Малки РНК и рак. Големи сделки с малки молекули: как малките РНК организират бактериалните гени Малки РНК

В живата клетка потокът от информация между ядрото и цитоплазмата никога не пресъхва, но разбирането на всичките му „вихри“ и дешифрирането на информацията, кодирана в него, е наистина херкулесова задача. Един от най-важните пробиви в биологията на миналия век може да се счита за откриването на информационни (или матрични) РНК (mRNA или mRNA) молекули, които служат като посредници, пренасящи информационни „съобщения“ от ядрото (от хромозомите) до цитоплазмата . Решаващата роля на РНК в протеиновия синтез е предсказана още през 1939 г. в работата на Торбьорн Касперсон ( Торбьорн Касперсон), Жан Браше ( Жан Браше) и Джак Шулц ( Джак Шулц), а през 1971 г. Джордж Марбейс ( Джордж Марбе) задейства синтеза на хемоглобин в жабешки ооцити чрез инжектиране на първата изолирана заешка информационна РНК, кодираща този протеин.

През 1956–1957 г. в Съветския съюз А. Н. Белозерски и А. С. Спирин независимо един от друг доказаха съществуването на иРНК и също така установиха, че по-голямата част от РНК в клетката не е матрица, а рибозомна РНК(рРНК). Рибозомната РНК - вторият "основен" тип клетъчна РНК - образува "скелета" и функционалния център на рибозомите във всички организми; Именно rRNA (а не протеините) регулира основните етапи на протеиновия синтез. В същото време е описан и изследван третият „основен“ тип РНК - трансферни РНК (тРНК), които в комбинация с други две - иРНК и рРНК - образуват един протеин-синтезиращ комплекс. Според доста популярната хипотеза за „света на РНК“ именно тази нуклеинова киселина лежи в началото на живота на Земята.

Поради факта, че РНК е значително по-хидрофилна в сравнение с ДНК (поради заместването на дезоксирибозата с рибоза), тя е по-лабилна и може да се движи относително свободно в клетката и следователно доставя краткотрайни реплики генетична информация(mRNA) до мястото, където започва протеиновият синтез. Заслужава обаче да се отбележи „неудобството“, свързано с това - РНК е много нестабилна. Съхранява се много по-лошо от ДНК (дори вътре в клетката) и се разгражда при най-малката промяна на условията (температура, pH). В допълнение към „собствената“ нестабилност, голям принос принадлежи на рибонуклеазите (или РНКазите) - клас РНК-разцепващи ензими, които са много стабилни и „вездесъщи“ - дори кожата на ръцете на експериментатора съдържа достатъчно от тези ензими, за да отхвърли целия експеримент. Поради това работата с РНК е много по-трудна, отколкото с протеини или ДНК - последните обикновено могат да се съхраняват в продължение на стотици хиляди години без практически никакви щети.

Фантастични грижи по време на работа, тридестилат, стерилни ръкавици, лабораторни съдове за еднократна употреба - всичко това е необходимо, за да се предотврати разграждането на РНК, но поддържането на такива стандарти не винаги е било възможно. Следователно, дълго време те просто не обръщат внимание на късите „фрагменти“ на РНК, които неизбежно замърсяват разтворите. С течение на времето обаче стана ясно, че въпреки всички усилия за поддържане на стерилността на работната зона, „отломките“ естествено продължават да се откриват и след това се оказва, че хиляди къси двойноверижни РНК винаги присъстват в цитоплазмата , изпълняващи много специфични функции и са абсолютно необходими за нормалното развитие на клетките и организма.

Принцип на РНК интерференция

Фармацевтите също се интересуват от възможността за използване на siPHK, тъй като способността за специфично регулиране на функционирането на отделните гени обещава безпрецедентни перспективи при лечението на множество заболявания. Малък размер и висока специфичност на действие обещават висока ефикасност и ниска токсичност на лекарства, базирани на siRNA; все пак реши проблема доставка siRNA към болните клетки в тялото все още не е успешна - това се дължи на крехкостта и крехкостта на тези молекули. И въпреки че десетки екипи сега се опитват да намерят начин да насочат тези „магически куршуми“ точно към целта (вътре в болните органи), те все още не са постигнали видим успех. Освен това има и други трудности. Например, в случай на антивирусна терапия, високата селективност на действието на siRNA може да бъде лоша услуга - тъй като вирусите бързо мутират, модифицираният щам много бързо ще загуби чувствителност към siRNA, избрана в началото на терапията: известно е, че заместването само на един нуклеотид в siRNA води до значително намаляване на ефекта на интерференция.

В този момент си струва да си припомним отново - бяха открити siPHK само в растения, безгръбначни и едноклетъчни организми; Въпреки че хомолози на протеини за РНК интерференция (Dicer, RISC комплекс) също присъстват при висши животни, siPHK не са открити чрез конвенционални методи. Каква изненада беше, когато изкуствено въведенисинтетичните аналози на siRNA предизвикват силен специфичен дозозависим ефект в клетъчни култури от бозайници! Това означава, че в клетките на гръбначните животни РНК интерференцията не е заменена от по-сложни имунни системи, а е еволюирала заедно с организмите, превръщайки се в нещо по-„напреднало“. Следователно при бозайниците е било необходимо да се търсят не точни аналози на siPHK, а техните еволюционни наследници.

Играч №2 - микроРНК

Всъщност, въз основа на еволюционно доста древния механизъм на РНК интерференция, две специализирани системи за контролиране на работата на гените се появяват в по-развитите организми, всяка използваща своя собствена група от малки РНК - микроРНК(микроРНК) и пиРНК(piPHK, Piwi-взаимодействаща РНК). И двете системи се появяват в гъбите и кишечнополовите животни и се развиват заедно с тях, измествайки siPHK и механизма на "голата" РНК интерференция. Тяхната роля в осигуряването на имунитет намалява, тъй като тази функция е поета от по-напреднали механизми на клетъчния имунитет, по-специално интерфероновата система. Тази система обаче е толкова чувствителна, че задейства и самата siPHK: появата на малка двойноверижна РНК в клетка на бозайник задейства „алармен сигнал“ (активира секрецията на интерферон и предизвиква експресията на интерферон-зависими гени, които блокира напълно всички процеси на превод). В тази връзка механизмът на РНК интерференция при висшите животни се медиира главно от микроРНК и пиРНК - едноверижни молекули със специфична структура, които не се откриват от интерфероновата система.

Тъй като геномът стана по-сложен, микроРНК и пиРНК започнаха да участват все повече в регулирането на транскрипцията и транслацията. С течение на времето те се превърнаха в допълнителна, прецизна и фина система за регулиране на генома. За разлика от siPHK, микроРНК и пиРНК (открити през 2001 г., вижте каре 3) не се произвеждат от чужди двойноверижни РНК молекули, а първоначално са кодирани в генома на гостоприемника.

Запознайте се с: микроРНК

Прекурсорът на микроРНК се транскрибира от двете вериги на геномна ДНК от РНК полимераза II, което води до появата на междинна форма - pri-microRNA - която носи характеристиките на обикновената иРНК - m 7 G-cap и polyA опашка. Този прекурсор образува примка с две едноверижни „опашки“ и няколко несдвоени нуклеотида в центъра (фиг. 3). Такава бримка претърпява двуетапна обработка (фиг. 4): първо, ендонуклеазата Drosha отрязва „опашките“ на едноверижна РНК от фибичката, след което изрязаната фибичка (предмикроРНК) се изнася в цитоплазмата, където се разпознава от Dicer, който прави още два разреза (изрязва се двуверижен участък, означен с цвят на фиг. 3). В тази форма зрялата микроРНК, подобна на siRNA, е включена в RISC комплекса.

Фигура 3. Структура на двуверижна микроРНК прекурсорна молекула.Основни характеристики: наличие на запазени последователности, които образуват фиби; наличието на комплементарно копие (микроРНК*) с два „допълнителни“ нуклеотида в 3′ края; специфична последователност (2-8 bp), която образува място за разпознаване на ендонуклеази. Самата микроРНК е подчертана в червено - това е, което Dicer изрязва.

Механизмът на действие на много микроРНК е подобен на действието на siRNA: къса (21-25 нуклеотида) едноверижна РНК като част от протеиновия комплекс RISC се свързва с висока специфичност към комплементарното място в 3' нетранслираната област на прицелна иРНК. Свързването води до разцепване на иРНК от Ago протеина. Въпреки това, активността на микроРНК (в сравнение с siRNA) вече е по-диференцирана - ако комплементарността не е абсолютна, целевата иРНК може да не бъде разградена, а само обратимо блокирана (няма да има транслация). Може да се използва и същият RISC комплекс изкуствено въведени siRNA. Това обяснява защо siPHK, направени по аналогия с протозоите, също са активни при бозайници.

По този начин можем да допълним илюстрацията на механизма на действие на РНК интерференция във висши (двустранно симетрични) организми, като комбинираме в една фигура диаграмата на действие на микроРНК и биотехнологично въведените siRNA (Фиг. 5).

Фигура 5. Обобщена схема на действие на изкуствени микроРНК и siRNA(изкуствените siRNA се въвеждат в клетката с помощта на специализирани плазмиди - насочен към siRNA вектор).

Функции на микроРНК

Физиологичните функции на микроРНК са изключително разнообразни - всъщност те действат като основни непротеинови регулатори на онтогенезата. микроРНК не анулират, а допълват „класическата“ схема на генна регулация (индуктори, супресори, уплътняване на хроматин и др.). В допълнение, синтезът на самите микроРНК е сложно регулиран (определени групи от микроРНК могат да бъдат активирани от интерферони, интерлевкини, фактор на туморна некроза α (TNF-α) и много други цитокини). В резултат на това се появява многостепенна мрежа от настройка на „оркестър“ от хиляди гени, удивителна по своята сложност и гъвкавост, но това не свършва дотук.

микроРНК са по-„универсални“ от siRNA: „отделните“ гени не трябва да бъдат 100% допълващи се - регулирането също се извършва чрез частично взаимодействие. Днес една от най-горещите теми в молекулярната биология е търсенето на микроРНК, които действат като алтернативни регулатори на известни физиологични процеси. Например, вече са описани микроРНК, участващи в регулирането на клетъчния цикъл и апоптозата в растения, дрозофила и нематоди; при хората микроРНК регулират имунната система и развитието на хемопоетични стволови клетки. Използването на базирани на биочип технологии (скрининг на микроматрици) показа, че цели групи от малки РНК се включват и изключват на различни етапи от живота на клетката. Идентифицирани са десетки специфични микроРНК за биологични процеси, чието ниво на експресия при определени условия се променя хиляди пъти, което подчертава изключителната контролируемост на тези процеси.

Доскоро се смяташе, че микроРНК само потискат - напълно или частично - работата на гените. Наскоро обаче се оказа, че действието на микроРНК може да се различава коренно в зависимост от състоянието на клетката! В активно деляща се клетка микроРНК се свързва с комплементарна последователност в 3' областта на иРНК и инхибира протеиновия синтез (транслация). Но в състояние на покой или стрес (например при отглеждане в лоша среда), същото събитие води до точно обратния ефект – повишен синтез на целевия протеин!

Еволюция на микроРНК

Броят на разновидностите на микроРНК във висшите организми все още не е напълно установен - според някои данни той надхвърля 1% от броя на кодиращите протеини гени (при хората например казват, че има 700 микроРНК и това число е постоянно расте). микроРНК регулират активността на около 30% от всички гени (мишените за много от тях все още не са известни) и има както повсеместни, така и тъканно-специфични молекули - например, един такъв важен набор от микроРНК регулира узряването на кръвния ствол клетки.

Широкият профил на експресия в различни тъкани на различни организми и биологичното разпространение на микроРНК показват еволюционно древен произход. МикроРНК бяха открити за първи път в нематоди и дълго време се смяташе, че тези молекули се появяват само в гъби и кишечни червеи; но по-късно те са открити в едноклетъчни водорасли. Интересното е, че тъй като организмите стават по-сложни, броят и хетерогенността на miRNA пула също се увеличава. Това индиректно показва, че сложността на тези организми се осигурява по-специално от функционирането на микроРНК. Възможната еволюция на miRNAs е показана на фигура 6.

Фигура 6. Разнообразие на микроРНК в различни организми.Колкото по-висока е организацията на организма, толкова повече микроРНК се намират в него (числото в скоби). Видовете, в които са открити, са маркирани в червено. единиченмикроРНК.

Може да се очертае ясна еволюционна връзка между siRNA и microRNA въз основа на следните факти:

• действието на двата вида е взаимозаменяемо и се медиира от хомоложни протеини;
• siPHK, въведени в клетките на бозайниците, специално „изключват“ желаните гени (въпреки известно активиране на интерфероновата защита);
• микроРНК се откриват във все по-древни организми.

Тези и други данни предполагат произхода на двете системи от общ „прародител“. Интересно е също така да се отбележи, че "РНК" имунитетът като независим предшественик на протеинови антитела потвърждава теорията за произхода на първите форми на живот, базирани на РНК, а не на протеини (припомнете си, че това е любимата теория на академик A.S. Spirin) .

Колкото по-напред отивате, толкова по-объркващо става. Играч #3 - piRNA

Докато имаше само двама „играчи“ на арената на молекулярната биология – siRNA и microRNA – основната „цел“ на РНК интерференцията изглеждаше напълно ясна. Наистина: набор от хомоложни къси РНК и протеини в различни организми извършва подобни действия; С усложняването на организмите се увеличава и функционалността.

Но в процеса на еволюция природата създава друга, еволюционно най-нова и високоспециализирана система, базирана на същия успешен принцип на РНК интерференция. Говорим за пиРНК (piRNA, от Piwi-взаимодействаща РНК).

Колкото по-сложно е организиран геномът, толкова по-развит и адаптиран е организмът (или обратното? ;-). Увеличаването на сложността на генома обаче има и обратна страна: става сложна генетична система нестабилен. Това води до необходимостта от механизми, отговорни за поддържането на целостта на генома - в противен случай спонтанното "смесване" на ДНК просто ще го деактивира. Мобилни генетични елементи ( MGE) - един от основните фактори за нестабилност на генома - са къси нестабилни области, които могат да бъдат автономно транскрибирани и мигриращи в целия геном. Активирането на такива преносими елементи води до многократни прекъсвания на ДНК в хромозомите, което може да има фатални последици.

Броят на MGE нараства нелинейно с размера на генома и тяхната активност трябва да бъде ограничена. За да направят това, животните, като се започне от кишечнополостните, използват същия феномен на РНК интерференция. Тази функция изпълняват и късите РНК, но не тези, за които вече стана дума, а трети вид от тях – пиРНК.

„Портрет“ на piRNA

Функции на piRNA

Основната функция на piRNA е да потиска активността на MGE на нивото на транскрипция и транслация. Смята се, че piRNAs са активни само по време на ембриогенезата, когато непредсказуемото разместване на генома е особено опасно и може да доведе до смъртта на ембриона. Това е логично - когато имунната система все още не е започнала да работи, клетките на ембриона се нуждаят от проста, но ефективна защита. Ембрионът е надеждно защитен от външни патогени от плацентата (или черупката на яйцето). Но в допълнение към това е необходима защита и от ендогенни (вътрешни) вируси, предимно MGE.

Тази роля на piRNA е потвърдена от опита - „нокаут“ или мутации на гените Ago3, Piwi или Aub водят до сериозни нарушения в развитието (и рязко увеличаване на броя на мутациите в генома на такъв организъм), а също и причиняват безплодие поради нарушаване на развитието на зародишните клетки.

Разпределение и еволюция на piPHK

Първите piRNAs вече се намират в морски анемонии и гъби. Растенията очевидно са поели по различен път - в тях не са открити протеини Piwi, а ролята на „муцуна“ за транспозони се изпълнява от ендонуклеазата Ago4 и siRNA.

При висшите животни - включително хората - piRNA системата е много добре развита, но може да се намери само в ембрионални клетки и в амниотичния ендотел. Защо разпространението на piRNA в тялото е толкова ограничено, остава да се види. Може да се предположи, че като всяко мощно оръжие, piRNAs са полезни само при много специфични условия (по време на вътреутробното развитие), а в организма на възрастните тяхната активност ще причини повече вреда, отколкото полза. Все пак броят на piRNAs е с порядък по-голям от броя на известните протеини и неспецифичните ефекти на piRNAs в зрели клетки са трудни за прогнозиране.

Заключение

В заключение бих искал да предоставя таблица, илюстрираща еволюцията на протеиновия апарат, участващ в РНК интерференцията (фиг. 9). Вижда се, че протозоите имат най-развитата siRNA система (протеинови семейства Ago, Dicer) и тъй като организмите стават по-сложни, акцентът се измества към по-специализирани системи - броят на протеиновите изоформи за микроРНК (Drosha, Pasha) и piRNA ( Piwi, Hen1) се увеличава. В същото време разнообразието от ензими, които медиират действието на siRNA, намалява.

Фигура 9. Разнообразие от протеини, участващи в РНК интерференция(числата показват броя на протеините от всяка група). Синелементи, характерни за siRNA и microRNA, са подчертани и червен- протеини Исвързани с piRNA.

Феноменът на РНК интерференцията започна да се използва от най-простите организми. Въз основа на този механизъм природата създава прототип на имунната система и с усложняването на организмите РНК интерференцията се превръща в незаменим регулатор на активността на генома. Два различни механизма плюс три вида къси РНК ( см.раздел. 1) - в резултат на това виждаме хиляди фини регулатори на различни метаболитни и генетични пътища. Тази поразителна картина илюстрира гъвкавостта и еволюционната адаптация на молекулярната биологични системи. Късите РНК отново доказват, че в клетката няма "малки неща" - има само малки молекули, пълното значение на чиято роля едва започваме да разбираме.

(Вярно, такава фантастична сложност предполага по-скоро, че еволюцията е „сляпа“ и действа без предварително одобрено „ главен план» »;

Учените смятат, че неправилната експресия на малки РНК е една от причините за редица заболявания, които сериозно засягат здравето на много хора по света. Тези заболявания включват сърдечно-съдови 23 и рак 24 . Що се отнася до последното, това не е изненадващо: ракът показва аномалии в развитието на клетките и тяхната съдба, а малките РНК играят критична роля в съответните процеси. Ето един от най-значимите примери за огромното въздействие, което малките РНК имат върху тялото по време на рак. Говорим за злокачествен тумор, който се характеризира с неправилна експресия на онези гени, които действат по време на първоначалното развитие на организма, а не в постнаталния период. Това е вид детски мозъчен тумор, който обикновено се появява преди двегодишна възраст. За съжаление, това е много агресивна форма на рак и прогнозата тук е неблагоприятна дори при интензивно лечение. Онкологичният процес се развива поради неправилно преразпределение на генетичния материал в мозъчните клетки. Промотор, който обикновено задвижва силна експресия на един от протеин-кодиращите гени, претърпява рекомбинация със специфичен клъстер от малки РНК. След това целият този пренареден регион претърпява амплификация: с други думи, в генома се създават много негови копия. Следователно, малките РНК, разположени "надолу по веригата" на преместения промотор, се експресират много по-силно, отколкото би трябвало да бъдат. Нивото на активните малки РНК е приблизително 150-1000 пъти по-високо от нормалното.

Ориз. 18.3.Малките РНК, активирани от алкохол, могат да се комбинират с информационни РНК, които не влияят на устойчивостта на тялото към ефектите на алкохола. Но тези малки РНК не се свързват с информационните РНК молекули, които насърчават такава резистентност. Това води до относително преобладаване на съотношението на информационните РНК молекули, кодиращи протеинови вариации, свързани с алкохолната толерантност.

Този клъстер кодира повече от 40 различни малки РНК. Всъщност това обикновено е най-големият от подобни клъстери, открити при примати. Обикновено се проявява само в началото на човешкото развитие, през първите 8 седмици от ембрионалния живот. Силното му активиране в мозъка на бебето води до катастрофални ефекти върху генетичната експресия. Една последица е експресията на епигенетичен протеин, който добавя модификации към ДНК. Това води до широко разпространени промени в целия модел на метилиране на ДНК и следователно до анормална експресия на всички видове гени, много от които трябва да се експресират само когато незрелите мозъчни клетки се делят по време на ранните етапи на развитие. Ето как програмата за рак започва в клетките на бебето 25.

Такава комуникация между малки РНК и епигенетичната машина на клетката може да има значително въздействие върху други ситуации, когато клетките развият предразположение към рак. Този механизъм вероятно води до ефекта на прекъсване на експресията на малка РНК, който се засилва от промени в епигенетичните модификации, които се предават на дъщерните клетки от майката. Това може да създаде модел на потенциално опасни промени в модела на генната експресия.

Досега учените не са разбрали всички етапи на взаимодействие на малки РНК с епигенетични процеси, но все още могат да получат някои намеци за характеристиките на случващото се. Например, оказа се, че определен клас малки РНК, които повишават агресивността на рака на гърдата, са насочени към определени ензими в информационните РНК, които премахват ключови епигенетични модификации. Това променя модела на епигенетичните модификации в раковата клетка и допълнително нарушава генетичната експресия 26 .

Много форми на рак са трудни за проследяване при пациент. Онкологичните процеси могат да възникнат на труднодостъпни места, което усложнява процедурата за вземане на проби. В такива случаи за лекаря не е лесно да проследи развитието на раковия процес и отговора на лечението. Често лекарите са принудени да разчитат на индиректни измервания - да речем, томографско сканиране на тумор. Някои изследователи смятат, че малки РНК молекули могат да помогнат за създаването на нова техника за наблюдение на развитието на тумора, която също може да изследва неговия произход. Когато раковите клетки умират, малки РНК напускат клетката, когато тя се разкъса. Тези малки ненужни молекули често образуват комплекси с клетъчни протеини или са обвити във фрагменти от клетъчни мембрани. Поради това те са много стабилни в телесните течности, което означава, че такива РНК могат да бъдат изолирани и анализирани. Тъй като количествата им са малки, изследователите ще трябва да използват много чувствителни методи за анализ. Тук обаче нищо не е невъзможно: чувствителността на последователността нуклеинова киселинапостоянно се увеличава 27. Бяха публикувани данни, потвърждаващи обещанието на този подход за рак на гърдата 28, рак на яйчниците 29 и редица други видове рак. Анализът на малки циркулиращи РНК при пациенти с рак на белия дроб показва, че тези РНК помагат да се направи разлика между пациенти със самотен белодробен възел (не изискващ терапия) и пациенти, които развиват злокачествени туморни възли (изискващи лечение) 30 .

), предотвратявайки транслацията на иРНК върху рибозомите в протеина, който кодира. В крайна сметка ефектът от малката интерферираща РНК е идентичен с този от простото намаляване на експресията ген.

Малки интерфериращи РНК бяха открити в 1999 г David Balcombe Group ( Английски David Baulcombe) в Обединеното кралство като компонент на посттранскрипционната система заглушаване на генитев растенията ( Английски PTGS en: заглушаване на ген след транскрипция ). Групата публикува своите открития в списание Наука.

Двуверижните РНК могат да подобрят генната експресия чрез механизъм, наречен РНК-зависима генна активация ( Английски RNAa, малка РНК-индуцирана генна активация). Доказано е, че двойноверижните РНК, комплементарни на промоторите на целевите гени, предизвикват активиране на съответните гени. За човешки клетки е доказано РНК-зависимо активиране при прилагане на синтетична двойноверижна РНК. Не е известно дали подобна система съществува в клетките на други организми.

Предоставяйки възможност за изключване на всеки ген по желание, малка интерферираща РНК базирана на РНК интерференция генерира огромен интерес към основната и приложна биология. Броят на широкообхватните RNAi-базирани тестове за идентифициране на важни гени в биохимичните пътища нараства. Тъй като развитието на болестите също се определя от активността на гените, се очаква, че в някои случаи изключването на ген с помощта на малка интерферираща РНК може да има терапевтичен ефект.

Въпреки това, прилагането на малка интерферираща РНК базирана на РНК интерференция при животни и особено при хора е изправена пред много трудности. Експериментите показват, че ефективността на малката интерферираща РНК варира за различните типове клетки: някои клетки лесно реагират на влиянието на малка интерферираща РНК и демонстрират намаляване на генната експресия, докато при други това не се наблюдава, въпреки ефективния трансфекция. Причините за това явление все още са слабо разбрани.

Резултатите от първата фаза на тестване на първите две терапевтични лекарства, действащи чрез механизма на РНК интерференция (предназначени за лечение дегенерация на макулата), публикувани в края на 2005 г., показват, че лекарствата с малка интерферираща РНК се понасят лесно от пациентите и имат приемливи фармакокинетични свойства.

Предварителни клинични изпитвания на насочване към малки интерфериращи РНК Вирус ебола, показват, че те могат да бъдат ефективни за постекспозиционна профилактика на заболяването. Това лекарство позволи на цялата група експериментални примати да оцелеят след получаване на смъртоносна доза от Zaire Ebolavirus

Дължината на siRNA е 21-25 bp, те се образуват от dsRNA. Източникът на такива РНК може да бъде вирусни инфекции, генетични конструкции, въведени в генома, дълги фиби в транскрипти и двупосочна транскрипция на мобилни елементи.
dsRNA се нарязва от RNase Dicer на фрагменти с дължина 21-25 bp. с 3" краища, изпъкнали с 2 нуклеотида, след което една от веригите е част от RISC и насочва разрязването на хомоложни РНК. RISC съдържа siRNA, съответстващи както на плюс, така и на минус вериги на dsRNA. siRNA нямат свои собствени гени и представляват фрагменти от по-дълги РНК.siPHKs насочват разрязването на целевата РНК, тъй като те са напълно комплементарни към нея.В растенията, гъбичките и нематодите, РНК-зависимите РНК полимерази участват в процеса на потискане на генната експресия, за което siRNAs също служат като праймери (семена за синтеза на нова РНК. Получената dsRNA се нарязва от Dicer, образуват се нови siPHK, които са вторични, като по този начин усилват сигнала.

РНК интерференция

През 1998 г. Крейг С. Мело и Андрю Файър публикуват в Nature, в който се посочва, че двойноверижната РНК (dsRNA) е способна да потиска генната експресия. По-късно се оказа, че активният принцип в този процес е късата едноверижна РНК. Механизмът на потискане на генната експресия с помощта на тези РНК се нарича
РНК интерференция, както и РНК заглушаване. Този механизъм се среща във всички големи таксони на еукариоти: гръбначни и безгръбначни, растения и гъби. През 2006 г. той получава Нобелова награда за това откритие.
Потискането на експресията може да се случи на транскрипционно ниво или след транскрипция. Оказа се, че във всички случаи е необходим подобен набор от протеини и къси (21-32 bp) РНК.
siPHK регулират генната активност по два начина. Както бе споменато по-горе, те насочват разрязването на целевите РНК. Това явление се нарича "потискане" ( потушаване) в гъби, " посттранслационно заглушаване на гени"в растенията и" РНК интерференция "при животни. siPHK с дължина 21-23 bp участват в тези процеси. Друг вид ефект е, че siPHK може да потисне транскрипцията на гени, съдържащи хомоложни siRNA последователности. Това явление се нарича заглушаване на транскрипционния ген (TGS) и се намира в дрожди, растения и животни. siRNAs също насочват метилирането на ДНК, което води до образуване на хетерохроматин и транскрипционна репресия. TGS е най-добре проучен в дрождите S.pombe, където е установено, че siRNAs са интегрирани в подобен на RISC протеинов комплекс, наречен RITS. В неговия случай, както и в случая на RISC, siRNA взаимодейства с протеин от семейството AGO. Вероятно siRNA е в състояние да насочи този комплекс към ген, който съдържа хомоложен siRNA фрагмент. След това RITS протеините набират метилтрансферази, в резултат на което се образува хетерохроматин в локуса, кодиращ целевия ген на siRNA, и активната генна експресия престава.

Роля в клетъчните процеси

Какво е значението на siRNA в клетката?
siRNA участват в защитата на клетките от вируси, потискане на трансгени, регулиране на определени гени и образуване на центромерен хетерохроматин. Важна функция на siRNA е потискането на експресията на мобилни генетични елементи. Такова потискане може да се случи както на транскрипционно ниво, така и посттранскрипционно.
Геномът на някои вируси се състои от ДНК, докато други се състоят от РНК, а РНК на вирусите може да бъде едноверижна или двуверижна. Процесът на разрязване на чужда (вирусна) иРНК в този случай се извършва по същия начин, както е описано по-горе, тоест чрез активиране на RISC ензимния комплекс. Въпреки това, за по-голяма ефективност, растенията и насекомите са изобретили уникален начин за подобряване на защитния ефект на siRNA. Чрез присъединяване към веригата на иРНК, част от siRNA може, с помощта на ензимния комплекс DICER, първо да завърши втората верига на иРНК и след това да я отреже на различни места, създавайки по този начин разнообразие от „вторични“ siRNA. Те от своя страна образуват RISC и пренасят иРНК през всички етапи, разгледани по-горе, до пълното й унищожаване. Такива „вторични“ молекули ще могат специфично да се свързват не само с частта от вирусната иРНК, към която е насочена „първичната“ молекула, но и с други области, което драстично повишава ефективността на клетъчната защита.

По този начин в растенията и низшите животински организми siPHK са важна част от един вид „вътреклетъчен имунитет“, който им позволява да разпознават и бързо да унищожат чужда РНК. Ако РНК, съдържаща вирус, е навлязла в клетката, такава защитна система ще предотврати размножаването му. Ако вирусът съдържа ДНК, siRNA системата ще му попречи да произвежда вирусни протеини (тъй като необходимата иРНК за това ще бъде разпозната и отрязана) и използването на тази стратегия ще забави разпространението му в тялото.

Бозайниците, за разлика от насекомите и растенията, имат различна защитна система. Когато чужда РНК, чиято дължина е повече от 30 bp, навлезе в „зряла“ (диференцирана) клетка на бозайник, клетката започва да синтезира интерферон. Интерферонът, като се свързва със специфични рецептори на клетъчната повърхност, е в състояние да стимулира цяла група гени в клетката. В резултат на това в клетката се синтезират няколко вида ензими, които инхибират протеиновия синтез и разграждат вирусната РНК. В допълнение, интерферонът може да действа и върху съседни, все още неинфектирани клетки, като по този начин блокира възможното разпространение на вируса.

Както можете да видите, и двете системи са сходни по много начини: имат обща цели "методи" на работа. Дори самите имена „интерферон“ и „(РНК) интерференция“ идват от общ корен. Но те също имат една много съществена разлика: ако интерферонът при първите признаци на инвазия просто „замразява“ работата на клетката, като не позволява (за всеки случай) производството на много, включително „невинни“ протеини в клетката, тогава siRNA системата е изключително разбираема: всяка siRNA ще разпознае и унищожи само своята специфична иРНК. Замяната само на един нуклеотид в siRNA води до рязко намаляване на ефекта на интерференция . Нито един от известните досега генни блокери няма такава изключителна специфичност за целевия си ген.

Откритието на РНК интерференцията даде нова надежда в борбата срещу СПИН и рака. Възможно е чрез използване на siPHK терапия заедно с традиционната антивирусна терапия да може да се постигне ефект на потенциране, при който двете лечения водят до по-голям терапевтичен ефект от простата сума на всяко дадено поотделно.
За да се използва механизмът на интерференция на siRNA в клетките на бозайниците, в клетките трябва да бъдат въведени готови двойноверижни молекули на siRNA. Оптималният размер на такава синтетична siRNA е същите 21-28 нуклеотида. Ако увеличите дължината му, клетките ще реагират чрез производство на интерферон и намаляване на протеиновия синтез. Синтетичните siPHK могат да навлязат както в заразени, така и в здрави клетки и намаляването на производството на протеини в неинфектирани клетки би било крайно нежелателно. От друга страна, ако се опитате да използвате siRNA, по-малка от 21 нуклеотида, специфичността на нейното свързване с желаната иРНК и способността за образуване на RISC комплекс рязко намаляват.

Ако е възможно да се достави siRNA по един или друг начин, който има способността да се свързва с която и да е част от генома на HIV (който, както е известно, се състои от РНК), човек може да се опита да предотврати интегрирането му в ДНК на гостоприемника клетка. Освен това учените разработват начини за повлияване на различни етапи от възпроизвеждането на ХИВ във вече заразена клетка. Последният подход няма да осигури излекуване, но може значително да намали скоростта на възпроизвеждане на вируса и да даде шанс на притиснатата в ъгъла имунна система да „почине“ от вирусната атака и да се опита да се справи с остатъците от самата болест. На фигурата двата етапа на възпроизвеждане на ХИВ в клетка, които учените се надяват да могат да бъдат блокирани с помощта на siRNA, са маркирани с червени кръстове (етапи 4-5 - интегриране на вируса в хромозомата и етапи 5-6 - сглобяване на вирусът и излизане от клетката).


Днес обаче всичко по-горе се отнася само до областта на теорията. На практика siRNA терапията среща трудности, които учените все още не са успели да преодолеят. Например, в случай на антивирусна терапия, именно високата специфичност на siRNA може да изиграе жестока шега: както е известно, вирусите имат способността бързо да мутират, т.е. променят състава на своите нуклеотиди. ХИВ е особено успешен в това, честотата на промените в която е такава, че човек, заразен с един подтип на вируса, може след няколко години да развие напълно различен подтип. В този случай модифицираният ХИВ щам автоматично ще стане нечувствителен към siRNA, избрана в началото на терапията.

Стареене и канцерогенеза

Както всеки епигенетичен фактор, siPHK засягат експресията на гени, които са заглушени. Сега има работи, които описват експерименти за изключване на гени, свързани с тумори. Гените се изключват (унищожават) с помощта на siRNA. Например, китайски учени са използвали siRNA, за да изключат гена на транскрипционния фактор 4 (TCF4), чиято активност причинява синдром на Pitt-Hopkins (много рядко генетично заболяване, характеризиращо се с умствена изостаналост и епизоди на хипервентилация и апнея) и други психични заболявания. В тази работа изследвахме ролята на TCF4 в стомашните ракови клетки. Ектопичната експресия на TCF4 намалява клетъчния растеж в клетъчните линии на рак на стомаха, нокаутирането на гена TCF4 с помощта на siRNA увеличава клетъчната миграция. По този начин можем да заключим, че епигенетичното изключване (заглушаване) на гена TCF4 играе важна роля в образуването и развитието на тумори.

Според изследване в Департамента по онкология, Алберт Айнщайн Cancer Center, ръководен от Леонард Х. Аугенлихт, siRNA участва в изключването на гена HDAC4, който причинява инхибиране на растежа на рак на дебелото черво, апоптоза и повишена транскрипция на p21. HDAC4 е хистон деацетилаза, която е тъканно специфична, инхибира клетъчната диференциация и нейната експресия се потиска по време на процеса на клетъчна диференциация. Работата показва, че HDAC4 е важен регулатор на пролиферацията на клетките на дебелото черво (което е важно в процеса на рак), а той от своя страна се регулира от siRNA.

Катедрата по патология към Медицинския факултет на Нара в Япония проведе изследване върху рака на простатата. Репликативното стареене на клетките е бариера срещу неконтролирано делене и канцерогенеза. Краткоживеещите делящи се клетки (TAC) са част от клетъчната популация на простатата, от която се образуват тумори. Японски учени изследваха причините, поради които тези клетки преодоляват стареенето. Клетките на простатата в културата бяха трансфектирани с junB siRNA. В тези клетки се наблюдава повишено нивоекспресия на p53, p21, p16 и pRb, открити по време на стареене. Клетки в култура, които показват намалени нива на р16, се използват за следващата стъпка. Повтарящата се трансфекция на siRNA в TAC позволява на клетките да избегнат стареене при инактивиране на p16/pRb. В допълнение, заглушаването на junB протоонкогена от junB siRNA причинява клетъчна инвазия. Въз основа на това се стигна до заключението, че junB е елемент за p16 и насърчава клетъчното стареене, предотвратявайки TAC злокачествено заболяване. По този начин junB е регулатор на канцерогенезата на простатата и може да бъде цел за терапевтична интервенция. И неговата активност може да се регулира с помощта на siRNA.

Има много подобни проучвания, които се провеждат. В момента siRNA е не само обект, но и инструмент в ръцете на изследовател - лекар, биолог, онколог, геронтолог. Изучаването на връзката между siRNA и рака и експресията на гени, свързани с възрастта, е най-важната задача за науката. Измина много малко време от откриването на siRNA, но се появиха много интересни изследвания и публикации, свързани с тях. Няма съмнение, че тяхното изследване ще бъде една от стъпките на човечеството към победата над рака и стареенето...