорбента; в този случай йонизираните сорбати не се обменят с йони на подвижната фаза, адсорбирани на повърхността.

Йонообменна хроматография - вариант, при който сорбцията се извършва чрез обмен на сорбирани йони на подвижната фаза с йони на хроматографирани вещества; лиганд-обменната хроматография може да се определи по абсолютно същия начин.

Хроматографията върху динамично модифицирани сорбенти е вариант на HPLC, при който сорбатът не взаимодейства директно с повърхността на сорбента, а влиза във връзка с молекулите на близките до повърхността слоеве на елуента.
Йонно-двойната хроматография е вариант на хроматография с обратна фаза на йонизирани съединения, при която към подвижната фаза се добавя хидрофобен противойон, който качествено променя сорбционните характеристики на системата.

Хроматографията с изключване по размер е метод за разделяне на съединенията по техните молекулни тегла, базиран на разликата в скоростта на дифузия в порите на неподвижната фаза на молекули с различни размери.

За HPFA много важна характеристика е размерът на сорбентите, обикновено 3-5 µm, сега до 1,8 µm. Това дава възможност за бързо и пълно разделяне на сложни смеси от вещества (средното време за анализ е от 3 до 30 минути).

Задачата за разделяне се решава с помощта на хроматографска колона, която представлява епруветка, пълна със сорбент. По време на анализа течност (елуент) с определен състав се подава през хроматографска колона с постоянна скорост. Точно измерена доза от пробата се инжектира в този поток. Компонентите на пробата, въведени в хроматографската колона, поради различния си афинитет към сорбента на колоната, се движат по нея с различна скорост и достигат до детектора последователно в различно време.

По този начин хроматографската колона е отговорна за селективността и ефективността на разделяне на компонентите. Избирайки различни видове колони, можете да контролирате степента на разделяне на анализираните вещества. Съединенията се идентифицират по времето на задържане. Количественото определяне на всеки от компонентите се изчислява въз основа на величината на аналитичния сигнал, измерен с помощта на детектор, свързан към изхода на хроматографската колона.

Сорбенти. Развитието на HPLC до голяма степен е свързано със създаването на нови поколения сорбенти с добри кинетични свойства и различни термодинамични свойства. Основният материал за сорбенти при HPLC е силикагел. Той е механично здрав и има значителна порьозност, което дава голям обменен капацитет за малки размери на колоните. Най-често срещаният размер на частиците е 5-10 микрона. Колкото по-близо до сферичната форма на частиците, толкова по-ниско е съпротивлението на потока, толкова по-висока е ефективността, особено ако се отсея много тясна фракция (например 7 +1 микрона).

Специфичната повърхност на силикагела е 10-600 m/g. Силикагелът може да бъде модифициран с различни химични групи, присадени върху повърхността (C-18, CN, NH2, SO3H), което прави възможно използването на сорбенти на негова основа за разделяне на различни класове съединения. Основният недостатък на силикагела е неговата ниска химическа устойчивост при pH< 2 и рН >9 (силициев диоксид се разтваря в основи и киселини). Ето защо в момента се извършва интензивно търсене на сорбенти на базата на полимери, които са стабилни при pH от 1 до 14, например на базата на полиметилметакрилат, полистирол и др.

Сорбенти за йонообменна хроматография. Поради особеностите на разделяне (в киселинна или алкална среда) основният материал е сорбент към полистирол с дивинилбензол с различна степен на омрежване с присадени към повърхността им SO3 -H + групи (силно киселинни катионобменници) или -COO- Naf (слабокиселинни катиони), -H2N + (CH3) 3Cl- (анионообменници със силна основа) или -N+HR2Cl- (анионообменници със слаби основи).

Сорбенти за гел-проникваща хроматография. Основният тип е стирен-DVB. Използват се също макропорести стъкла, метилметакрилат, силикагел. За йонно-изключваща хроматография се използват същите сорбенти.
помпи. За осигуряване на потока на подвижната фаза (МФ) през колоната с посочените параметри се използват помпи за високо налягане. Най-важните спецификации за LC помпи са: обхват на потока; максимално работно налягане; възпроизводимост на потока; диапазон на пулсиране на подаването на разтворител.

По естеството на подаването на разтворител помпите могат да бъдат с постоянно захранване (поток) и постоянно налягане. По принцип в аналитичната работа се използва режим на постоянен поток, при пълнене на колони се използва режим на постоянно налягане. Според принципа на действие помпите са разделени на спринцовки и бутални бутални помпи.

спринцовъчни помпи. Помпите от този тип се характеризират с почти пълната липса на пулсации в потока на подвижната фаза по време на работа. Недостатъци на помпата: а) висока консумация на време и разтворител за промиване при смяна на разтворителя; б) спиране на сепарацията по време на пълнене на помпата; в) големи размери и тегло, като същевременно осигуряват висок дебит и налягане (имате нужда от мощен двигател и голяма сила на буталото с неговата голяма площ).

Бутални бутални помпи. Помпи от този тип осигуряват постоянен обемен поток на подвижната фаза за дълго време. Максимално работно налягане 300-500 atm, дебит 0,01-10 ml/min. Възпроизводимост на обемния фураж - 0,5%. Основният недостатък е, че разтворителят се подава в системата под формата на серия от последователни импулси, така че има пулсации на налягането и потока.

Това е основната причина за повишения шум и десенсибилизацията на почти всички детектори, използвани в LC, особено електрохимичните. Начини за борба с пулсациите: използване на двойни помпи или помпа Bag-lai с две бутала, като се използват амортизиращи устройства и електронни устройства.

Количеството обемно подаване се определя от три параметъра: диаметър на буталото (обикновено 3,13; 5,0; 7,0 mm), неговата амплитуда (12-18 mm) и честота (която зависи от скоростта на въртене на двигателя и скоростната кутия).

Дозатори. Целта на дозатора е да прехвърли проба при атмосферно налягане към входа на колона при налягане до няколко атмосфери. Важно е дозаторът да не съдържа „мъртви“ обеми, които не могат да бъдат измити от мобилната фаза и пробата да не се отмива по време на дозиране. Първоначално дозаторите в LC бяха подобни на газовите диспенсъри с мембранна пункция. Мембраните обаче не издържат повече от 50-100 атм, химическата им устойчивост е недостатъчна, парчетата им замърсяват филтрите на колоната и капилярите.

В течната фаза скоростта на дифузия е много по-ниска, отколкото в газовата фаза. Следователно е възможно да се дозира със спиране на потока - пробата няма време да се размие в дозатора. По време на инжектирането на пробата в дозатора, специален кран спира потока на разтворителя. Налягането на входа на колоната бързо намалява, след няколко секунди пробата може да се инжектира в дозиращата камера с конвенционална микроспринцовка. След това дозаторът се заключва, потокът на разтворителя се включва и се извършва разделяне.

Налягането, което поддържа този клапан, е до 500-800 атм. Но когато потокът спре, равновесието в колоната се нарушава, което може да доведе до появата на „вакантни“ допълнителни пикове.

Цирковите дозатори са най-широко използвани. При пълнене на дозатора под високо налягане има входове 1,2 и канал между тях. Входовете 3-6, каналите между тях и дозиращия контур са при атмосферно налягане, което ви позволява да напълните контура със спринцовка или помпа. Когато дозаторът се върти, потокът на подвижната фаза принуждава пробата в колоната. За да се намали грешката, цикълът се промива с 5-10 пъти обема на пробата. Ако пробата е малка, тогава тя може да се инжектира в контура с микроспринцовка. Обемът на цикъла обикновено е 5-50 μl.

НА. Войнов, Т.Г. Волова

При високоефективната течна хроматография (HPLC) естеството на процесите, протичащи в хроматографската колона, обикновено е идентично с процесите в газовата хроматография. Разликата е само в използването на течност като неподвижна фаза. Поради високата плътност на течните подвижни фази и високото съпротивление на колоните, газовата и течната хроматография се различават значително по инструментите.

При HPLC като подвижни фази обикновено се използват чисти разтворители или техни смеси.

За създаване на поток от чист разтворител (или смеси от разтворители), наречен елуент в течната хроматография, се използват помпи, които са част от хидравличната система на хроматографа.

Адсорбционната хроматография се извършва в резултат на взаимодействието на вещество с адсорбенти, като силикагел или алуминиев оксид, които имат активни центрове на повърхността. Разликата в способността да взаимодействат с адсорбционните центрове на различни молекули на пробата води до разделянето им на зони в процеса на движение с подвижната фаза през колоната. Постиганото разделяне на компонентните зони в този случай зависи от взаимодействието както с разтворителя, така и с адсорбента.

Силикагелните адсорбенти с различни обеми, повърхности и диаметри на порите намират най-голямо приложение в HPLC. Алуминиевият оксид и други адсорбенти се използват много по-рядко. Основната причина за това:

недостатъчна механична якост, която не позволява опаковане и използване при повишени налягания, характерни за HPLC;

силикагелът в сравнение с алуминиевия оксид има по-широк диапазон на порьозност, повърхност и диаметър на порите;значително по-високата каталитична активност на алуминиевия оксид води до изкривяване на резултатите от анализа поради разлагането на компонентите на пробата или тяхната необратима хемосорбция.

HPLC детектори

Високоефективната течна хроматография (HPLC) се използва за откриване на полярни нелетливи вещества, които по някаква причина не могат да бъдат превърнати във форма, удобна за газова хроматография, дори под формата на производни. Такива вещества, по-специално, включват сулфонови киселини, водоразтворими багрила и някои пестициди, като производни на фенил-урея.

Детектори:

UV - диоден масив детектор. „Матрицата“ на фотодиодите (има повече от двеста от тях) постоянно регистрира сигнали в UV и видимата област на спектъра, като по този начин осигурява записването на UV-B спектрите в режим на сканиране. Това прави възможно непрекъснато записване при висока чувствителност на неизкривени спектри на компоненти, бързо преминаващи през специална клетка.

В сравнение с откриването с една дължина на вълната, което не предоставя информация за "чистотата" на пика, възможността за сравняване на пълните спектри на диодната решетка осигурява резултат от идентификация с много по-голяма степен на сигурност.

Флуоресцентен детектор.Голямата популярност на флуоресцентните детектори се дължи на много високата селективност и чувствителност, както и на факта, че много замърсители на околната среда флуоресцират (например полиароматни въглеводороди).

Електрохимичен детекторсе използват за откриване на вещества, които лесно се окисляват или редуцират: феноли, меркаптани, амини, ароматни нитро и халогенни производни, алдехиди, кетони, бензидини.

Хроматографското разделяне на сместа върху колоната поради бавното придвижване на PF отнема много време. За да се ускори процеса, хроматографията се извършва под налягане. Този метод се нарича високоефективна течна хроматография (HPLC).

Модернизацията на оборудването, използвано в класическата течна колонна хроматография, я превърна в един от обещаващите и съвременни методи за анализ. Високоефективната течна хроматография е удобен метод за разделяне, подготвително изолиране и извършване на качествен и количествен анализ на нелетливи, термолабилни съединения както с ниско, така и с високо молекулно тегло.

В зависимост от вида сорбент, използван в този метод, се използват 2 варианта на хроматография: върху полярен сорбент, използващ неполярен елуент (опция за директна фаза) и върху неполярен сорбент, използващ полярен елуент - т.нар. -фазова високоефективна течна хроматография (RPHLC).

Когато елюентът премине към елуента, равновесието при RPHLC условия се установява много пъти по-бързо, отколкото при условията на полярни сорбенти и неводни PF. В резултат на това, както и удобството при работа с вода и водно-алкохолни елуенти, RPHLC вече придоби голяма популярност. Повечето HPLC анализи се извършват по този метод.

Детектори.Регистрацията на изхода от колоната на отделен компонент се извършва с помощта на детектор. За регистрация можете да използвате промяната във всеки аналитичен сигнал, идващ от мобилната фаза и свързан с естеството и количеството на компонента на сместа. Течната хроматография използва такива аналитични сигнали като поглъщане на светлина или излъчване на светлина от излизащия разтвор (фотометрични и флуориметрични детектори), показател на пречупване (рефрактометрични детектори), потенциал и електрическа проводимост (електрохимични детектори) и др.

Постоянно откритият сигнал се записва от рекордера. Хроматограмата е поредица от детекторни сигнали, записани на записващата лента, генерирани, когато отделни компоненти на сместа напуснат колоната. В случай на разделяне на сместа, на външната хроматограма се виждат отделни пикове. Позицията на пика на хроматограмата се използва с цел идентифициране на веществото, височината или площта на пика - за целите на количественото определяне.

Въведение.

Бързото развитие на течната хроматография през последните 10 години се дължи основно на интензивното развитие на теоретичните основи и практическото използване на нейния високоефективен вариант, както и на създаването и промишленото производство на необходимите сорбенти и оборудване.

Отличителна черта на високоефективната течна хроматография (HPLC) е използването на сорбенти с размер на зърното 3-10 µm, което осигурява бърз масопренос с много висока ефективност на разделяне.

В момента HPLC заема първо място сред инструменталните методи по скорост на развитие, изпреварвайки дори газовата хроматография. Най-важното предимство на HPLC в сравнение с газовата хроматография е способността да се изследва почти всеки обект без никакви ограничения върху техните физикохимични свойства, например по точки на кипене или молекулно тегло.

Днес HPLC е добре оформен инструментален метод, който се използва широко в различни области на науката и технологиите. Неговото значение е особено голямо в такива важни области като биохимия, молекулярна биология, контрол на замърсяването на околната среда, както и в химическата, нефтохимическата, хранителната и фармацевтичната промишленост.

тъй като е необходимо да се вземат предвид редица много специфични изисквания поради следните особености на методологията.

а. Колоните за HPLC се пълнят с носител с много малък диаметър на частиците. В резултат на това върху колоната се генерират високи налягания при скорости в пространството на разтворителя, необходими за бързо разделяне на пробата.

б. Детекторите, използвани в HPLC, са чувствителни към флуктуации в потока на елуента и налягането (шум). Освен това, когато се използват детектори за концентрация, се изисква дори по-висока стабилност на обемната скорост на елуента.

в Процесът на хроматографско разделяне е придружен от редица антагонистични ефекти, например дисперсията на пробата в подвижната фаза води до смесване на отделените компоненти и намалява максималната концентрация на веществото в елуиращия пик (в детектора). Дисперсия се наблюдава във всички части на системата от точката на инжектиране на пробата до детектора.

г. Разтворителите, действащи като подвижна фаза, често са способни да корозират оборудването. Това се отнася предимно за разтворители, използвани в обратнофазовата хроматография, която се предпочита при биохимични HPLC приложения.

Спецификата на HPLC като инструментална техника трябва да се вземе предвид в процеса на разработване, създаване и експлоатация на тези системи. Отне повече от десет години търсене и изследвания, за да се създадат търговски образци на хроматографски системи и техните компоненти, които са достатъчно надеждни, прости и безопасни за работа с приемливо съотношение между цена и технически характеристики. Последните тенденции към намаляване на сърцевината (както дължина, така и диаметър) ни принуждават да предявим нови изисквания към инструментите.

1.1. ЕФЕКТИВНОСТИСЕЛЕКТИВНОСТ

Хроматографията е метод за разделяне на компонентите на смес въз основа на разликата в тяхното равновесно разпределение между две „несмесващи се фази, едната от които е неподвижна, а другата е подвижна. Компонентите на пробата се движат през колоната, когато са в подвижна фаза и остават на място, когато са по-голям афинитетът на компонента към неподвижната фаза и по-малък към подвижната фаза, толкова по-бавно се движи през колоната и толкова по-дълго се задържа в нея. Поради разликата в афинитета на компоненти на сместа за стационарни и подвижни приемливо количество време сместа в отделни ленти (върхове) на компонентите, докато се движат през колоната с подвижната фаза.

От тези общи идеи става ясно, че хроматографското разделяне е възможно само ако компонентите на пробата, влизащи в колоната по време на инжектиране на пробата, първо, ще бъдат разтворени в подвижната фаза и, второ, ще взаимодействат (задържат) със стационарната фаза. Ако някои компоненти не са в разтвор, когато пробата се инжектира, те ще бъдат филтрирани и няма да участват в хроматографския процес. По същия начин, компоненти, които не взаимодействат с неподвижната фаза, ще преминат през колоната с подвижната фаза, без да се разделят на компоненти.

Нека приемем условието, че някои два компонента са разтворими в подвижната фаза и взаимодействат със стационарната фаза, т.е. хроматографският процес може да протече без смущения. В този случай, след преминаване на сместа през колоната, могат да се получат хроматограми на формата а, били в(фиг. 1.1). Тези хроматограми илюстрират хроматографски разделяния, които се различават по ефективност (аи б) с еднаква селективност и селективност (би в)с еднаква ефективност.

Ефективността на колоната е по-висока, колкото по-тесен се получава пикът при същото време на задържане. Ефективността на колоната се измерва с броя на теоретичните плочи (NPP) н: толкова по-висок е ефектът

Ориз. 1.2. Параметри на хроматографския пик и изчисляване на броя на теоретичните плаки:

t R - пиково време на задържане; з - височина на пика; Wj/j - ширина на пика на половината от неговата височина

Ориз. 1.1. Тип хроматограма в зависимост от ефективността и селективността на колоната:

а- конвенционална селективност, намалена ефективност (по-малко теоретични плочи); b - конвенционална селективност и ефективност; в -конвенционална ефективност, повишена селективност (по-голямо съотношение на времената на задържане на компонентите)

ефективност, колкото по-голям е FTT, толкова по-малко е пиковото разширение на първоначално тясната лента, докато преминава през колоната, толкова по-тесен е пикът на изхода на колоната. NTT характеризира броя на стъпките за установяване на равновесие между подвижната и стационарната фаза.

Познаване на броя на теоретичните плочи на колона и дължината на колоната Л (µm), както и средния диаметър на зърното на сорбента DC (µm), лесно е да се получи теоретичната еквивалентна височина на плоча (HETP), както и намалената теоретична еквивалентна височина на плочата (PHETP):

HETT = Л/ н

PVETT \u003d B3TT / d c .

Със стойностите на NTT, HETP и PHETP може лесно да се сравни ефективността на колони от различен тип, различни дължини, пълни със сорбенти с различно естество и гранулация. Сравнявайки NTT на две колони с еднаква дължина, сравнете тяхната ефективност. Когато се сравнява HETP, колоните се сравняват със сорбенти със същия размер на зърното, с различна дължина. И накрая, стойността на PVETT позволява на всякакви две колони да оценят качеството на сорбента, първо, и качеството на запълване на колоните, и второ, независимо от дължината на колоните, зърненост от сорбенти от нейната природа.

Селективността на колоната играе голяма роля за постигане на хроматографско разделяне.

Селективността на колона зависи от много фактори, а умението на експериментатора се определя до голяма степен от способността да се влияе върху селективността на разделянето. За да направи това, хроматографът разполага с три много важни фактора в ръцете си: изборът на химическата природа на сорбента, изборът на състава на разтворителя и неговите модификатори и отчитането на химичната структура и свойствата на компонентите към да бъдат разделени. Понякога забележим ефект върху селективността оказва промяна в температурата на колоната, която променя коефициентите на разпределение на веществата между подвижната и неподвижната фаза.

Когато се разглежда разделянето на два компонента в хроматограмата и се оценява, разделителната способност е важен параметър. Rs, който свързва времето на излизане и ширините на пика на двата отделени компонента

Разделителната способност като параметър, характеризиращ разделянето на пиковете, се увеличава с увеличаване на селективността, отразена от увеличаване на числителя, и ефективността, отразена от намаляване на стойността на знаменателя поради намаляване на ширината на пиковете, се увеличава. Следователно бързият напредък на течната хроматография доведе до промяна в концепцията за „течна хроматография с високо налягане“ – тя беше заменена с „високопроизводителна течна хроматография“ (докато съкратеното обозначение на термина на английски език беше запазено HPLC като най-правилната характеристика на посоката на развитие на съвременната течна хроматография).

По този начин промиването на колоната се намалява и ефективността се увеличава, когато се използват по-фин, по-равномерен (с тесен разрез) сорбент, по-плътно и равномерно набит в колоната, по-тънки свързани фази, по-малко вискозни разтворители и оптимални скорости на потока.

Въпреки това, наред с размазването на лентата на хроматографската зона по време на разделяне в колоната, тя може да бъде размазана и в устройството за инжектиране на пробата, в свързващите капиляри инжектор-колона и колона-детектор, в детекторната клетка и в някои спомагателни устройства ( микрофилтри за улавяне на механични частици от проби, инсталирани след инжектора, предварителни колони, реакторни намотки и др.) - Размазването е толкова по-голямо, колкото по-голям е обемът на извънколоната в сравнение със задържания обем на пика. Също така има значение къде се намира мъртвият обем: колкото по-тесен е хроматографският извик, толкова по-замъглено ще даде мъртвия обем. Ето защо трябва да се обърне специално внимание на дизайна на тази част на хроматографа, където хроматографската зона е най-тясна (инжектора и устройствата от инжектора до колоната) - тук размазването извън колоната е най-опасно и засяга повечето. Въпреки че се смята, че в добре проектираните хроматографи източниците на допълнително размазване извън колоната трябва да бъдат сведени до минимум, въпреки това всяко ново устройство, всяка промяна на хроматографа трябва задължително да завършва с тестване на колоната и сравняване на получената хроматограма с паспортния. Ако се наблюдава пиково изкривяване, рязко намаляване на ефективността, капилярите и другите устройства, нововъведени в системата, трябва да бъдат внимателно проверени.

Размазването извън колоната и неговата погрешна преценка могат да доведат до значителна (над 50%) загуба на ефективност, особено когато се опитват да се използват сравнително стари хроматографи за високоскоростна HPLC, микроколонна HPLC и други съвременни HPLC приложения, които изискват микроинжектори , свързващи капиляри с вътрешни с диаметър 0,05-0,15 mm с минимална дължина, колони с капацитет 10-1000 µl, детектори с микрокювети с капацитет 0,03-1 µl и с висока скорост, високоскоростни записващи устройства и интегратори.

1.2. ЗАДЪРЖАНЕ И СИЛА НА РАЗТВОРИТЕЛЯ

За да се отделят аналитите на колоната, както беше споменато по-горе, коефициентът на капацитет к" трябва да бъде по-голямо от 0, т.е. веществата трябва да се задържат от неподвижната фаза, сорбента. Въпреки това, коефициентът на капацитет не трябва да бъде твърде голям, за да се получи приемливо време за елуиране. Ако за дадена смес от вещества се избере стационарна фаза, която ги задържа, тогава по-нататъшната работа по разработването на процедура за анализ се състои в избора на разтворител, който в идеалния случай ще осигури различен за всички компоненти, но приемливо не много голям к". Това се постига чрез промяна на силата на елуиране на разтворителя.

В случай на адсорбционна хроматография върху силикагел или алуминиев оксид, като правило, силата на двукомпонентен разтворител (например хексан с добавка на изопропанол) се увеличава чрез увеличаване на съдържанието на полярния компонент (изопропанол) в него или намалено чрез намаляване на съдържанието на изопропанол. Ако съдържанието на полярния компонент стане твърде ниско (по-малко от 0,1%), то трябва да бъде заменено с по-слаба елуираща сила. Същото се прави, като полярният или неполярният компонент се заменя с други, дори ако дадената система не осигурява желаната селективност по отношение на компонентите на сместа, която представлява интерес. При избора на разтворителни системи се вземат предвид както разтворимостта на компонентите на сместа, така и елуотропната серия от разтворители, съставени от различни автори.

Приблизително по същия начин силата на разтворителя се избира в случай на използване на присадени полярни фази (нитрил, амино, диол, нитро и др.), като се вземат предвид възможните химични реакции и се изключват разтворители, опасни за фазата (напр. , кетони за аминофазата).

В случай на обратнофазова хроматография силата на разтворителя се увеличава чрез увеличаване на съдържанието на органичния компонент (метанол, ацетонитрил или THF) в елуента и се намалява чрез добавяне на повече вода. Ако желаната селективност не може да бъде постигната, се използва друг органичен компонент или се правят опити за промяната му с помощта на различни добавки (киселини, реактиви с йонни двойки и др.).

При сепарации чрез йонообменна хроматография силата на разтворителя се променя чрез увеличаване или намаляване на концентрацията на буферния разтвор или чрез промяна на pH, в някои случаи се използва модификация с органични вещества.

Въпреки това, особено в случай на сложни природни и биологични смеси, често не е възможно да се избере силата на разтворителя по такъв начин, че всички компоненти на пробата да се елуират в рамките на приемливо време. След това е необходимо да се прибегне до градиентно елуиране, т.е. да се използва разтворител, чиято мощност на елуиране по време на анализа се променя, така че постоянно да се увеличава по предварително определена програма. Тази техника позволява да се постигне елуиране на всички компоненти на сложни смеси за относително кратък период от време и разделянето им на компоненти под формата на тесни пикове.

1.3. РАЗМЕР НА ЧАСТИЦИТЕ НА СОРБЕНТА, ПРОПУСНОСТ И ЕФЕКТИВНОСТ

Като се има предвид промиването на колоната, ние посочихме, че ефективността на колоната (HETP) зависи от размера на частиците на сорбента. До голяма степен бързото развитие на HPLC през последните 10-12 години се дължи на първо място на разработването на методи за получаване на сорбенти с размери на частиците от 3 до 10 μm и с тесен фракционен състав, които осигуряват висока ефективност с добра пропускливост, и второ, разработването на методи за пълнене на колони с тези сорбенти и, трето, разработването и серийното производство на течни хроматографи с помпи, предназначени за високо налягане, инжектори и детектори с кювети с малък обем, способни да регистрират пикове с малък обем.

За добре опаковани суспензионни колони, теоретичната еквивалентна височина на плочата (REHP) може да бъде 2, независимо дали за опаковане са използвани 3, 5, 10 или 20 µm частици. В този случай ще получим съответно колони (със стандартна дължина 250 мм) с ефективност 41670, 25000, 12500 и 6250 тона. Изглежда естествено да се избере най-ефективната колона, пълна с 3 µm частици. Тази ефективност обаче идва с цената на работа при много високи налягания и относително бавна скорост на разделяне, тъй като наличната помпа вероятно ще може да изпомпва разтворителя през такава колона с висока пространствена скорост. Тук сме изправени пред въпроса за връзката между размера на частиците на сорбента, ефективността и пропускливостта на колоните.

Ако изразим от тук коефициента на съпротивление на колоната - безразмерна стойност, получаваме следното уравнение:

Коефициентът на съпротивление за колони, пълни с микрочастици от същия тип по същия метод, се променя незначително и възлиза на следните стойности:

Изглед на частици"....Неправилна сферична

формуляр

Суха опаковка. . . . . 1000-2000 800-1200

опаковка за суспензия. . . 700-1500 500-700

Входното налягане в колоната е пропорционално на линейния дебит, коефициента на съпротивление на колоната, вискозитета на разтворителя и дължината на колоната и обратно пропорционално на квадрата на диаметъра на частиците.

Прилагайки тази зависимост за горните колони с частици с диаметър 3, 5, 10 и 20 μm и приемайки постоянна линейна скорост на потока, коефициент на съпротивление на колоната и вискозитет на разтворителя, получаваме съотношение на входното налягане от 44:16:4:1 за колони с еднаква дължина. По този начин, ако за сорбент с обратна фаза с размер на частиците 10 микрона при използване на системи с разтворители, метанолът - . вода (70:30) обикновено е на стандартна колона при скорост на потока на разтворителя 1 ml/min, налягането на входа на колоната е 5 MPa, след това за частици от 5 μm - 20 MPa и за 3 μm - 55 МРа. При използване на силикагел и по-малко вискозна разтворителна система хексан - изопропанол (100:2), стойностите ще бъдат значително по-ниски: съответно 1, 4 и 11 MPa. Ако в случай на сорбент с обърната фаза използването на частици с размер 3 µm е много проблематично, а 5 µm е възможно, но не на всички устройства, тогава за сорбент с нормална фаза няма проблеми с налягането. Трябва да се отбележи, че модерната високоскоростна HPLC обикновено използва по-висока скорост на потока на разтворителя, отколкото в горния пример, така че изискванията за налягане се увеличават още повече.

Въпреки това, в случаите, когато разделянето изисква определен брой теоретични плочи и е желателно да се извърши анализ на скоростта, картината се променя донякъде. Тъй като дължината на колоните със сорбенти с размер на зърното 3, 5, 10 микрона, с еднаква ефективност, ще бъде съответно 7,5; 12,5 и 25 cm, тогава съотношението на налягането на входа на колоната ще се промени на 3,3:2:1. Съответно, продължителността на анализа на такива колони с еднаква ефективност ще бъде съотнесена като 0,3:0,5:1, т.е. при преместване от 10 до 5 и 3 μm, продължителността на анализа ще бъде намалена с 2 и 3,3 пъти. Този по-бърз анализ идва на цената на пропорционално по-високо входно налягане в колоната.

Посочените данни са валидни за случаите, когато сорбентите с различна гранулация имат еднакви криви на гранулометрично разпределение, колоните са опаковани по същия начин и имат същия коефициент на съпротивление на колоната. Трябва да се има предвид, че трудността за получаване на тесни фракции от сорбента се увеличава с намаляване на размера на частиците и това. фракциите от различни производители имат различен фракционен състав. Следователно коефициентът на съпротивление на колоната ще варира в зависимост от размера на зърното, вида на сорбента, метода на опаковане на колоната и т.н.

КЛАСИФИКАЦИЯ НА HPLC МЕТОДИ СПОРЕД МЕХАНИЗМА НА СЕПАРАЦИЯ

Повечето от разделянията, извършени чрез HPLC, се основават на смесен механизъм на взаимодействие на вещества със сорбент, който осигурява по-голямо или по-малко задържане на компонентите в колоната. Механизмите на разделяне в повече или по-малко чиста форма са доста редки на практика, например адсорбция, когато за разделяне на ароматни въглеводороди се използват абсолютно безводен силикагел и безводен хексан.

Със смесен механизъм на задържане за вещества с различни структури и молекулни тегла е възможно да се оцени приносът на адсорбцията, разпределението, изключването и други механизми за задържане. Въпреки това, за по-добро разбиране и разбиране на механизмите на разделяне в HPLC, препоръчително е да се разгледат разделянията с преобладаване на един или друг механизъм, свързани с определен тип хроматография, например йонообменна хроматография.

2.1.1 АДСОРБЦИОННА ХРОМАТОГРАФИЯ

Разделянето чрез адсорбционна хроматография се извършва в резултат на взаимодействието на вещество с адсорбенти, като силикагел или алуминиев оксид, които имат активни центрове на повърхността. Разликата в способността да взаимодействат с адсорбционните центрове на различни молекули на пробата води до разделянето им на зони в процеса на движение с подвижната фаза през колоната. Разделянето на компонентните зони, постигнато в този случай, зависи от взаимодействието както с разтворителя, така и с адсорбента.

Сорбцията върху повърхността на адсорбент с хидроксилни групи се основава на специфично взаимодействие между полярната повърхност на адсорбента и полярните (или поляризуеми) групи или области на молекулите. Такива взаимодействия включват дипол-диполно взаимодействие между постоянни или индуцирани диполи, образуване на водородна връзка до образуването на n-комплекси или комплекси с пренос на заряд. Възможна и доста често срещана в практическата работа е проявата на хемосорбция, която може да доведе до значително увеличаване на времето на задържане, рязко намаляване на ефективността, поява на продукти на разпадане или необратима сорбция на веществото.

Изотермите на адсорбция на веществото са линейни, изпъкнали или вдлъбнати. При линейна изотерма на адсорбция пикът на веществото е симетричен и времето на задържане не зависи от размера на пробата. Най-често адсорбционните изотерми на веществата са нелинейни и имат изпъкнала форма, което води до известна асиметрия на пика с образуването на опашка.

Силикагелните адсорбенти с различни обеми на порите, повърхности и диаметри на порите намират най-голямо приложение в HPLC. Алуминиевият оксид се използва много по-рядко и изключително рядко други адсорбенти, широко използвани в класическата колонна и тънкослойна хроматография. Основната причина за това е недостатъчната механична якост на повечето други адсорбенти, което не позволява те да бъдат опаковани и използвани при повишени налягания, характерни за течностите с високо налягане.

Полярните групи, отговорни за адсорбцията и разположени на повърхността на силикагел и алуминиев оксид, са сходни по свойства. Следователно, обикновено редът на елуиране на смеси от вещества и елуотропната серия от разтворители са еднакви за тях. Въпреки това, разликата в химическата структура на силикагела и алуминиевия оксид понякога води до различия в селективността - тогава се дава предпочитание на един или друг адсорбент, който е по-подходящ за тази конкретна задача. Например, алуминиевият триоксид осигурява по-голяма селективност при отделянето на определени полициклични ароматни въглеводороди.

Предпочитанието, което обикновено се дава на силикагел пред алуминиев оксид, се дължи на по-широкия избор на силикагелове по отношение на порьозност, повърхност и диаметър на порите, както и значително по-високата каталитична активност на алуминиевия оксид, което често води до изкривяване на резултатите от анализа поради разлагането на компонентите на пробата или тяхната необратима хемосорбция.

2.1.2 Недостатъци на адсорбционната хроматография, които ограничават нейното използване

Популярността на адсорбционната хроматография постепенно намалява с развитието на HPLC метода, той все повече се заменя и продължава да бъде заменен от други опции, като HPLC с обърната фаза и нормална фаза върху сорбенти със свързана фаза. Какви недостатъци на адсорбционната хроматография доведоха до това?

На първо място, това са дългата продължителност на процесите на балансиране на адсорбенти с разтворители, съдържащи вода в следи от количества, трудността при приготвянето на такива разтворители с определено и възпроизводимо съдържание на влага. Това води до лоша възпроизводимост на параметрите на задържане, разделителна способност и селективност. По същата причина е невъзможно да се използва градиентно елуиране - връщането в първоначалното състояние е толкова дълго, че значително надвишава печалбата във времето поради използването на градиент.

Значителни недостатъци на адсорбентите, особено на алуминиевия оксид, свързани с чести пренареждания на съединения, чувствителни към катализа, тяхното разлагане, необратима сорбция, също са добре известни и са многократно отбелязани в литературата. Необратимо адсорбиращите се вещества, натрупващи се в началния участък на колоната, променят естеството на сорбента, могат да доведат до повишаване на устойчивостта на колоната или дори до пълното й запушване. Последният недостатък може да бъде отстранен чрез използване на предварителна колона, която На-при увеличаване на съпротивлението и запушването се заменя с ново * или се пълни с нов сорбент. Въпреки това, необратимата сорбция, която също се осъществява в този случай, води до хроматограма, в която компонентите на пробата, чувствителни към сорбция или каталитично разлагане, отсъстват напълно или частично.

2.2. ДИСТРИБУЦИОННА ХРОМАТОГРАФИЯ

Разпределителната хроматография е вариант на HPLC, при който разделянето на сместа на компоненти се извършва поради разликата в техните коефициенти на разпределение между две несмесващи се фази: разтворител (подвижна фаза) и фаза върху сорбент (неподвижна фаза). Исторически, първите са сорбенти от този тип, които се получават чрез нанасяне на течни фази (оксидипропионитрил, парафиново масло и др.) върху порести носители, подобно на това как се приготвят и се приготвят сорбентите за газо-течна хроматография (GLC). Въпреки това, веднага бяха разкрити недостатъците на такива сорбенти, основният от които беше сравнително бързото отмиване на фазата от подложката. Поради това количеството фаза в колоната постепенно намалява, времето на задържане също намалява и в началния участък на колоната се появяват адсорбционни центрове, които не са обхванати от фазата, което причинява образуването на пикови опашки. Този недостатък беше преодолян чрез насищане на разтворителя с поддържаната фаза дори преди да влезе в колоната. Преносът също намалява, когато се използват по-вискозни и по-малко разтворими полимерни фази, но в този случай, поради трудността на дифузията от дебели полимерни филми, ефективността на колоните е значително намалена.

Оказа се логично течната фаза да се присади към носителя чрез химични връзки по такъв начин, че нейното увличане да стане физически невъзможно, т.е. да се превърне носителят и фазата в едно цяло - в така наречената присадена фаза сорбент.

В бъдеще усилията на изследователите бяха насочени към търсенето на реагенти, чието присаждане щеше да протече доста бързо и напълно, а образуваните връзки бяха възможно най-стабилни. Тези реагенти бяха алкилхлорсилани и техните производни, което направи възможно получаването на сорбенти във фаза на присадка от различни видове и с различни полярни и неполярни групи на повърхността по подобна технология.

Успешното използване на последния тип сорбенти за HPLC допринесе за нарастването на производството им от различни производители. Всяка компания произвежда такива сорбенти, като правило, на базата на свой собствен тип силикагел и по собствена технология, която обикновено представлява "ноу-хау" на производството. В резултат на това голям брой сорбенти, които химически се наричат ​​абсолютно еднакви (например силикагел с присаден октадецилсилан), имат много различни хроматографски характеристики. Това се дължи на факта, че силикагелът може да има по-широки или по-тесни пори, различна повърхност, порьозност, повърхността му преди присаждане може да бъде хидроксилирана или не, моно-, ди- или трихлорсилани могат да бъдат присадени, условията на присаждане могат да дадат мономерни, полимерни или смесен фазов слой, се използват различни методи за отстраняване на остатъчни реагенти, допълнително дезактивиране на силанол и други активни групи може да се използва или не.

Сложността на технологията за присаждане на реагенти и приготвяне на суровини и материали, нейната многоетапна природа води до факта, че дори партиди сорбенти, получени по същата технология от един и същ производител, могат да имат леко различни хроматографски характеристики. Това е особено вярно, когато такива сорбенти се използват за анализ на многокомпонентни смеси, съдържащи вещества, които се различават значително по броя и положението на функционалните групи и по вида на функционалността.

С оглед на горното винаги трябва да се стремим да гарантираме *, че при използване на метода за анализ, описан в литературата, се използва същият сорбент и същите работни условия. В този случай вероятността работата да не може да бъде възпроизведена е минимална. Ако това не е възможно и се вземе сорбент от друга компания с подобна свързана фаза, човек трябва да бъде подготвен за факта, че ще е необходима продължителна работа за преработване на методологията. В същото време съществува възможност (и трябва да се има предвид) необходимото разделяне да не бъде постигнато върху този сорбент дори след продължително развитие. Наличието в литературата на много описани техники за разделяне върху отдавна произведени стари сорбенти стимулира по-нататъшното им производство и използване по тази причина. Въпреки това, в случаите, когато е необходимо да се пристъпи към разработването на оригинални методи, особено по отношение на вещества, склонни към разлагане, хемосорбция и прегрупиране, е препоръчително да се започне работа върху сорбенти, които са разработени наскоро и се произвеждат от нови , подобрени версии на технологията. Новите сорбенти имат по-равномерен фракционен състав, по-равномерно и пълно покритие на повърхността от свързаната фаза и по-напреднали крайни етапи на обработка на сорбента.

2.3. ЙОНООБМЕННА ХРОМАТОГРАФИЯ

При йонообменната хроматография разделянето на компонентите на сместа се постига чрез обратимо взаимодействие на йонизиращи се вещества с йонните групи на сорбента. Запазването на електрическата неутралност на сорбента се осигурява от наличието на противойони, способни на йонообмен, разположени в непосредствена близост до повърхността. Йонът на въведената проба, взаимодействащ с фиксирания заряд на сорбента, се обменя с противойона. Веществата с различен афинитет към фиксирани заряди се разделят на анионообменници или на катиони.Анионите имат положително заредени групи на повърхността и сорбират аниони от подвижната фаза.Катионните съответно съдържат групи с отрицателен заряд, които взаимодействат с катиони .

Като подвижна фаза се използват водни разтвори на соли на киселини, основи и разтворители като течен амоняк, т.е. системи разтворители с висока диелектрична константа e и висока склонност към йонизиране на съединения. Обикновено те работят с буферни разтвори, които ви позволяват да регулирате pH стойност.

По време на хроматографското разделяне йоните на аналита се конкурират с йоните, съдържащи се в елуента, като се стремят да взаимодействат с противоположно заредени групи на сорбента. От това следва, че йонообменната хроматография може да се използва за разделяне на всякакви съединения, които могат да бъдат йонизирани по какъвто и да е начин. Възможно е да се анализират дори неутрални захарни молекули под формата на техните комплекси с боратния йон:

Захар + IN 3 2 - \u003d Захар - IN 3 2 -.

Йонообменната хроматография е незаменима за разделянето на силно полярни вещества, които не могат да бъдат анализирани чрез GLC без превръщане в производни. Тези съединения включват аминокиселини, пептиди, захари.

Йонообменната хроматография се използва широко в медицината, биологията, биохимията, за контрол на околната среда, при анализ на съдържанието на лекарства и техните метаболити в кръвта и урината, пестициди в хранителните суровини, както и за отделяне на неорганични съединения, включително радиоизотопи, лантаноиди, актиниди и др. Анализът на биополимери (протеини, нуклеинови киселини и др.), който обикновено отнема часове или дни, с помощта на йонообменна хроматография се извършва за 20-40 минути с по-добро разделяне. Използването на йонообменна хроматография в биологията направи възможно наблюдението на проби директно в биологична среда, намалявайки възможността за пренареждане или изомеризация, което може да доведе до погрешно тълкуване на крайния резултат. Интересно е този метод да се използва за контролиране на промените в биологичните течности. Използването на слаби анионообменници на базата на порьозен силикагел направи възможно разделянето на пептидите. V

Механизмът на йонообмен може да бъде представен като следните уравнения:

за анионен обмен

X-+R+Y- з ->■ Y-+R+X-.

за катионен обмен |

X++ + R-Y+ h=* Y++R-X+.

В първия случай йонът на пробата X~ се конкурира с йона на подвижната фаза Y~ за йонните центрове R+ на йонообменника, а във втория случай катионите на пробата X+ се конкурират с йоните на подвижната фаза Y+ за йонните центрове R~.

Естествено, пробните йони, които слабо взаимодействат с йонообменника, ще бъдат слабо задържани върху колоната по време на това състезание и са първите, които ще бъдат измити от нея, и, обратно, по-силно задържаните йони ще бъдат последни, които ще се елуират от колоната. Обикновено BTqpH4Hbie взаимодействия от нейонен характер възникват поради адсорбция или водородна връзка на пробата с нейонната част на матрицата или поради ограничената разтворимост на пробата в подвижната фаза. Трудно е да се разграничи "класическата" йонообменна хроматография в нейната "чиста" форма и затова някои хроматографи изхождат от емпирични, а не от теоретични модели в йонообменната хроматография.

Разделянето на специфични вещества зависи преди всичко от избора на най-подходящия сорбент и подвижна фаза. Като стационарни фази в йонообменната хроматография се използват йонообменни смоли и силикагелове с присадени йоногенни групи.

2.4. РАЗМЕРНА ХРОМАТОГРАФИЯ

Изключващата хроматография е опция! течна хроматография, при която се получава разделяне поради разпределението на молекулите между разтворителя вътре в порите на сорбента и изтичащия разтворител " между неговите частици.

За разлика от други опции за HPLC, където разделянето отивапоради различното взаимодействие на компонентите с повърхността на сорбента, ролята на твърдия пълнител в хроматографията с изключване по размер се състои само в образуването на пори с определен размер, а неподвижната фаза е разтворителят, който запълва тези пори. Следователно използването на термина "сорбент" за тези пълнители е донякъде условно.

Основната особеност на метода е възможността за разделяне на молекули според техния размер в разтвор в диапазона на почти всяко молекулно тегло - от 10 2 до 10 8 , което го прави незаменим за изследване на синтетични и биополимери.

Традиционно процесът, провеждан в органични разтворители, все още често се нарича гел-проникваща хроматография, а във водни системи - гел-филтрационна хроматография. В тази книга и за двата варианта е възприет един-единствен термин, който идва от английското „Изключване на размера“ – изключение по размер – и отразява най-пълно механизма на процеса.

В монографии е извършен подробен анализ на съществуващите идеи за много сложна теория на процеса на хроматография с изключване по размер.

Общ обем разтворител в колоната Vt (често се нарича общ обем на колоната, т.к Vd не участва в хроматографския процес) е сумата от обемите на подвижната и неподвижната фаза.

Задържането на молекули в оклузивна колона се определя от вероятността за тяхната дифузия в порите и зависи от съотношението на размерите на молекулите и порите, което е схематично показано на фиг. 2.15. Коефициент на разпределение ка,както при други варианти на хроматография, това е съотношението на концентрациите на веществото в неподвижната и подвижната фаза.

Тъй като подвижната и неподвижната фаза имат еднакъв състав, тогава kd вещество, за което и двете фази са еднакво достъпни, е равно на единица. Тази ситуация се реализира за C молекули с най-малки размери (включително молекули на разтворителя), които проникват във всички пори (виж фиг. 2.15) и следователно се движат през колоната най-бавно. Техният задържан обем е равен на общия обем на разтворителя Vt-

Ориз. 2.15. Модел на разделяне на молекули чрез измерване на ексклюзивна хроматография

Всички молекули, по-големи от размера на порите на сорбента, не могат да попаднат в тях (пълно изключване) и да преминат през каналите между частиците. Те се елуират от колоната със същия задържащ обем, равен на обема на подвижната фаза V 0 - Коефициентът на разпределение за тези молекули е нула.

Молекули със среден размер, способни да проникнат само в някои от порите, се задържат в колоната според техния размер. Коефициентът на разпределение на тези молекули варира от нула до единица и характеризира частта от обема на порите, наличен за молекули с даден размер.Техният задържан обем се определя от сумата на Y o и достъпната част от обема на порите.

КАЧЕСТВЕН АНАЛИЗ

Хроматографът, който започва да работи в областта на високоефективната течна хроматография, трябва да е запознат с основите на качествения анализ. Качественият анализ се използва за идентифициране на познат продукт, получен по нов начин или смесен с други продукти. някои лекарствени химични продукти и техните метаболити в bioml. грешки, например / разграничаване на примеси в проба от примеси в разтворител или проверка на чистотата на вещество на повече от един спектрофотометър с дължина на вълната, но на различни и т.н.

Преди да се пристъпи към анализа, е необходимо да се установи дали цялата проба се елуира от колоната с тази система от разтворители или не. За да сте сигурни в пълното елуиране, е необходимо да се събере цялата течност, изтичаща от колоната, да се изпари разтворителят, да се претегли остатъкът и да се намери извличането на пробата.

Идентифицирането на компонентите в HPLC може да се извърши по три начина: 1) използване на информация за задържане; 2) изследва зоните, получени чрез разделяне в колона за течен хроматограф, използвайки спектрални или химични методи за анализ; 3) директно свържете спектралния анализатор към колоната.

Задържащият обем се използва за регистриране на пикове в хроматографията V R или време за задържане t R. И двете стойности са характеристика на вещество в дадена хроматографска система. Тъй като времето на задържане на веществото, което трябва да се отдели, се състои от времето на взаимодействие в колоната и времето на преминаване през празните секции на тръбата, то варира от инструмент на инструмент. Удобно е да имате вещество, което не се задържа от тази колона, като го приемате за стандарт, времето на задържане и обема на който T 0 , V o. Хроматографията на веществото и стандарта трябва да се извърши при едни и същи условия (налягане и скорост на потока). При идентифициране чрез данни за задържане, известните отделни вещества, които могат да присъстват в пробите, се разделят в една и съща хроматографска система и се получават стойности за тях. t R. Сравняване на тези стойности t R с времето на задържане на неизвестния пик, може да се установи, че те или съвпадат, в който случай пиковете вероятно съответстват на едно и също вещество, или t R известното вещество не съвпада t R неизвестна зона. Тогава все още е възможно да се изчислят стойностите t R вещества, които не са налични за директно измерване на тяхното задържане. Нека разгледаме и двата варианта.

В първия случай очевидно е необходимо предварително проучване на пробата, за да се постулира наличието на специфични вещества в нея. При работа с прости смеси е лесно да се определи дали степента на задържане на зоните на пробата и познатите вещества съвпада или не, т.е. т Б са еднакви или различни. В случай на сложни смеси, няколко вещества могат да бъдат елуирани с подобни стойности наведнъж. t R, и зоните, действително получени чрез хроматографско разделяне, се припокриват. В резултат на това се получават точни стойности t R за различни зони става невъзможно. Надеждността на идентификацията се увеличава с увеличаване на разделителната способност, по-внимателен контрол на условията на разделяне, многократно измерване на стойности t R и осредняване на намерените стойности. В този случай хроматографското разделяне на известни и неизвестни вещества трябва да се редува. При разделяне на сложни смеси, стойността t R веществата могат да се променят под въздействието на матрицата на самата проба. Такъв ефект е възможен в началото на хроматограмата и когато пиковете се припокриват; затягане на зоната също е възможно, както вече споменахме.

В такива случаи стандартът трябва да се добави към пробата в съотношение 1: 1. Ако веществата са идентични, стойността t R изходният материал не се променя и на хроматограмата се получава само един пик. Ако има устройство със система за циклична хроматография, тогава за надеждност на идентификацията е желателно сместа да премине през колоната няколко пъти.

Информация за степента на задържане може да се намери и в литературата, но стойността на тази информация е ограничена. Тъй като колоните дори от една партида дават лоша възпроизводимост, литературните стойности не винаги съответстват на истинската стойност. t R на тази колона. За адсорбционната хроматография обаче е възможно да се предвиди t R въз основа на литературни данни. Друга трудност, свързана с използването на литературни значения t R, - трудността при намирането им в специализираната литература, въпреки че библиографските прегледи, публикувани в Journal of Chromatography, имат актуализиран индекс на видовете вещества.

Във втория случай, когато времената на задържане на известни съединения и пробни зони не съвпадат, е възможно да се предвиди времето на задържане на неизвестен компонент. Прогнозите за относително задържане, базирани на структурни данни в 3D хроматография, са доста надеждни. Те са по-малко точни при адсорбция, разделителна хроматография и особено при работа върху химически свързана фаза. За йонна и йонно-двойна хроматография на вещества с известни p Kaвъзможни са само приблизителни стойности tR. Винаги е по-лесно да се предвиди относително задържане или *x стойност, отколкото абсолютни стойности. к". Относителни стойности t R по-лесно за оценка за свързани съединения или производни, като заместени алкилкарбоксилни киселини или производни на бензол.

При изократичното разделяне на хомолози или олигомери понякога се наблюдава следната закономерност:

\ gk" = А + bn,

където НОи AT- константи за редица избрани проби и за дадена хроматографска система (на една и съща колона, със същите подвижни и неподвижни фази); Пе броят на идентични структурни единици в молекулата на пробата.

Въвеждането на функционалната група / в молекулата на пробата ще доведе до промяна к" в първото уравнение по някакъв постоянен коефициент а/ в дадена хроматографска система. Възможно е да се получат групови константи а/ за различни заместващи групи/, чиито стойности ще се увеличават с увеличаване на полярността на функционалните групи при всички видове хроматография, с изключение на обърната фаза, където стойностите на константите ще намалеят с увеличаване на полярността.

Някои групови константи а/ за различни групи заместители / са дадени в табл. 9.1.

При адсорбционната хроматография първото уравнение не винаги е приложимо, тъй като е валидно при условие, че всички изомери имат една и съща стойност к", което не винаги се спазва. Възможно е обаче да се начертае lgfe" на същите съединения на една колона спрямо lgfe" на същите съединения на различна колона или спрямо съответните характеристики в тънкослойна хроматография, например lg[(l- RF) IRf].

Когато сравнявате данните за задържане, можете да използвате стойностите на коефициента на капацитет к", тъй като върху него, за разлика от t R не влияят върху скоростта на подвижната фаза и геометричните характеристики на колоната.

Разделянето върху химически свързана фаза е подобно на разделянето чрез разделителна хроматография с подобни фази и следователно данните за екстракция при равновесие могат да се използват за прогнозиране на времето на задържане.

При йонообменната хроматография задържането се влияе от три фактора: степента на йонизация на киселини и основи, заряда на йонизираната молекула и способността на веществото от водната подвижна фаза, използвано в йонообменната хроматография, да мигрира в органичната фаза . Последното зависи от молекулното тегло на съединението и неговата хидрофобност. Следователно, по-силните киселини или основи се задържат по-силно при анионообменно или катионообменно разделяне. С намаление RK aна отделна киселина, включена в пробата, задържането се увеличава по време на отделянето на редица киселини поради анионообмен, а с увеличаване на p / C o задържането на основите се увеличава по време на тяхното отделяне поради катионен обмен.

По този начин съвпадението на стойностите на времето на задържане на известно вещество с наблюдаваното дава възможност да се приеме тяхната идентичност. Надеждността на идентификацията се повишава, ако хроматограмите на известно вещество и неизвестен компонент се сравняват при различни условия. Ако веществата в адсорбционната и обратнофазовата или йонообменната и хроматографията с изключване по размер се държат по същия начин, надеждността на идентификацията се повишава. Ако надеждността на идентификацията с еднакво относително задържане е 90%, тогава при изследване на поведението на едни и същи вещества при условия, които се различават значително, надеждността на идентификацията вече е 99%.

Ценна характеристика на веществото, използвано при идентификацията, е съотношението на сигналите, получени за дадено вещество на два различни детектора. След като напусне колоната, аналитът преминава първо през първия детектор, след това през втория, а сигналите, идващи от детекторите, се записват едновременно с помощта на мулти-писател или на два записващи устройства. Обикновено се използва серийно свързване на ултравиолетов детектор (по-чувствителен, но селективен) с рефрактометър, или ултравиолетов с флуоресцентен детектор, или два ултравиолетови детектора, работещи на различни дължини на вълната. Относителният отговор, т.е. съотношението на сигнала на рефрактометъра към сигнала на фотометъра, е характеристика на веществото, при условие че и двата детектора работят в своя линеен обхват; това се потвърждава чрез въвеждане на различни количества от едно и също вещество. Качествена информация може да бъде получена чрез работа с фотометрични детектори, оборудвани с устройство за спиране на потока и ви позволяващи да запишете спектъра на пика, напускащ колоната, докато е в проточната клетка, като го сравнявате със спектъра на известно съединение.

Значителен интерес за идентификацията представляват съвременните, но скъпи спектрофотометри с диодна решетка.

Напълно неизвестно вещество не може да бъде идентифицирано само чрез високоефективна течна хроматография, необходими са други методи.

КОЛИЧЕСТВЕН АНАЛИЗ

Количествената течна хроматография е добре разработен аналитичен метод, който не отстъпва по точност на количествената газова хроматография и значително надвишава точността на TLC или електрофореза. За съжаление, няма детектор в HPLC, който да има подобна чувствителност за съединения с различни химични структури ( като катарометър в Следователно е необходимо калибриране на инструмента за получаване на количествени резултати.

Количественият анализ се състои от следните стъпки: 1) хроматографско разделяне; 2) измерване на върхови площи или височини; 3) изчисляване на количествения състав на сместа въз основа на хроматографски данни; 4) интерпретация на получените резултати, т.е. статистическа обработка. Нека разгледаме всички тези етапи.

4.1. ХРОМАТОГРАФСКО РАЗДЕЛЯНЕ

По време на вземането на проби могат да се допуснат грешки. Особено важно е да се избягват грешки и да се вземе адекватна представителна проба от хетерогенни твърди проби, силно летливи или нестабилни вещества и селскостопански продукти и биоматериали. Нехомогенни проби, като например хранителни продукти, се смесват старателно и се разрязват на четвъртинки. При многократно извършване на тази операция се постига хомогенност на пробата.

Грешки и загуби на вещества могат да бъдат допуснати на етапа на извличане, изолиране, пречистване и др.

Пробите трябва да бъдат напълно разтворени и техните разтвори да бъдат приготвени с точност ±0,1%. Желателно е пробата да се разтвори в подвижната фаза, което ще изключи възможността за нейното утаяване след въвеждане в хроматографа. Ако разтварянето в подвижната фаза не е възможно, тогава трябва да се използва разтворител, който може да се смесва с нея и обеми на пробата (по-малко от 25 µl) трябва да се инжектират в хроматографа.

По време на инжектирането на пробата могат да възникнат значителни грешки поради фракциониране, изтичане и пиково размазване. Размазването на пиковете причинява образуване на опашки, което води до частично припокриване на пиковете и като следствие до грешки при откриването. Устройствата с кръгови клапани са предпочитани пред спринцовките за инжектиране на проба при количествено определяне поради по-висока точност и по-малка зависимост от оператора.

При хроматографското разделяне на веществата могат да възникнат и усложнения, които водят до изкривяване на данните: количествен анализ. Възможно разлагане или трансформация на пробата по време на хроматографския процес или необратима адсорбция на веществото върху тази колона. Важно е да се гарантира, че тези нежелани явления не съществуват и, ако е необходимо, колоната да се регенерира или да се смени. Припокриването на върховете и опашката могат също да бъдат намалени чрез промяна на условията на хроматография.

Пикове, които са фалшиви или с неясна форма, или пикове, чието време на освобождаване е близко до да се, защото може да няма достатъчно сегрегация. Обикновено се използват пикове със стойност d" > 0,5. Най-висока ефективност на колоната се постига с въвеждането на 10~5 -10~6 g разтворено вещество на 1 g сорбент. При въвеждане на големи количества проба зависимостта на височината на пика при натоварване може да се окаже нелинейна и е необходима количествена оценка за пиковата площ.

Грешките, свързани с откриването или усилването, водят до значително изкривяване на резултатите от хроматографското разделяне. Всеки детектор се характеризира със специфичност, линейност и чувствителност. Особено важно е да се провери селективността при анализа на микропримеси. Реакцията на UV детекторите може да се промени към вещества със сходни функционални групи с коефициент 104. Необходимо е да се калибрира реакцията на детектора за всеки аналит. Естествено, вещества, които не абсорбират в UV областта, няма да дадат сигнал на рекордера, когато се използва като детектор за фотометър. При използване на рефрактометър могат да се появят отрицателни пикове. Освен това този детектор трябва да бъде термостатиран, което не се изисква за UV детектор.

Линейността на детектора определя размера на инжектираната проба. Трябва да се помни, че скоростта на потока през колоната, температурата на колоната и детектора и нейният дизайн влияят на точността на количествения анализ. Грешки при предаването на електрически сигнал към изходното устройство (рекордер), интегратор или компютър могат да възникнат поради улавяне на шум, липса на заземяване, колебания на напрежението в мрежата и др.

4.2. ИЗМЕРВАНЕ НА ПЛОЩ ИЛИ ВИСОЧИНИ

височина на пика з (фиг. 10.1) наричайте разстоянието от върха на пика до базовата линия, то се измерва линейно или се брои броят на деленията на рекордера. Някои електронни интегратори и компютри предоставят информация за пиковата височина. Позицията на базовата линия на изместените пикове се намира чрез интерполиране на ординатните стойности, съответстващи на началото и края на пика (пик 1 и 3виж фиг. 10.1). За да се подобри точността, е необходимо да има равна, стабилна изходна линия. В случай на неразделени пикове, базовата линия се изчертава между началото и края на пика, вместо да се заменя с нулева линия. Тъй като височината на пика е по-малко зависима от влиянието на съседните припокриващи се пикове, оценката на височината на пика е по-точна и почти винаги се използва при анализа на следи.

Площта на пика може да се определи по различни начини. Нека разгледаме някои от тях.

1. Планиметричният метод се състои във факта, че пикът се проследява с ръчен планиметър, който е устройство, което механично определя площта на върха. Методът е точен, но трудоемък и лошо възпроизводим. Този метод не се препоръчва.

2. Метод на хартиен силует - върхът се изрязва и претегля. Методът е добре възпроизводим, но трудоемък и хроматограмата се разрушава. Неговата приложимост зависи от хомогенността на диаграмата. Методът също не може да бъде широко препоръчан.

4. Методът на триангулация се състои в конструиране на триъгълник чрез начертаване на допирателни към страните на върха. Върхът на триъгълника е по-висок от върха на върха. Увеличаването на площта, образувана от този удължен пик, ще бъде последователно в цялата хроматограма и няма да повлияе твърде много на точността. В допълнение, част от загубената площ при изчертаване на допирателни ще бъде компенсирана. Основата на триъгълник се определя от пресечната точка на допирателните с основната линия, а площта се определя от произведението на 7g от основата на височината. За определяне на площите на асиметричните върхове този метод е най-добрият. Възпроизводимостта при конструирането на тангенси от различни оператори обаче е различна и следователно; ниско.

5. Методът на дисковия интегратор се основава на електромеханично приспособление, прикрепено към рекордера. Писалката, прикрепена към интегратора, се движи по лентата в долната част на лентата със скорост, пропорционална на движението на писалката на записващото устройство.

Както при ръчното измерване, пикът трябва да остане в скалата на рекордера, но корекциите за компенсиране на изместването на базовата линия и непълното разделяне на съседните пикове намаляват надеждността и увеличават времето за анализ.

Методът е по-точен от методите за ръчно измерване, особено с асиметрични пикове, и предлага предимство в скоростта. В допълнение, той осигурява постоянен количествен запис на анализа.

6. Методите, използващи електронни интегратори, които определят площта на пиковете и отпечатват информация за тази област и времената на задържане, могат да включват корекция за изместване на базовата линия и определяне на площта само на частично разделени пикове. Основните предимства са точност, бързина, независимост на действието от работата на рекордера. Интеграторите имат памет и могат да бъдат програмирани за конкретен анализ с помощта на предварително заредена програма. Предимствата на интегратора включват способността му да използва корекционни фактори за реакцията на детектора при преизчисляване на първоначалните данни за пиковите площи, компенсирайки разликата в чувствителността на детектора към различни вещества. Такива системи спестяват време, подобряват аналитичната точност и са полезни за рутинен аналитичен анализ.

7. Компютрите, които измерват пиковите площи, се използват широко в течната хроматография. Те разпечатват пълното съобщение, включително наименованието на веществата, пиковите площи, времената на задържане, корекционните фактори на реакцията на детектора и съдържанието (в тегл.%) за различните компоненти на пробата.

ОБЩО РАЗРЕШЕНИЕ ЗА ФАРМАКОПЕЦИЯ

Вместо чл. GF XI

Високоефективна течна хроматография (течна хроматография с високо налягане) е метод на колонна хроматография, при който подвижната фаза е течност, движеща се през хроматографска колона, пълна с неподвижна фаза (сорбент). Колоните за високоефективна течна хроматография се характеризират с високо хидравлично съпротивление на входа.

В зависимост от механизма на разделяне на веществата се разграничават следните варианти на високоефективна течна хроматография: адсорбционна, разделителна, йонообменна, изключване, хирална и др., в съответствие с естеството на основните проявени междумолекулни взаимодействия. При адсорбционната хроматография разделянето на веществата възниква поради различната им способност да се адсорбират и десорбират от повърхността на сорбент с развита повърхност, например силикагел. При разделителната високоефективна течна хроматография разделянето се получава поради разликата в коефициентите на разпределение на веществата, които трябва да бъдат разделени между неподвижната (като правило, химически присадена върху повърхността на стационарния носител) и подвижната фаза.

В зависимост от вида на подвижната и неподвижната фаза се разграничават нормална и обърната фаза хроматография. При високоефективна течна хроматография с нормална фаза неподвижната фаза е полярна (най-често силикагел или силикагел с присадени NH 2 - или CN групи и др.), а подвижната фаза е неполярна (хексан или смеси от хексан с по-полярни органични разтворители - хлороформ, алкохоли и др.). Задържането на веществата се увеличава с увеличаване на полярността. При нормална фазова хроматография елуиращата сила на подвижната фаза се увеличава с увеличаване на полярността.

При обратнофазовата хроматография неподвижната фаза е неполярна (хидрофобни силикагелове с присадени С4, С8, С18 групи и др.); подвижната фаза е полярна (смеси от вода и полярни разтворители: ацетонитрил, метанол, тетрахидрофуран и др.). Задържането на веществата се увеличава с увеличаване на тяхната хидрофобност (неполярност). Колкото по-високо е съдържанието на органичния разтворител, толкова по-висока е елуиращата сила на подвижната фаза.

При йонообменната хроматография молекулите на веществата от сместа, дисоциирани в разтвор на катиони и аниони, се разделят при движение през сорбента (катионообменник или анионообменник) поради различната сила на взаимодействието на йоните, които трябва да бъдат определя се с йонните групи на сорбента.

При хроматография с изключване на размера (ситова, гел-проникваща, гел-филтрационна) хроматографията молекулите на веществата се разделят по размер поради различната им способност да проникват в порите на неподвижната фаза. В този случай най-големите молекули, които могат да проникнат в минималния брой пори на неподвижната фаза, първи напускат колоната, а веществата с малки молекулни размери са последни.

При хирална хроматография оптично активните съединения се разделят на отделни енантиомери. Разделянето може да се извърши върху хирални стационарни фази или върху ахирални стационарни фази, като се използват хирални подвижни фази.

Има и други опции за високоефективна течна хроматография.

често разделянето протича не по един, а по няколко механизма едновременно, в зависимост от вида на подвижната и неподвижната фаза, както и от естеството на определяното съединение.

Област на приложение

Високоефективната течна хроматография се използва успешно както за качествен, така и за количествен анализ на лекарства в тестовете "Идентичност", "Чужди примеси", "Разтваряне", "Еднородност на дозиране", "Количествено определяне". Трябва да се отбележи, че хроматографията ви позволява да комбинирате няколко теста в една проба, включително "Идентичност" и "Количествено определяне".

Оборудване

За анализ се използват подходящи инструменти - течни хроматографи.

Съставът на течния хроматограф обикновено включва следните основни компоненти:

- блок за подготовка на подвижна фаза, включващ контейнер с подвижна фаза (или контейнери с отделни разтворители, които са част от подвижната фаза) и система за дегазиране на подвижната фаза;

— помпена система;

– мобилен фазов смесител (при необходимост);

– система за впръскване на проба (инжектор), може да бъде ръчна или автоматична (автосамплер);

— хроматографска колона (може да се монтира в термостат);

— детектор (един или повече с различни методи за откриване);

— система за управление на хроматографа, събиране и обработка на данни.

В допълнение, хроматографът може да включва: система за подготовка на проби и реактор за предколона, система за превключване на колона, реактор след колона и друго оборудване.

Помпена система

Помпите доставят подвижната фаза към колоната с предварително определена скорост. Съставът на подвижната фаза и скоростта на потока могат да бъдат постоянни или да се променят по време на анализа. При постоянен състав на подвижната фаза процесът се нарича изократичен, а при втория - градиентен. Съвременната помпена система за течен хроматограф се състои от една или повече компютърно управлявани помпи. Това ви позволява да промените състава на мобилната фаза според конкретна програма по време на градиентно елуиране. Помпите за аналитична високоефективна течна хроматография позволяват поддържане на скоростта на потока на подвижната фаза в колоната в диапазона от 0,1 до 10 ml/min при входно налягане на колоната до 40 MPa. Пулсациите на налягането са сведени до минимум чрез специални амортисьори, включени в конструкцията на помпите. Работните части на помпите са изработени от устойчиви на корозия материали, което позволява използването на агресивни компоненти в състава на подвижната фаза.

Кранове

В смесителя се образува единична подвижна фаза от отделните разтворители, подавани от помпите, ако необходимата смес не е приготвена предварително. Смесването на компонентите на подвижната фаза в смесителя може да се осъществи както при ниско налягане (преди помпите), така и при високо налягане (след помпите). Смесителят може да се използва за приготвяне на мобилна фаза и изократно елуиране.

Обемът на миксера може да повлияе на времето на задържане на компонентите в градиентното елуиране.

Инжектори

Инжекторите могат да бъдат универсални, с възможност за промяна на обема на инжектираната проба, или дискретни за въвеждане на проба само с определен обем. И двата типа инжектори могат да бъдат автоматични („автоматични инжектори“ или „автоматични проби“). Инжекторът за проба (разтвор) се намира непосредствено пред хроматографската колона. Конструкцията на инжектора позволява да се промени посоката на потока на подвижната фаза и да се извърши предварително инжектиране на пробата в дозиращата верига с определен обем (обикновено от 10 до 100 µl) или в специална променлива устройство за дозиране на обем. Обемът на цикъла е посочен върху неговата маркировка. Конструкцията на дискретен инжектор, като правило, позволява подмяната на контура. Съвременните автоматични инжектори могат да имат редица допълнителни функции, например, те могат да служат като станция за подготовка на проби: смесват и разреждат пробите и извършват реакция на дериватизация преди колона.

Хроматографска колона

Хроматографските колони обикновено са тръби от неръждаема стомана, стъкло или пластмаса, пълни със сорбент и затворени от двете страни с филтри с диаметър на порите 2–5 µm. Дължината на аналитичната колона може да бъде в диапазона от 5 до 60 cm или повече, вътрешният диаметър е от 2 до 10 mm. При микроколонна хроматография се използват колони с вътрешен диаметър по-малък от 2 mm. Има и капилярни колони с вътрешен диаметър около 0,3–0,7 mm. Колоните за препаративна хроматография могат да имат вътрешен диаметър от 50 mm или повече.

Преди аналитичната колона могат да се монтират къси колони (предколони), които изпълняват различни спомагателни функции, основната от които е защитата на аналитичната колона. Обикновено анализът се извършва при стайна температура, но за повишаване на ефективността на разделяне и намаляване на продължителността на анализа може да се използва термостатиране на колоните при температури до 80–100 °C. Възможността за използване на повишена температура по време на разделяне е ограничена от стабилността на неподвижната фаза, тъй като нейното разрушаване е възможно при повишени температури.

Неподвижна фаза (сорбент)

Най-често използваните сорбенти са:

• силикагел, алуминиев оксид, се използват в нормална фазова хроматография. Механизмът на задържане в този случай обикновено е адсорбция;
• силикагел, смоли или полимери с присадени киселинни или основни групи. Обхват - йонообменна и йонна хроматография;
• силикагел или полимери с дадено разпределение на размера на порите (хроматография с изключване на размера);
• химически модифицирани сорбенти (сорбенти на свързана фаза), най-често приготвени на базата на силикагел. Механизмът на задържане е адсорбция или разпределение между подвижната и неподвижната фаза. Обхватът зависи от вида на присадените функционални групи. Някои видове сорбенти могат да се използват както в обърната, така и в нормална фазова хроматография;
• химически модифицирани хирални сорбенти, например целулоза и производни на амилоза, протеини и пептиди, циклодекстрини, хитозани, използвани за разделяне на енантиомери (хирална хроматография).

Сорбентите на свързаната фаза могат да имат различни степени на химическа модификация. Най-често използваните свързани фази са:

– октадецилови групи (сорбент октадецилсилан (ODS) или C 18);

– октилни групи (сорбент октилсилан или C 8);

– фенилови групи (фенилсиланов сорбент);

– цианопропилови групи (CN сорбент);

– аминопропилови групи (NH 2 сорбент);

– диолни групи (сорбент диол).

Най-често анализът се извършва върху неполярно свързани фази в режим на обратна фаза, като се използва C 18 сорбент.

Сорбентите на свързаната фаза на основата на силикагел са химически стабилни при стойности на рН от 2,0 до 7,0, освен ако не е посочено друго от производителя. Частиците на сорбента могат да имат сферична или неправилна форма и разнообразна порьозност. Размерът на частиците на сорбента при аналитичната високоефективна течна хроматография обикновено е 3–10 µm, при препаративната високоефективна течна хроматография е 50 µm или повече. Има и монолитни колони, в които сорбентът е монолит с проходни пори, който запълва целия обем на колоната.

Високата ефективност на разделяне се осигурява от голямата повърхност на частиците на сорбента (което е следствие от техния микроскопичен размер и наличието на пори), както и еднородността на състава на сорбента и неговата плътна и равномерна опаковка.

Детектори

При високоефективната течна хроматография се използват различни методи за откриване. В общия случай подвижната фаза с разтворените в нея компоненти след хроматографската колона навлиза в детекторната клетка, където непрекъснато се измерват едно или друго нейни свойства (абсорбция в ултравиолетовата или видимата област на спектъра, флуоресценция, пречупване индекс, електрическа проводимост и др.). Получената хроматограма е графика на зависимостта на някакъв физичен или физико-химичен параметър на подвижната фаза от времето.

Най-често срещаните детектори във високоефективната течна хроматография са спектрофотометрични. По време на елуирането на вещества в специално проектирана микроклетка, оптичната плътност на елуата се измерва при предварително избрана дължина на вълната. Широкият диапазон на линейност на детектора дава възможност да се анализират както примесите, така и основните компоненти на сместа на една хроматограма. Спектрофотометричният детектор позволява откриване при всяка дължина на вълната в рамките на неговия работен диапазон (обикновено 190-600 nm). Използват се също многовълнови детектори, които позволяват откриване на няколко дължини на вълната едновременно, и детектори с диодни масиви, които позволяват едновременно записване на оптична плътност в целия работен диапазон на дължина на вълната (обикновено 190–950 nm). Това прави възможно записването на спектрите на абсорбция на компонентите, преминаващи през детекторната клетка.

Флуориметричният детектор се използва за откриване на флуоресцентни съединения или нефлуоресцентни съединения под формата на техните флуоресцентни производни. Принципът на действие на флуориметричния детектор се основава на измерване на флуоресцентното излъчване на погълната светлина. Абсорбцията обикновено се извършва в ултравиолетовата област на спектъра, дължините на вълната на флуоресцентното лъчение надвишават дължините на вълната на погълнатата светлина. Флуорометричните детектори имат много висока чувствителност и селективност. Чувствителността на флуоресцентните детектори е приблизително 1000 пъти по-висока от тази на спектрофотометричните. Съвременните флуоресцентни детектори позволяват не само получаването на хроматограми, но и записването на спектрите на възбуждане и флуоресценция на анализираните съединения.

За да определите съединения, които слабо абсорбират в ултравиолетовите и видимите области на спектъра (например въглехидрати), използвайте рефрактометричендетектори (рефрактометри). Недостатъците на тези детектори са ниската (в сравнение със спектрофотометричните детектори) чувствителност и значителна температурна зависимост на интензитета на сигнала (детекторът трябва да бъде термостатиран), както и невъзможността да се използват в режим на градиентно елуиране.

Принцип на действие изпарителни лазерни детектори за разсейване на светлинасе основава на разликата в наляганията на парите на хроматографските разтворители, които съставляват подвижната фаза и анализираните вещества. Подвижната фаза на изхода на колоната се въвежда в пулверизатора, смесва се с азот или CO 2 и под формата на фино диспергиран аерозол постъпва в нагрята изпарителна тръба с температура 30–160 °C, в която мобилната фаза се изпарява. Аерозол от нелетливи частици от анализирани вещества разсейва светлинния поток в дисперсионната камера. По степента на дисперсия на светлинния поток може да се прецени количеството на определеното съединение. Детекторът е по-чувствителен от рефрактометричния, сигналът му не зависи от оптичните свойства на пробата, от вида на функционалните групи в аналитите, от състава на подвижната фаза и може да се използва в режим на градиентно елуиране .

Електрохимични детектори (кондуктометрични, амперометрични, кулометрични и др.). Амперометричен детектор се използва за откриване на електроактивни съединения, които могат да бъдат окислени или редуцирани на повърхността на твърд електрод. Аналитичният сигнал е величината на тока на окисление или редукция. Детекторната клетка има най-малко два електрода - работен електрод и референтен електрод (сребърен хлорид или стомана). Към електродите се прилага работен потенциал, чиято стойност зависи от естеството на определяните съединения. Измерванията могат да се извършват както при постоянен потенциал, така и в импулсен режим, когато профилът на промяната в потенциала на работния електрод се задава по време на един цикъл на регистрация на сигнала. Амперометричният детектор използва работни електроди, изработени от въглеродни материали (най-често стъкловъглерод или графит) и метал: платина, злато, мед, никел.

Кондуктометричен детектор се използва за откриване на аниони и катиони при йонна хроматография. Принципът на неговото действие се основава на измерване на електрическата проводимост на подвижната фаза по време на елуирането на вещество.

Изключително информативен е масспектрометричният детектор, който има висока чувствителност и селективност. Най-новите модели мас спектрометри за течна хроматография работят в m/z масов диапазон от 20 до 4000 amu.

Високоефективната течна хроматография също използва Фурие-IR детектори, радиоактивност и някои други.

Система за събиране и обработка на данни

Съвременната система за обработка на данни е персонален компютър, свързан към хроматографа с инсталиран софтуер, който ви позволява да регистрирате и обработвате хроматограмата, както и да контролирате работата на хроматографа и да наблюдавате основните параметри на хроматографската система.

мобилна фаза

Подвижната фаза при високоефективната течна хроматография изпълнява двойна функция: осигурява преноса на десорбирани молекули по колоната и регулира равновесните константи и следователно задържането в резултат на взаимодействие със стационарната фаза (да бъде сорбирана на повърхността). ) и с молекулите на веществата, които се отделят. По този начин, чрез промяна на състава на подвижната фаза при високоефективна течна хроматография, може да се повлияе на времето на задържане на съединенията, селективността и ефективността на тяхното разделяне.

Подвижната фаза може да се състои от един разтворител, често два, ако е необходимо, три или повече. Съставът на подвижната фаза е посочен като обемно съотношение на съставните й разтворители. В някои случаи може да се посочи масовото съотношение, което трябва да бъде специално предвидено. Като компоненти на подвижната фаза могат да се използват буферни разтвори с определена стойност на рН, различни соли, киселини и основи и други модификатори.

Нормалната фазова хроматография обикновено използва течни въглеводороди (хексан, циклохексан, хептан) и други относително неполярни разтворители с малки добавки от полярни органични съединения, които контролират силата на елуиране на подвижната фаза.

При обратнофазовата хроматография като подвижна фаза се използват вода или водно-органични смеси. Органичните добавки обикновено са полярни органични разтворители (ацетонитрил и метанол). За оптимизиране на разделянето могат да се използват водни разтвори с определена стойност на рН, по-специално буферни разтвори, както и различни добавки към подвижната фаза: фосфорна и оцетна киселини при отделяне на киселинни съединения; амоняк и алифатни амини при разделяне на основни съединения и други модификатори.

Чистотата на подвижната фаза силно влияе на хроматографския анализ, така че е за предпочитане да се използват разтворители, освободени специално за течна хроматография (включително вода).

Когато се използва UV спектрофотометричен детектор, подвижната фаза не трябва да има изразена абсорбция при дължината на вълната, избрана за откриване. Границата на прозрачност или оптична плътност при определена дължина на вълната на разтворителя на конкретен производител често е посочена на опаковката.

Подвижната фаза и анализираните разтвори не трябва да съдържат неразтворени частици и газови мехурчета. Водата, получена при лабораторни условия, водните разтвори, органичните разтворители, предварително смесени с вода, както и анализираните разтвори трябва да бъдат подложени на фино филтриране и дегазиране. За тези цели обикновено се използва вакуумна филтрация през мембранен филтър с размер на порите 0,45 μm, който е инертен спрямо даден разтворител или разтвор.

Списък на хроматографските условия, които трябва да бъдат посочени

Монографията трябва да съдържа: пълното търговско наименование на колоната, посочващо производителя и каталожен номер, размери на колоната (дължина и вътрешен диаметър), вид сорбент, посочващ размера на частиците, размера на порите, температурата на колоната (ако се изисква контрол на температурата) , обем на инжектираната проба (обемни контури), състав на подвижната фаза и метод на нейното приготвяне, скорост на подаване на мобилна фаза, тип детектор и условия на откриване (ако е необходимо, параметри на използваната детекторна клетка), описание на градиентния режим (ако използвани), включително етапа на повторно уравновесяване до изходни условия, време на хроматография, подробно описание на методологията и изчислителните формули, описания на приготвянето на стандартни и тестови разтвори.

Ако в автосемплера се използва дериватизация преди колона, се предоставя информация за програмата за автоматично семплер. В случай на използване на дериватизация след колона, се посочват скоростта на подаване на дериватизиращия реагент, обемът на смесителния цикъл и неговата температура.

Модифицирана високоефективна течна хроматография

Йонно-двойна хроматография

Една от разновидностите на обратнофазовата високоефективна течна хроматография е йонната двойна хроматография - която ви позволява да определяте йонизирани съединения. За това хидрофобни органични съединения с йоногенни групи (реагенти с йонни двойки) се добавят към традиционната обратнофазова високоефективна течна хроматография на подвижната фаза. Натриевите алкил сулфати обикновено се използват за разделяне на основи, тетраалкиламониевите соли (тетрабутиламониев фосфат, цетилтриметиламониев бромид и др.) се използват за разделяне на киселини. В режим на йонна двойка селективността на разделяне на нейонните компоненти ще бъде ограничена от механизма на задържане с обърната фаза, докато задържането на основи и киселини се увеличава значително, докато формата на хроматографските пикове се подобрява.

Задържането в режим на йонна двойка се дължи на доста сложни равновесни процеси, които се конкурират един с друг. От една страна, поради хидрофобните взаимодействия и ефекта на изместване на полярната среда на подвижната фаза, сорбцията на хидрофобни йони върху повърхността на алкил силикагел е възможна по такъв начин, че заредените групи да са обърнати към подвижната фаза. В този случай повърхността придобива йонообменни свойства, а задържането се подчинява на законите на йонообменната хроматография. От друга страна е възможно образуването на йонна двойка директно в обема на елуента, последвано от нейната сорбция върху сорбента по обратнофазовия механизъм.

Хроматография с хидрофилно взаимодействие ( HILIC хроматография)

Хроматографията с хидрофилно взаимодействие се използва за разделяне на полярни съединения, които са слабо задържани при високоефективна течна хроматография с обратна фаза. Като подвижна фаза в този вариант на хроматография се използват смеси вода-ацетонитрил с добавяне на соли, киселини или основи. Стационарните фази, като правило, са силикагелове, модифицирани с полярни групи (амино, диол, цианопропилови групи и др.). По-полярните съединения се държат по-силно. Елуиращата сила на подвижната фаза се увеличава с увеличаване на полярността.

Йонообменна и йонна високоефективна течна хроматография

Йонообменната хроматография се използва за анализиране както на органични (хетероциклични основи, аминокиселини, протеини и др.), така и на неорганични (различни катиони и аниони) съединения. Разделянето на компонентите на анализираната смес в йонообменната хроматография се основава на обратимо взаимодействие на йоните на анализираните вещества с йонообменните групи на сорбента. Тези сорбенти са главно или полимерни йонообменни смоли (обикновено кополимери на стирен и дивинилбензен с присадени йонообменни групи) или силикагелове с присадени йонообменни групи. Сорбенти с групи: -NH 3 +, -R 3 N +, -R 2 HN +, -RH 2 N + и др. се използват за разделяне на аниони (аниони), а сорбенти с групи: -SO 3 -, - RSO 3 -, -COOH, -PO 3 - и други за разделяне на катиони (катионообменници).

Като подвижна фаза в йонообменната хроматография се използват водни разтвори на киселини, основи и соли. Обикновено буферните разтвори се използват за поддържане на определени стойности на рН. Възможно е също да се използват малки добавки от смесващи се с вода органични разтворители - ацетонитрил, метанол, етанол, тетрахидрофуран.

Йонна хроматография - вариант на йонообменна хроматография, при който се използва кондуктометричен детектор за откриване на аналити (йони). За високочувствително определяне на промените в проводимостта на подвижната фаза, преминаваща през детектора, фоновата проводимост на подвижната фаза трябва да е ниска.

Има два основни варианта на йонната хроматография.

Първата от тях, двуколонна йонна хроматография, се основава на потискането на електрическата проводимост на електролита с подвижна фаза с помощта на втора йонообменна колона или специална мембранна система за потискане, разположена между аналитичната колона и детектора. При преминаване през системата електрическата проводимост на подвижната фаза намалява.

Вторият вариант на йонната хроматография е йонната хроматография с една колона. Този вариант използва подвижна фаза с много ниска електрическа проводимост. Като електролити са широко използвани слаби органични киселини: бензоена, салицилова или изофталова.

Високоефективна течна хроматография с изключване на размери

Хроматографията с изключване на размера (гел хроматография) е специална версия на високоефективна течна хроматография, базирана на разделянето на молекулите по техния размер. Разпределението на молекулите между неподвижната и подвижната фаза се основава на размера на молекулите и отчасти на тяхната форма и полярност.

Възможни са два ограничаващи типа взаимодействие на молекули с пореста неподвижна фаза. Молекулите, по-големи от максималния диаметър на порите, изобщо не се задържат и първо се елуират, движейки се заедно с подвижната фаза. Молекули с размери, по-малки от минималния диаметър на порите на сорбента, свободно проникват в порите и последните се елуират от колоната. Останалите молекули, които имат междинни размери, се задържат частично в порите и по време на елуирането се разделят на фракции в съответствие с техните размери и частично формата, проникват в порите на сорбента, в зависимост от размера и частично , в зависимост от формата им. В резултат на това веществата се елуират с различно време на задържане.

Хроматография за изключване на йони

Механизмът на йонно-изключващата хроматография се основава на ефекта, в резултат на което съединенията в йонизирана форма не се задържат върху йонообменния сорбент, докато съединенията в молекулярна форма се разпределят между неподвижната и водната фаза вътре в порите на йонообменния сорбент и подвижната фаза, мигрираща в пространството между частиците на сорбента. Разделянето се основава на електростатично отблъскване, полярни и хидрофобни взаимодействия между разтворените съединения и сорбента.

Анионните групи на повърхността на сорбента действат като полупропусклива "мембрана" между неподвижната и подвижната фаза. Отрицателно заредените компоненти не достигат до стационарната подвижна фаза, тъй като се отблъскват от подобно заредени функционални групи и се елуират в "мъртвия" (свободен) обем на колоната. Компонентите в молекулярна форма не се „отхвърлят“ от катионообменния сорбент и се разпределят между неподвижната и подвижната фаза. Разликата в степента на задържане на нейонните компоненти на сместа е продиктувана от комбинацията от полярни взаимодействия на нейонните компоненти с функционалните групи на катионообменния сорбент и хидрофобни взаимодействия на нейонните компоненти с нейонните компоненти. -полярна сорбентна матрица.

Хирална хроматография

Целта на хиралната хроматография е да раздели оптичните изомери. Разделянето се извършва върху хирални стационарни фази или върху конвенционални ахирални стационарни фази, като се използват хирални подвижни фази. Като хирални стационарни фази се използват сорбенти с модифицирана повърхност, групи или вещества с хирални центрове (хитозани, циклодекстрини, полизахариди, протеини и др. (хирални селектори). В този случай като подвижни фази могат да се използват същите фази, както в нормална фаза или хроматография с обърната фаза. При използване на ахирални стационарни фази за осигуряване на разделяне на енантиомери, към подвижните фази се добавят хирални модификатори: хирални метални комплекси, неутрални хирални лиганди, хирални реагенти на йонни двойки и др.

Ултраефективна течна хроматография

Ултраефективната течна хроматография е вариант на течна хроматография, който е по-ефективен от класическата високоефективна течна хроматография.

Характеристика на ултраефективната течна хроматография е използването на сорбенти с размер на частиците от 1,5 до 2 µm. Хроматографските колони обикновено са с дължина от 50 до 150 mm и диаметър от 1 до 4 mm. Обемът на инжектираната проба може да бъде от 1 до 50 µl. Използването на такива хроматографски колони може значително да намали времето за анализ и да подобри ефективността на хроматографското разделяне. В този случай обаче налягането върху колоната може да достигне 80–120 MPa, необходимата честота на събиране на данни от детектора може да се увеличи до 40–100 Hz, а обемът извън колоната на хроматографската система трябва да бъде сведен до минимум. Хроматографското оборудване и колоните, използвани в ултраефективната течна хроматография, са специално адаптирани да отговарят на изискванията на този тип хроматография.

Оборудването, предназначено за ултраефективна течна хроматография, може да се използва и в класическата високоефективна течна хроматография.

(главно междумолекулни) на интерфейса. Като метод за анализ HPLC е част от група методи, която поради сложността на изследваните обекти включва предварителното разделяне на първоначалната сложна смес на относително прости. Получените прости смеси след това се анализират чрез конвенционални физикохимични методи или чрез специални методи, разработени за хроматография.

HPLC методът се използва широко в области като химия, нефтохимия, биология, биотехнология, медицина, хранителна обработка, опазване на околната среда, производство на лекарства и много други.

Според механизма на разделяне на анализираните или отделените вещества HPLC се разделя на адсорбционна, разпределителна, йонообменна, изключване, лиганообменна и др.

Трябва да се има предвид, че в практическата работа разделянето често протича не по един, а по няколко механизма едновременно. Така че разделянето на изключване може да бъде усложнено от адсорбционни ефекти, адсорбция - разпределение и обратно. В същото време, колкото по-голяма е разликата в веществата в пробата по отношение на степента на йонизация, основност или киселинност, по отношение на молекулното тегло, поляризуемостта и други параметри, толкова по-вероятно е различен механизъм на разделяне да се появяват за такива вещества.

Нормална фаза HPLC

Стационарната фаза е по-полярна от подвижната фаза, така че неполярният разтворител преобладава в състава на елуента:

• Хексан:изопропанол = 95:5 (за нискополярни вещества)
• Хлороформ:метанол = 95:5 (за средно полярни вещества)
• Хлороформ:метанол = 80:20 (за силно полярни вещества)

HPLC с обратна фаза

Неподвижната фаза е по-малко полярна от подвижната фаза, така че водата почти винаги присъства в елуента. В този случай винаги е възможно да се осигури пълно разтваряне на BAS в подвижната фаза, почти винаги е възможно да се използва UV детекция, почти всички мобилни фази се смесват взаимно, може да се използва градиентно елуиране, колоната може бързо да се повторно -уравновесена, колоната може да бъде регенерирана.

Обичайните елуенти за HPLC с обратна фаза са:

• Ацетонитрил: вода
• метанол: вода
• Изопропанол: вода

Матрици за HPLC

Матриците, използвани в HPLC, са неорганични съединения като силициев диоксид (силикагел) или алуминиев оксид, или органични полимери като полистирол (омрежен с дивинилбензен) или полиметакрилат. Силикагелът, разбира се, вече е общоприет.

Основните характеристики на матрицата:

• Размер на частиците (µm);
• Размер на вътрешните пори (Å, nm).

Получаване на силикагел за HPLC:

1. Образуване на микросфери от полисилициева киселина;
2. Сушене на частици силикагел;
3. Въздушно разделяне.

Сорбентни частици:

• Редовни (сферични): по-висока устойчивост на налягане, по-висока цена;
• Несферичен: по-ниска устойчивост на налягане.

Размерът на порите при HPLC е един от най-важните параметри. Колкото по-малък е размерът на порите, толкова по-лоша е тяхната пропускливост за молекулите на елуираните вещества. И следователно, толкова по-лоша е сорбционната способност на сорбентите. Колкото по-големи са порите, толкова по-ниска е, първо, механичната стабилност на частиците на сорбента и, второ, колкото по-малка е сорбционната повърхност, следователно, толкова по-лоша е ефективността.

Присадки от стационарна фаза

Нормална фаза HPLC:

• Неподвижна фаза, присадена с пропилнитрил (нитрил);
• Стационарна фаза с присаждане на пропиламин (амин).

HPLC с обратна фаза:

• Неподвижна фаза с алкилова присадка;
• Неподвижна фаза с алкилсилил присадка.

End-capping - защита на неприсадени участъци от сорбента чрез допълнително присаждане с "малки" молекули. Хидрофобно крайно затваряне (C1, C2): по-висока селективност, по-лоша омокряемост; хидрофилно крайно затваряне (диол): по-ниска селективност, по-висока омокряемост.

HPLC детектори

• UV
• диодна решетка
• Флуоресцентни
• Електрохимични
• Рефрактометричен
• масово селективни

Връзки

Фондация Уикимедия. 2010 г.

Вижте какво представлява "Високопроизводителна течна хроматография" в други речници:

високоефективна Течна хроматография- - [А.С. Голдбърг. Английски руски енергиен речник. 2006] Теми енергия като цяло EN високоефективна течна хроматографияHPLC … Наръчник за технически преводач

Термин високоефективна течна хроматография Английски термин високоефективна течна хроматография Синоними Съкращения HPLC, HPLC Свързани термини адсорбция, олигопептид, протеомика, сорбент, фулерен, ендоедрален, хроматография… …

Течна хроматография, за да се увеличи ефективността на разделяне, разтворителят (елуентът) под налягане (повече от 3x107 Pa) се изпомпва през колони, пълни със сорбент с частици с малък диаметър (до 1 μm), и перфузия ... ...

Тип хроматография, при която течността (елуентът) служи като подвижна фаза и е неподвижна фаза. сорбент, тв. носител с течност или гел, нанесен върху повърхността му. Извършва се в колона, пълна със сорбент (колонна хроматография), върху плосък ... ... Естествени науки. енциклопедичен речник

- [κρώμα (υroma) цвят] процес, основан на неравномерната способност на отделните компоненти на сместа (течни или газообразни) да се задържат върху повърхността на адсорбента както когато се абсорбират от потока носител, така и когато .. .... Геологическа енциклопедия

- (от други гръцки ... Wikipedia

Термин хроматография Английски термин хроматография Синоними Съкращения Свързани термини високоефективна течна хроматография, клатрат, лаборатория върху чип, порозиметрия, протеома, протеомика, сорбент, ензим, фулерен, ендоедрал… … Енциклопедичен речник по нанотехнологии

Течна хроматография на базата на разл. способността на отделените йони да обменят йони с фиксирани. сорбентни йони, образувани в резултат на дисоциацията на йоногенните групи на последните. Катионообменниците се използват за разделяне на катиони, за ... ... Химическа енциклопедия

HPLC- високоефективна Течна хроматография ... Речник на съкращенията на руския език

Високоефективната течна хроматография (HPLC) е един от ефективните методи за разделяне на сложни смеси от вещества, който се използва широко както в аналитичната химия, така и в химическата технология. Основата на хроматографското разделяне е участието ... Wikipedia

Книги

• Практическа високоефективна течна хроматография, Вероника Р. Майер. Представяме на читателя 5-то издание на книгата, което е допълнено със съвременни методи и оборудване. Много е подобрено в книгата и са добавени голям брой препратки. Местата в текста, където...