Курсова работа: Високоефективна течна хроматография на замърсители в природни и отпадъчни води. Течна хроматография HPLC хроматография за анализ

9885 0

HPLC е течна колонна хроматография, при която могат да се използват различни сорбционни механизми. По същество HPLC е модерна формаприлагане на класическа течна колонна хроматография. Някои от най-значимите качествени характеристики на HPLC са изброени по-долу:
- висока скорост на процеса, което направи възможно намаляването на продължителността на разделянето от няколко часа и дни до минути;
- минимална степен на замъгляване на хроматографските зони, което прави възможно разделянето на съединения, които само леко се различават в сорбционните константи;
- висока степенмеханизация и автоматизация на отделянето и обработката на информация, благодарение на които течноколонната хроматография достигна ново ниво на възпроизводимост и точност.

Интензивните изследвания през последните десетилетия и огромното количество натрупани експериментални данни сега ни позволяват да говорим за класификацията на вариантите в рамките на метода на високоефективната течна хроматография. Разбира се, класификацията според сорбционния механизъм, дадена по-горе, остава валидна.

Общата класификация се основава на сравнителната полярност на подвижната и стационарната фази. В този случай се прави разлика между нормална и обратнофазова хроматография.

Нормалната фазова хроматография (NPC) е вариант на HPLC, при който подвижната фаза е по-малко полярна от стационарната фаза и има причина да се смята, че основният фактор, определящ задържането, е взаимодействието на сорбатите директно с повърхността или обема на сорбента.

Хроматографията с обърната фаза (RPC) е вариант на HPLC, където подвижната фаза е по-полярна от неподвижната фаза и задържането се определя чрез директен контакт на сорбатни молекули с повърхността или обема на сорбента; в този случай йонизираните сорбати не се обменят с йони на подвижната фаза, сорбирани на повърхността.

Йонообменната хроматография е вариант, при който сорбцията се извършва чрез обмен на сорбирани йони на подвижната фаза за йони на хроматографираните вещества; Лигандообменната хроматография може да се дефинира по напълно аналогичен начин.

Хроматографията върху динамично модифицирани сорбенти е вариант на HPLC, при който сорбатът не взаимодейства директно с повърхността на сорбента, а влиза във връзка с молекулите на повърхностните слоеве на елуента.
Йонно-двойната хроматография е вариант на обратнофазова хроматография на йонизирани съединения, при който към подвижната фаза се добавя хидрофобен противойон, който променя качествено сорбционните характеристики на системата.

Хроматографията с изключване по размер е метод за разделяне на съединения по техните молекулни тегла, базиран на разликата в скоростта на дифузия на молекули с различни размери в порите на неподвижната фаза.

За HPLC много важна характеристика е размерът на сорбентите, обикновено 3-5 микрона, сега до 1,8 микрона. Това позволява бързо и пълно разделяне на сложни смеси от вещества (средно време за анализ от 3 до 30 минути).

Проблемът с разделянето се решава с помощта на хроматографска колона, която е тръба, пълна със сорбент. При извършване на анализ течност (елуент) с определен състав се подава през хроматографска колона с постоянна скорост. В този поток се инжектира точно измерена доза от пробата. Компонентите на проба, въведена в хроматографска колона, поради различния си афинитет към колонния сорбент, се движат по нея с различна скорост и достигат до детектора последователно по различно време.

По този начин хроматографската колона е отговорна за селективността и ефективността на разделяне на компонентите. Чрез избор на различни типове колони може да се контролира степента на разделяне на аналитите. Съединенията се идентифицират по тяхното време на задържане. Количественото определяне на всеки от компонентите се изчислява въз основа на големината на аналитичния сигнал, измерен с помощта на детектор, свързан към изхода на хроматографската колона.

сорбенти. Развитието на HPLC до голяма степен е свързано със създаването на нови поколения сорбенти с добри кинетични свойства и разнообразни термодинамични свойства. Основният материал за сорбенти в HPLC е силикагел. Той е механично здрав и има значителна порьозност, което дава голям обменен капацитет с малки размери на колоните. Най-често срещаният размер на частиците е 5-10 микрона. Колкото по-близо до сферичната форма на частиците, толкова по-ниско е съпротивлението на потока, толкова по-висока е ефективността, особено ако се отсее много тясна фракция (например 7 +1 микрона).

Специфичната повърхност на силикагела е 10-600 m /g. Силикагелът може да бъде модифициран с различни химически групи, присадени на повърхността (C-18, CN, NH2, SO3H), което позволява използването на сорбенти на негова основа за разделяне на голямо разнообразие от класове съединения. Основният недостатък на силикагела е неговата ниска химическа устойчивост при pH< 2 и рН >9 (силициев диоксид се разтваря в основи и киселини). Следователно, в момента Времето течеинтензивно търсене на сорбенти на базата на полимери, които са стабилни при pH от 1 до 14, например на базата на полиметилметакрилат, полистирол и др.

Сорбенти за йонообменна хроматография. Поради особеностите на разделяне (в кисела или алкална среда) основният сорбентен материал е полистирен с дивинилбензен с различна степен на омрежване с SO3 -H+ (силно киселинни катионобменници) или -COO-Naf (слабо киселинни катионобменници), -H2N+(CH3)3Cl- (силно основни анионобменници ) или -N+ групи, присадени върху тяхната повърхност HR2Cl- (слаби основни анионобменници).

Сорбенти за гелпроникваща хроматография. Основният тип е стирен-DVB. Използват се също макропорести стъкла, метилметакрилат и силикагел. Същите сорбенти се използват за йонна хроматография.
Помпи. За осигуряване на потока на подвижната фаза (МФ) през колоната с зададените параметри се използват помпи за високо налягане. Към най-важното технически спецификации LC помпите включват: диапазон на потока; максимално работно налягане; възпроизводимост на потока; диапазон на пулсация на подаването на разтворител.

В зависимост от естеството на подаването на разтворителя помпите могат да бъдат с постоянно захранване (дебит) и постоянно налягане. По принцип по време на аналитичната работа се използва режим на постоянен дебит, а при пълнене на колони се използва режим на постоянно налягане. Според принципа на действие помпите се делят на шприцови и бутални помпи.

Шприцови помпи. Помпите от този тип се характеризират с почти пълна липса на пулсации в потока на подвижната фаза по време на работа. Недостатъци на помпата: а) голям разход на време и разтворител за измиване при смяна на разтворителя; б) спиране на отделянето при пълнене на помпата; в) големи размери и тегло при осигуряване на висок поток и налягане (необходим е мощен двигател и голяма сила на буталото с голямата му площ).

Бутални бутални помпи. Помпите от този тип осигуряват постоянно обемно захранване на подвижната фаза за дълго време. Максимално работно налягане 300-500 atm, дебит 0,01-10 ml/min. Възпроизводимостта на обемния поток е 0,5%. Основният недостатък е, че разтворителят се подава към системата под формата на поредица от последователни импулси, така че има пулсации на налягането и потока.

Това е основната причина за повишения шум и намалената чувствителност на почти всички детектори, използвани в LC, особено електрохимичните. Начини за борба с пулсациите: използване на двойни помпи или помпа с двойно бутало Bag-Lai, използване на амортизиращи устройства и електронни устройства.

Количеството на обемното подаване се определя от три параметъра: диаметър на буталото (обикновено 3,13; 5,0; 7,0 mm), неговата амплитуда (12-18 mm) и честота (която зависи от скоростта на въртене на двигателя и скоростната кутия).

Дозатори. Целта на дозатора е да прехвърли проба при атмосферно налягане към входа на колона при налягане до няколко атмосфери. Важно е в дозатора да няма „мъртви“ обеми, които не могат да бъдат измити от подвижната фаза и да няма ерозия на пробата по време на дозиране. Първоначално LC дозаторите бяха подобни на газовите дозатори с пробиване на мембраната. Мембраните обаче не издържат повече от 50-100 atm, химическата им устойчивост е недостатъчна, парчетата им замърсяват колонните филтри и капилярите.

Течната фаза има много по-ниска скорост на дифузия от газовата фаза. Следователно можете да дозирате чрез спиране на потока - пробата няма време да ерозира в дозатора. Докато пробата се въвежда в дозатора, специален клапан спира потока на разтворителя. Налягането на входа на колоната намалява бързо; след няколко секунди пробата може да се инжектира в камерата на дозатора с конвенционална микроспринцовка. След това дозаторът се заключва, потокът на разтворителя се включва и настъпва разделяне.

Налягането, което държи този кран, е до 500-800 atm. Но когато потокът спре, равновесието в колоната се нарушава, което може да доведе до появата на „свободни“ допълнителни пикове.

Дозаторите с примки са най-широко използвани. Когато дозаторът е пълен, входовете 1, 2 и каналът между тях са под високо налягане. Входове 3-6, каналите между тях и дозиращия контур са под атмосферно налягане, което ви позволява да напълните контура с помощта на спринцовка или помпа. Когато дозаторът се завърти, потокът на подвижната фаза измества пробата в колоната. За да се намали грешката, примката се промива с 5-10 пъти обема на пробата. Ако пробата е малка, тя може да се инжектира в примката с микроспринцовка. Обемът на цикъла обикновено е 5-50 µl.

НА. Войнов, Т.Г. Волова

При високоефективната течна хроматография (HPLC) естеството на процесите, протичащи в хроматографската колона, обикновено е идентично с процесите в газовата хроматография. Единствената разлика е в използването на течност като неподвижна фаза. Поради високата плътност на течните подвижни фази и високата устойчивост на колоните, газовата и течната хроматография се различават значително в инструментариума.

В HPLC като подвижни фази обикновено се използват чисти разтворители или смеси от тях.

За да се създаде поток от чист разтворител (или смеси от разтворители), наречен елуент в течната хроматография, се използват помпи, включени в хидравличната система на хроматографа.

Адсорбционната хроматография се извършва в резултат на взаимодействието на вещество с адсорбенти, като силикагел или алуминиев оксид, които имат активни центрове на повърхността. Разликата в способността за взаимодействие с адсорбционните центрове на различните молекули на пробата води до тяхното разделяне на зони по време на движение с подвижната фаза по протежение на колоната. Постиганото в този случай зоново разделяне на компонентите зависи от взаимодействието както с разтворителя, така и с адсорбента.

Най-широко използваните в HPLC са силикагелните адсорбенти с различни обеми, повърхностни площи и диаметри на порите. Алуминиевият оксид и други адсорбенти се използват много по-рядко. Основната причина за това:

недостатъчна механична якост, която не позволява опаковане и използване при високи налягания, характерни за HPLC;

силикагелът, в сравнение с алуминиевия оксид, има по-широк диапазон на порьозност, повърхностна площ и диаметър на порите;Значително по-голямата каталитична активност на алуминиевия оксид води до изкривяване на резултатите от анализа поради разлагането на компонентите на пробата или тяхната необратима хемосорбция.

Детектори за HPLC

Високоефективната течна хроматография (HPLC) се използва за откриване на полярни нелетливи вещества, които по някаква причина не могат да бъдат превърнати във форма, подходяща за газова хроматография, дори под формата на производни. Такива вещества, по-специално, включват сулфонови киселини, водоразтворими багрила и някои пестициди, например производни на фенил-урея.

Детектори:

UV детектор на диодна матрица. „Матрица“ от фотодиоди (повече от двеста от тях) постоянно регистрира сигнали в UV и видимите области на спектъра, като по този начин осигурява запис на UV-B спектрите в режим на сканиране. Това ви позволява непрекъснато да записвате, при висока чувствителност, неизкривени спектри на компоненти, бързо преминаващи през специална клетка.

В сравнение с откриването на една дължина на вълната, което не предоставя информация за пикова чистота, способността за сравняване на пълни спектри на диоден масив осигурява много по-висока степен на увереност в резултата от идентификацията.

Флуоресцентен детектор.Голямата популярност на флуоресцентните детектори се дължи на тяхната много висока селективност и чувствителност, както и на факта, че много замърсители заобикаляща средафлуоресцират (например полиароматни въглеводороди).

Електрохимичен детекторизползва се за откриване на вещества, които лесно се окисляват или редуцират: феноли, меркаптани, амини, ароматни нитро- и халогенни производни, алдехиди, кетони, бензидини.

Хроматографското разделяне на смес на колона поради бавния напредък на PF отнема много време. За да се ускори процесът, хроматографията се извършва под налягане. Този метод се нарича високоефективна течна хроматография (HPLC)

Модернизацията на оборудването, използвано в класическата течна колонна хроматография, я превърна в един от най-обещаващите и модерни методи за анализ. Високоефективната течна хроматография е удобен метод за разделяне, препаративно изолиране и качествен и количествен анализ на нелетливи термолабилни съединения както с ниско, така и с високо молекулно тегло.

В зависимост от вида на използвания сорбент, този метод използва 2 варианта на хроматография: върху полярен сорбент, използващ неполярен елуент (опция с директна фаза) и върху неполярен сорбент, използващ полярен елуент - така наречената обратнофазова висока -ефективна течна хроматография (RPHPLC).

По време на прехода от елуент към елуент, равновесието при HPLC условия се установява многократно по-бързо, отколкото при условия на полярни сорбенти и неводни PFs. В резултат на това, както и на удобството при работа с водни и водно-алкохолни елуенти, OFVLC сега придоби голяма популярност. Повечето HPLC анализи се извършват с помощта на този метод.

Детектори.Изходът на отделен компонент от колоната се записва с помощта на детектор. За регистрация можете да използвате промяна във всеки аналитичен сигнал, идващ от подвижната фаза и свързан с естеството и количеството на компонента на сместа. Течната хроматография използва аналитични сигнали като абсорбция на светлина или излъчване на светлина от изходния разтвор (фотометрични и флуориметрични детектори), индекс на пречупване (рефрактометрични детектори), потенциал и електропроводимост(електрохимични детектори) и др.

Постоянно засичаният сигнал се записва от записващо устройство. Хроматограмата е поредица от детекторни сигнали, записани на записваща лента, генерирани, когато отделни компоненти на смес напуснат колоната. Ако сместа се раздели, на външната хроматограма се виждат отделни пикове. Позицията на пика в хроматограмата се използва за идентифициране на веществото, височината или площта на пика - за целите на количественото определяне.

Въведение.

Бързото развитие на течната хроматография през последните 10 години се дължи основно на интензивното развитие теоретични основии практическото използване на неговата високоефективна версия, както и създаването и промишленото производство на необходимите сорбенти и оборудване.

Отличителна черта на високоефективната течна хроматография (HPLC) е използването на сорбенти с размер на зърното 3-10 микрона, което осигурява бърз масопренос с много висока ефективност на разделяне.

Понастоящем HPLC заема първо място сред инструменталните методи по отношение на скоростта на развитие, дори изпреварвайки газовата хроматография. Най-важното предимство на HPLC в сравнение с газовата хроматография е възможността за изследване на почти всеки обект без никакви ограничения върху техните физикохимични свойства, например точки на кипене или молекулно тегло.

Днес HPLC е добре разработен инструментален метод, който се използва широко в голямо разнообразие от области на науката и технологиите. Важността му е особено голяма в такива критични области като биохимия, молекулярна биология, контрол на замърсяването на околната среда, както и в химическата, нефтохимическата, хранително-вкусовата и фармацевтичната промишленост.

тъй като е необходимо да се вземат предвид редица много специфични изисквания поради следните характеристики на методологията.

А. HPLC колоните са пълни със среда с много малък диаметър на частиците. В резултат на това при обемните скорости на разтворителя, необходими за бързо разделяне на пробата, върху колоната се създава високо налягане.

b. Детекторите, използвани в HPLC, са чувствителни към колебания в потока на елуента и налягането (шум). Освен това, когато се използват детектори за концентрация, е необходима още по-висока стабилност на обемната скорост на елуента.

V. Процесът на хроматографско разделяне е придружен от редица антагонистични ефекти, например дисперсията на пробата в подвижната фаза води до смесване на отделените компоненти и намалява максималната концентрация на веществото в елуирания пик (в детектора). Наблюдава се дисперсия във всички области на системата от точката на инжектиране на пробата до детектора.

г. Разтворителите, действащи като подвижна фаза, често могат да причинят корозия на оборудването. Това се отнася предимно за разтворители, използвани в обратнофазова хроматография, която е предпочитана в биохимичните HPLC приложения.

При разработването, създаването и експлоатацията на тези системи трябва да се имат предвид спецификите на HPLC като инструментална техника. Отне повече от десет години търсене и проучване, за да се създадат търговски образци на хроматографски системи и техните компоненти, които са достатъчно надеждни, прости и безопасни за работа с приемливо съотношение между цена и технически характеристики. Последните тенденции към намаляване на колоните (както дължина, така и диаметър) налагат нови изисквания към инструментите.

1.1. ЕФЕКТИВНОСТИИЗБИРАТЕЛНОСТ

Хроматографията е метод за разделяне на компонентите на смес въз основа на разликата в тяхното равновесно разпределение между две "несмесващи се фази, едната от които е неподвижна, а другата е подвижна. Компонентите на пробата се движат по протежение на колоната, когато са в подвижна фаза, и остават на място, когато са в стационарна фаза.Колкото по-голям е афинитетът на компонента към неподвижната фаза и по-малък към подвижната фаза, толкова по-бавно се движи през колоната и толкова по-дълго се задържа в нея. Поради разликата в афинитета на компонентите на сместа към неподвижната и подвижната фаза се постига основната цел на хроматографията - разделяне на приемлив период от време на сместа на отделни ленти (пикове) на компонентите, докато се движат колоната с подвижната фаза.

От тези общи понятия става ясно, че хроматографското разделяне е възможно само ако компонентите на пробата, влизащи в колоната при въвеждане на пробата, първо, се разтварят в подвижната фаза и, второ, взаимодействат (задържат) с неподвижната фаза . Ако при въвеждане на проба някои компоненти не са под формата на разтвор, те ще бъдат филтрирани и няма да участват в хроматографския процес. По същия начин компоненти, които не взаимодействат със стационарната фаза, ще преминат през колоната с подвижната фаза, без да се разделят на своите компоненти.

Нека приемем условието, че някои два компонента са разтворими в подвижната фаза и взаимодействат със стационарната фаза, т.е. хроиатографският процес може да протича без смущения. В този случай, след преминаване на сместа през колоната, можете да получите хроматограми на формата а, били V(фиг. 1.1). Тези хроматограми илюстрират хроматографски разделяния, които се различават по ефективност (Аи б) с еднаква селективност и селективност (бИ V)с еднаква ефективност.

Колкото по-тесен е пикът, получен при същото време на задържане, толкова по-висока е ефективността на колоната. Ефективността на колоната се измерва с броя на теоретичните плочи (NPT) н: толкова по-висока е ефективността

Ориз. 1.2. Хроматографски пикови параметри и изчисляване на броя на теоретичните плаки:

t R - пиково време на задържане; ч - височина на върха; Wj/j - широчина на върха на половината от височината му

Ориз. 1.1. Тип хроматограма в зависимост от ефективността и селективността на колоната:

А- нормална селективност, намалена ефективност (по-малко теоретични плочи); b - обичайна селективност и ефективност; V -нормална ефективност, повишена селективност (по-високо съотношение на времената на задържане на компонентите)

ефективност, колкото по-голям е FTT, толкова по-малко е разширяването на пика на първоначално тясната лента, докато преминава през колоната, и толкова по-тесен е пикът на изхода на колоната. PTT характеризира броя на стъпките за установяване на равновесие между подвижната и неподвижната фаза.

Знаейки броя на теоретичните плочи на колона и дължината на колоната Л (µm), както и средния диаметър на зърното на сорбента d c (µm), лесно е да се получат стойностите на височината, еквивалентна на теоретична плоча (HETT), както и намалената височина, еквивалентна на теоретична плоча (RHETT):

ЗАЛОЖЕНИЕ = Л/ н

PVETT =B3TT/d c .

Имайки стойностите на FTT, HETT и PHETT, можете лесно да сравните ефективността на колони от различни типове, различни дължини, пълни със сорбенти от различно естество и гранулат. Чрез сравняване на PTT на две колони с еднаква дължина се сравнява тяхната ефективност. При сравняване на HETP се сравняват колони със сорбенти с еднакъв размер на зърното и различни дължини. И накрая, стойността на PVETT позволява за всеки две колони да се оцени качеството на сорбента, първо, и качеството на пълнене на колоните, и второ, независимо от дължината на колоните, гранулирането на сорбентите от неговата природа.

Селективността на колоната играе голяма роля за постигане на хроматографско разделяне.

Селективността на една колона зависи от много фактори и умението на експериментатора до голяма степен се определя от способността да се повлияе на селективността на разделянето. За това три много важни фактора са в ръцете на хроматографа: изборът на химическата природа на сорбента, изборът на състава на разтворителя и неговите модификатори и като се вземе предвид химичната структура и свойствата на отделените компоненти . Понякога забележимо влияниеСелективността се влияе от промените в температурата на колоната, което променя коефициентите на разпределение на веществата между подвижната и неподвижната фази.

Когато се разглежда и оценява разделянето на два компонента в хроматограма, разделителната способност е важен параметър. R s, което свързва изходните времена и пиковите ширини на двата разделени компонента

Разделителната способност като параметър, характеризиращ разделянето на пиковете, се увеличава с увеличаване на селективността, отразено чрез увеличаване на числителя, и повишаване на ефективността, отразено чрез намаляване на стойността на знаменателя поради намаляване на ширината на пиковете. Следователно бързият прогрес на течната хроматография доведе до промяна в концепцията за „течна хроматография с високо налягане“ - тя беше заменена от „течна хроматография с висока разделителна способност“ (докато съкратената форма на термина на английски беше запазена HPLC като най-правилно характеризиращ посоката на развитие на съвременната течна хроматография).

По този начин измиването на колоната се намалява и ефективността се увеличава, когато се използва по-фин сорбент, по-равномерен по състав (тясна фракция), по-плътно и равномерно опакован в колоната, като се използват по-тънки слоеве на присадената фаза, по-малко вискозни разтворители и оптимални скорости на потока.

Въпреки това, заедно с размиването на лентата на хроматографската зона по време на процеса на разделяне в колоната, тя може също да бъде измита в устройството за въвеждане на пробата, в свързващите капиляри инжектор - колона и колона - детектор, в детекторната клетка и в някои спомагателни устройства (микрофилтри за улавяне на механични частици от проби, инсталирани след инжектора, предколони, реактори със серпентина и др.) - Колкото по-голям е обемът на допълнителната колона в сравнение със задържания обем на пика, толкова по-голяма е ерозията. Също така има значение къде се намира мъртвият обем: колкото по-тесен е хроматографският сигнал, толкова по-голямо е размиването на мъртвия обем. Следователно трябва да се обърне специално внимание на дизайна на тази част от хроматографа, където хроматографската зона е най-тясна (инжекторът и устройствата от инжектора до колоната) - тук ерозията извън колоната е най-опасна и има най-голямо въздействие. Въпреки че се смята, че в добре проектираните хроматографи източниците на допълнително разреждане извън колоната трябва да бъдат намалени до минимум, въпреки това всяко ново устройство, всяка модификация на хроматографа трябва задължително да завърши с тестване на колона и сравнение на получената хроматограма. с паспортния. Ако се наблюдава пиково изкривяване или рязко намаляване на ефективността, капилярите и другите нововъведени в системата устройства трябва да бъдат внимателно проверени.

Отмиването извън колоната и погрешната му преценка може да доведе до значителна (над 50%) загуба на ефективност, особено в случаите, когато се опитват да се използват сравнително стари хроматографи за високоскоростна HPLC, HPLC с микроколона и други варианти на съвременната HPLC, които изискват микроинжектори, свързващи капиляри с вътрешни с диаметър 0,05-0,15 mm минимална дължина, колони с капацитет 10-1000 µl, детектори с микрокювети с капацитет 0,03-1 µl и с висока скорост, високоскоростни записващи устройства и интегратори .

1.2. ЗАДЪРЖАНЕ НА РАЗТВОРИТЕЛ И ЗДРАВИНА

За да могат аналитите да бъдат разделени на колоната, както е споменато по-горе, коефициентът на капацитет к" трябва да бъде по-голямо от 0, т.е. веществата трябва да се задържат от неподвижната фаза, сорбента. Факторът на капацитет обаче не трябва да бъде твърде висок, за да се получи приемливо време за елуиране. Ако за дадена смес от вещества е избрана неподвижна фаза, която ги задържа, тогава по-нататъшната работа по разработването на техника за анализ се състои в избора на разтворител, който в идеалния случай би осигурил различен за всички компоненти, но приемливо не много голям к". Това се постига чрез промяна на силата на елуиране на разтворителя.

В случай на адсорбционна хроматография върху силикагел или алуминиев оксид, като правило, силата на двукомпонентен разтворител (например хексан с добавяне на изопропанол) се увеличава чрез увеличаване на съдържанието на полярния компонент (изопропанол), или намалява чрез намаляване на съдържанието на изопропанол. Ако съдържащият се полярен компонент стане твърде малък (по-малко от 0,1%), той трябва да бъде заменен с по-слаба сила на елуиране. Същото се прави, като се заменя или полярен, или неполярен компонент с други, дори ако тази система не осигурява желаната селективност по отношение на представляващите интерес компоненти в сместа. При избора на системи от разтворители се вземат предвид както разтворимостта на компонентите на сместа, така и елуотропните серии от разтворители, съставени от различни автори.

Силата на разтворителя се избира приблизително по същия начин, когато се използват присадени полярни фази (нитрил, амино, диол, нитро и др.), като се вземат предвид възможните химична реакцияи с изключение на фазово опасни разтворители (например кетони за аминофазата).

В случай на обратнофазова хроматография, силата на разтворителя се повишава чрез увеличаване на съдържанието на органичния компонент в елуента (метанол, ацетонитрил или THF) и се намалява чрез добавяне на повече вода. Ако не е възможно да се постигне желаната селективност, те използват друг органичен компонент или се опитват да го променят с помощта на различни добавки (киселини, реагенти за йонни двойки и др.).

При разделяне чрез йонообменна хроматография силата на разтворителя се променя чрез увеличаване или намаляване на концентрацията на буферния разтвор или промяна на рН; в някои случаи се използва модификация с органични вещества.

Въпреки това, особено в случай на сложни естествени и биологични смеси, често не е възможно да се избере силата на разтворителя по такъв начин, че всички компоненти на пробата да се елуират в рамките на приемливо време. Тогава трябва да прибегнете до градиентно елуиране, т.е. да използвате разтворител, чиято сила на елуиране се променя по време на процеса на анализ, така че постоянно да се увеличава според предварително определена програма. Тази техника позволява да се постигне елуиране на всички компоненти на сложни смеси за относително кратък период от време и тяхното разделяне на компоненти под формата на тесни пикове.

1.3. РАЗМЕР НА ЧАСТИЦИТЕ НА СОРБЕНТА, ПРОПУСТИМОСТ И ЕФЕКТИВНОСТ

Като се има предвид ерозията в колоната, ние посочихме, че ефективността на колоната (HETT) зависи от размера на частиците на сорбента. До голяма степен бързото развитие на HPLC през последните 10-12 години се дължи, първо, на разработването на методи за производство на сорбенти с размер на частиците от 3 до 10 микрона и с тесен фракционен състав, осигуряващи висока ефективност с добра проницаемост, и второ, методите за разработване на колони за пълнене с тези сорбенти и, трето, разработването и серийното производство на течни хроматографи с помпи за високо налягане, инжектори и детектори с кювети с малък обем, способни да записват пикове с малък обем.

За добре опаковани суспензионни колони, намалената еквивалентна теоретична височина на плочата (LPHE) може да бъде 2, независимо дали 3, 5, 10 или 20 μm частици се използват за опаковане. В този случай ще получим съответно колони (със стандартна дължина 250 мм) с КПД 41670, 25000, 12500 и 6250 t.t. Изглежда естествено да се избере най-ефективната колона, пълна с 3 µm частици. Въпреки това, тази ефективност ще дойде с цената на работа с много високо налягане и относително ниска скорост на разделяне, тъй като съществуващата помпа най-вероятно ще може да изпомпва разтворител през такава колона с висока обемна скорост. Тук се сблъскваме с въпроса за връзката между размера на частиците на сорбента, ефективността и пропускливостта на колоните.

Ако оттук изразим коефициента на съпротивление на колоната - безразмерна величина, получаваме следното уравнение:

Коефициентът на съпротивление за колони, пълни с микрочастици от същия тип, използвайки същия метод, варира леко и е със следните стойности:

Тип частица "... Неправилна сферична

форма форма

Суха опаковка. . . . . 1000-2000 800-1200

Опаковка за окачване. . . 700-1500 500-700

Налягането на входа на колоната е пропорционално на линейната скорост на потока, коефициента на съпротивление на колоната, вискозитета на разтворителя и дължината на колоната и обратно пропорционално на квадрата на диаметъра на частиците.

Прилагайки тази връзка към гореописаните колони с частици с диаметри 3, 5, 10 и 20 µm и приемайки постоянен линеен дебит, коефициент на съпротивление на колоната и вискозитет на разтворителя, получаваме съотношение на входното налягане от 44:16:4:1 за колони с еднаква дължина. По този начин, ако за обратнофазов сорбент с размер на частиците 10 μm при използване на метанолни разтворители - . вода (70:30) обикновено на стандартна колона при дебит на разтворителя 1 ml/min, налягането на входа на колоната е 5 MPa, след това за частици от 5 μm - 20 MPa и за 3 μm - 55 MPa . При използване на силикагел и по-малко вискозна система от разтворители, хексан - изопропанол (100:2), стойностите ще бъдат значително по-ниски: съответно 1, 4 и 11 MPa. Ако в случай на сорбент с обърната фаза използването на частици с размер 3 μm е много проблематично, а 5 μm е възможно, но не на всички устройства, тогава за сорбент с нормална фаза няма проблеми с налягането. Трябва да се отбележи, че съвременният високоскоростен HPLC обикновено използва по-висока скорост на потока на разтворителя, отколкото в примера по-горе, така че изискванията за налягане нарастват още повече.

Но в случаите, когато за разделянето е необходим определен брой теоретични плочи и е желателно да се извърши анализ на скоростта, картината се променя донякъде. Тъй като дължините на колоните със сорбенти с размери на зърната 3, 5, 10 микрона, с еднаква ефективност, ще бъдат съответно 7,5; 12,5 и 25 см, тогава съотношението на налягането на входа на колоните ще се промени на 3:2:1. Съответно продължителността на анализа на такива колони с еднаква ефективност ще бъде в съотношение 0,3:0,5:1, т.е. при преминаване от 10 към 5 и 3 микрона продължителността на анализа ще бъде намалена 2 и 3,3 пъти. Този по-бърз анализ идва с цената на пропорционално по-високо налягане на входа на колоната.

Представените данни са валидни за онези случаи, когато сорбенти с различни размери на зърната имат еднакви криви на разпределение на размера на частиците, колоните са опаковани по един и същи начин и имат един и същ фактор на съпротивление на колоната. Трябва да се има предвид, че трудността за получаване на тесни фракции от сорбента се увеличава с намаляване на размера на частиците и това. Фракциите от различни производители имат различен фракционен състав. Следователно коефициентът на съпротивление на колоната ще варира в зависимост от размера на зърното, типа на сорбента, метода на опаковане на колоната и т.н.

КЛАСИФИКАЦИЯ НА HPLC МЕТОДИ ПО МЕХАНИЗЪМ НА РАЗДЕЛЯНЕ

Повечето разделяния, извършвани чрез HPLC, се основават на смесен механизъм на взаимодействие на вещества със сорбент, осигуряващ по-голямо или по-малко задържане на компоненти в колоната. Механизмите за разделяне в повече или по-малко чиста форма са доста редки на практика, например адсорбция при използване на абсолютно безводен силикагел и безводен хексан за отделяне на ароматни въглеводороди.

Със смесен механизъм на задържане за вещества с различни структури и молекулни тегла е възможно да се оцени приносът към задържането на механизмите на адсорбция, разпределение, изключване и други. Въпреки това, за по-добро разбиране и разбиране на механизмите на разделяне в HPLC, препоръчително е разделянията с преобладаване на един или друг механизъм да се разглеждат като свързани с определен тип хроматография, например йонообменна хроматография.

2.1.1 АДСОРБЦИОННА ХРОМАТОГРАФИЯ

Разделянето чрез адсорбционна хроматография се извършва в резултат на взаимодействието на вещество с адсорбенти, като силикагел или алуминиев оксид, които имат активни центрове на повърхността. Разликата в способността за взаимодействие с адсорбционните центрове на различните молекули на пробата води до тяхното разделяне на зони по време на движение с подвижната фаза по протежение на колоната. Постиганото в този случай зоново разделяне на компонентите зависи от взаимодействието както с разтворителя, така и с адсорбента.

Сорбцията върху повърхността на адсорбент, съдържащ хидроксилни групи, се основава на специфично взаимодействие между полярна повърхностадсорбент и полярни (или способни да поляризират) групи или участъци от молекули. Такива взаимодействия включват дипол-диполно взаимодействие между постоянни или индуцирани диполи, образуването на водородна връзка, до образуването на r-комплекси или комплекси за пренос на заряд. Възможно и доста често срещано явление в практическата работа е проявата на хемосорбция, която може да доведе до значително увеличаване на времето на задържане, рязко намаляване на ефективността, поява на продукти на разлагане или необратима сорбция на веществото.

Адсорбционните изотерми на веществата имат линейна, изпъкнала или вдлъбната форма. При линейна адсорбционна изотерма пикът на веществото е симетричен и времето на задържане не зависи от размера на пробата. Най-често изотермите на адсорбция на веществата са нелинейни и имат изпъкнала форма, което води до известна асиметрия на пика с образуването на опашка.

Най-широко използваните в HPLC са силикагелните адсорбенти с различни обеми на порите, повърхностни площи и диаметри на порите. Алуминиевият оксид се използва много по-рядко, а други адсорбенти, широко използвани в класическата колонна и тънкослойна хроматография, се използват изключително рядко. Основната причина за това е недостатъчната механична якост на повечето други адсорбенти, което не позволява те да бъдат пакетирани или използвани при високи налягания, характерни за HPLC.

Полярните групи, които причиняват адсорбция и се намират на повърхността на силикагела и алуминиевия оксид, са сходни по свойства. Следователно, обикновено редът на елуиране на смеси от вещества и елуотропната серия от разтворители са еднакви за тях. Въпреки това, разликата в химичната структура на силикагела и алуминиевия оксид понякога води до разлики в селективността - тогава се дава предпочитание на един или друг адсорбент, който е по-подходящ за дадена конкретна задача. Например, двуалуминиевият оксид осигурява по-голяма селективност за разделянето на някои многоядрени ароматни въглеводороди.

Предпочитанието, което обикновено се дава на силикагел в сравнение с алуминиев оксид, се обяснява с по-широк избор от силикагели по отношение на порьозност, повърхност и диаметър на порите, както и със значително по-високата каталитична активност на алуминиевия оксид, което често води до изкривяване на резултатите от анализа поради разлагането на компонентите на пробата или тяхната необратима хемосорбция .

2.1.2 Недостатъци на адсорбционната хроматография, които ограничават нейната употреба

Популярността на адсорбционната хроматография постепенно намалява с развитието на метода HPLC; той все повече се заменя и продължава да бъде заменен от други опции, като обратнофазова и нормалнофазова HPLC върху сорбенти с присадена фаза. Какви са недостатъците на адсорбционната хроматография, довели до това?

На първо място, това е дългата продължителност на процесите на уравновесяване на адсорбентите с разтворители, съдържащи вода в следи от количества, трудността при приготвянето на такива разтворители с определена и възпроизводима влажност. Това води до лоша възпроизводимост на параметрите на задържане, разделителна способност и селективност. По същата причина е невъзможно да се използва градиентно елуиране - връщането към първоначалното състояние е толкова дълго, че значително надвишава времето, получено при използване на градиент.

Значителни недостатъци на адсорбентите, особено на алуминиевия оксид, свързани с чести случаи на пренареждане на чувствителни към катализа съединения, тяхното разлагане и необратима сорбция, също са добре известни и многократно са отбелязвани в литературата. Необратимо сорбираните вещества, натрупващи се в началния участък на колоната, променят естеството на сорбента и могат да доведат до повишаване на съпротивлението на колоната или дори до нейното пълно запушване. Последният недостатък може да бъде отстранен чрез използване на предварителна колона, която от-С увеличаването на съпротивлението и запушването, той се заменя с нов* или се зарежда отново с нов сорбент. Въпреки това, необратимата сорбция, която също възниква в този случай, води до хроматограма, в която компонентите на пробата, чувствителни към сорбция или каталитично разлагане, напълно или частично отсъстват.

2.2. РАЗПРЕДЕЛИТЕЛНА ХРОМАТОГРАФИЯ

Разделителната хроматография е вариант на HPLC, при който разделянето на сместа на компоненти се извършва поради разликата в техните коефициенти на разпределение между две несмесващи се фази: разтворител (подвижна фаза) и фаза върху сорбента (стационарна фаза). Исторически, първите са сорбенти от този тип, които са получени чрез нанасяне на течни фази (оксидипропионитрил, парафиново масло и др.) върху порести подложки, подобно на това как сорбентите са били и се приготвят за газово-течна хроматография (GLC). Недостатъците на такива сорбенти обаче бяха незабавно разкрити, основният от които беше сравнително бързото изплакване на фазата от носителя. Поради това количеството фаза в колоната постепенно намалява, времената на задържане също намаляват и в началната секция на колоната се появяват адсорбционни центрове, които не са обхванати от фазата, което води до образуването на пикови опашки. Този недостатък беше преодолян чрез насищане на разтворителя с приложената фаза, преди да влезе в колоната. Увличането също беше намалено, когато бяха използвани по-вискозни и по-малко разтворими полимерни фази, но в този случай, поради трудността на дифузията от дебели полимерни филми, ефективността на колоната беше значително намалена.

Оказа се логично течната фаза да се присади върху носителя чрез химически връзки по такъв начин, че отстраняването й да стане физически невъзможно, т.е. да се превърнат носителят и фазата в едно - в така наречения сорбент с присадена фаза.

Последвалите усилия на изследователите бяха насочени към търсене на реагенти, чието присаждане ще протече сравнително бързо и напълно, а образуваните връзки ще бъдат възможно най-стабилни. Такива реагенти бяха алкилхлорсиланите и техните производни, което направи възможно, използвайки подобна технология, да се получат сорбенти от присадена фаза от различни видове и с различни полярни и неполярни групи на повърхността.

Успешното приложение на последния тип сорбенти за HPLC допринесе за нарастването на производството им от голямо разнообразие от производители. Всяка компания произвежда такива сорбенти, като правило, въз основа на собствения си тип силикагел и използвайки собствена технология, която обикновено представлява производствено „ноу-хау“. В резултат на това голям брой сорбенти, химично наречени абсолютно еднакви (например силикагел с присаден октадецилсилан), имат много различни хроматографски характеристики. Това се дължи на факта, че силикагелът може да има по-широки или по-тесни пори, различна повърхност, порьозност, повърхността му преди присаждане може да бъде хидроксилирана или не, моно-, ди- или трихлоросилани могат да бъдат присадени, условията на присаждане могат да дадат мономерни, полимерни или фаза със смесен слой, различни методи се използват за отстраняване на остатъчните реагенти, допълнително дезактивиране на силанол и други активни групи може или не може да се използва.

Сложността на технологията за присаждане на реагенти и подготовка на суровини и материали, нейният многоетапен характер води до факта, че дори партиди от сорбенти, получени по една и съща технология от една производствена компания, могат да имат леко различни хроматографски характеристики. Това е особено вярно в случаите, когато такива сорбенти се използват за анализ на многокомпонентни смеси, съдържащи вещества, които се различават значително по броя и позицията на функционалните групи и вида на функционалността.

Като се има предвид горното, винаги трябва да се стремим да гарантираме, че когато се използва техниката за анализ, описана в литературата, се използват същият сорбент и същите работни условия. В този случай вероятността произведението да не бъде възпроизведено е минимална. Ако това не е възможно, но се вземе сорбент от друга компания с подобна присадена фаза, трябва да сте подготвени за факта, че ще отнеме много време, за да преработите техниката. В същото време има възможност (и това трябва да се има предвид), че с този сорбент, дори след дълго разработване, не може да се постигне необходимото разделяне. Наличието в литературата на много описани техники за разделяне на стари сорбенти, които се произвеждат от дълго време, стимулира по-нататъшното им производство и употреба по тази причина. Въпреки това, в случаите, когато е необходимо да се премине към разработването на оригинални методи, особено по отношение на вещества, склонни към разлагане, хемосорбция, прегрупиране, препоръчително е да започнете работа върху сорбенти, които са разработени наскоро и са произведени с помощта на нови, подобрени версии на технологията. Новите сорбенти имат по-равномерен фракционен състав, по-равномерно и пълно покритие на повърхността с присадената фаза и по-напреднали крайни етапи на обработка на сорбента.

2.3. ЙОННООБМЕННА ХРОМАТОГРАФИЯ

При йонообменната хроматография разделянето на компонентите на сместа се постига чрез обратимо взаимодействие на йонизиращи вещества с йонните групи на сорбента. Запазването на електрическата неутралност на сорбента се осигурява от наличието на способен йонен обменпротивойони, разположени в непосредствена близост до повърхността. Йонът на въведената проба, взаимодействайки с фиксирания заряд на сорбента, се обменя с противойона. Веществата с различен афинитет към фиксираните заряди се разделят на анионобменници или катионобменници.Анионообменниците имат положително заредени групи на повърхността и сорбират аниони от подвижната фаза.Катионообменниците съответно съдържат групи с -отрицателен заряд, които взаимодействат с катиони.

Като подвижна фаза се използват водни разтвори на соли на киселини, основи и разтворители като течен амоняк, т.е.системи от разтворители с висока диелектрична константа e и по-голяма склонност към йонизиране на съединения.Те обикновено работят с буферни разтвори, които позволяват рН стойност за коригиране.

По време на хроматографското разделяне йоните на аналита се конкурират с йоните, съдържащи се в елуента, като се стремят да взаимодействат с противоположно заредени групи на сорбента. От това следва, че йонообменната хроматография може да се използва за разделяне на всякакви съединения, които могат да бъдат йонизирани по някакъв начин. Възможно е да се анализират дори неутрални захарни молекули под формата на техните комплекси с боратен йон:

Захар + VO 3 2 - = Захар -VO 3 2 -.

Йонообменната хроматография е незаменима за разделянето на силно полярни вещества, които не могат да бъдат анализирани чрез GLC без превръщане в производни. Тези съединения включват аминокиселини, пептиди и захари.

Йонообменната хроматография се използва широко в медицината, биологията, биохимията, за мониторинг на околната среда, при анализ на съдържанието на лекарства и техните метаболити в кръвта и урината, пестициди в хранителни суровини, както и за разделяне на неорганични съединения, включително радиоизотопи, лантаниди, актиниди и др.. Анализ на биополимери (протеини, нуклеинова киселинаи т.н.), което обикновено отнема часове или дни, се извършва с помощта на йонообменна хроматография за 20-40 минути с по-добро разделяне. Използването на йонообменна хроматография в биологията направи възможно наблюдаването на проби директно в биологична среда, намалявайки възможността за пренареждане или изомеризация, което може да доведе до неправилно тълкуване на крайния резултат. Интересно е да се използва този метод за наблюдение на промените, настъпващи в биологичните течности. Използването на порести слаби анионобменници на базата на силикагел позволи разделянето на пептидите. V

Йонообменният механизъм може да бъде представен под формата на следните уравнения:

за анионен обмен

X-+R+Y- ч ->■ Y-+R+X-.

за катионен обмен |

X+ + R-Y+ h=* Y++R-X+.

В първия случай йонът на пробата X~ се конкурира с йона на подвижната фаза Y~ за R+ йонните центрове на йонообменника, а във втория случай катионите на пробата X+ се конкурират с Y+ йоните на подвижната фаза за R ~ йонни центрове.

Естествено, йони на пробата, които слабо взаимодействат с йонообменника, ще бъдат слабо задържани в колоната по време на това състезание и ще бъдат първите, които ще бъдат измити от нея, и обратно, по-силно задържаните йони ще бъдат последни, които ще се елуират от колоната . Обикновено BTqpH4Hbie взаимодействия с нейонен характер възникват поради адсорбция или водородни връзки на пробата с нейонната част на матрицата или поради ограничената разтворимост на пробата в подвижната фаза. Трудно е да се изолира „класическата“ йонообменна хроматография в нейната „чиста“ форма и затова някои хроматографи изхождат от емпирични, а не от теоретични принципи в йонообменната хроматография.

Разделянето на конкретни вещества зависи преди всичко от избора на най-подходящия сорбент и подвижна фаза. Йонообменните смоли и силикагелите с присадени йоногенни групи се използват като неподвижни фази в йонообменната хроматография.

2.4. СЕКЦИОННА ИЗКЛЮЧВАЩА ХРОМАТОГРАФИЯ

Изключващата хроматография е опция! течна хроматография, при която се получава разделяне поради разпределението на молекулите между разтворителя, разположен вътре в порите на сорбента, и протичащия разтворител " между неговите частици.

За разлика от други опции за HPLC, където разделянето идваПоради различните взаимодействия на компонентите с повърхността на сорбента, ролята на твърдия пълнител в хроматографията за изключване на размера е само да образува пори с определен размер, а неподвижната фаза е разтворителят, който запълва тези пори. Следователно, използването на термина "сорбент" за тези пълнители е до известна степен произволно.

Основна характеристика на метода е способността да се разделят молекулите според техния размер в разтвор в диапазона на почти всяко молекулно тегло - от 10 2 до 10 8, което го прави незаменим за изследване на синтетични и биополимери.

Традиционно процесът, извършван в органични разтворители, все още често се нарича гелпроникваща хроматография, а във водни системи - гелфилтрационна хроматография. В тази книга и за двата варианта е приет един термин, който идва от английското „Size Exclusion“ - изключване по размер - и най-пълно отразява механизма на процеса.

В монографии е направен подробен анализ на съществуващите идеи относно много сложната теория на процеса на хроматография с изключване на размера.

Общ обем на разтворителя в колоната Vt (това често се нарича общ обем на колоната, тъй като Vd не участва в хроматографския процес) е сумата от обемите на подвижната и неподвижната фаза.

Задържането на молекули в колона за изключване се определя от вероятността за тяхната дифузия в порите и зависи от съотношението на размерите на молекулите и порите, което е показано схематично на фиг. 2.15. Коефициент на разпределение Ка,както и в други варианти на хроматография, това е съотношението на концентрациите на веществото в неподвижната и подвижната фаза.

Тъй като подвижната и неподвижната фаза имат еднакъв състав, тогава Kd вещество, за което и двете фази са еднакво достъпни, е равно на единица. Тази ситуация се реализира за молекули С с най-малки размери (включително молекулите на разтворителя), които проникват във всички пори (виж фиг. 2.15) и следователно се движат през колоната най-бавно. Задържащият им обем е равен на общия обем на разтворителя Vt-

Ориз. 2.15. Модел на молекулярно разделяне чрез измерване в хроматография с изключване на размера

Всички молекули, чийто размер е по-голям от размера на порите на сорбента, не могат да влязат в тях (пълно изключване) и да преминат през каналите между частиците. Те се елуират от колоната със същия обем на задържане, равен на обема на подвижната фаза V 0 - Коефициентът на разпределение за тези молекули е нула.

Молекулите с междинен размер, способни да проникнат само в някои от порите, се задържат в колоната според техния размер. Коефициентът на разпределение на тези молекули варира от нула до 1 и характеризира частта от обема на порите, достъпна за молекули с даден размер.Техният задържан обем се определя от сумата на V o и достъпната част от обема на порите.

КАЧЕСТВЕН АНАЛИЗ

Хроматограф, който навлиза в областта на високоефективната течна хроматография, трябва да се запознае с основите на качествения анализ. Качественият анализ се използва за идентифициране на познат продукт, получен по нов начин или намерен в смес с други продукти." Необходим е при изолиране на различни компоненти от сложни биологични и химични смеси, което е особено важно в медицината, криминалистиката, екологията, за наблюдение на наличието на някои лекарствени химични продукти и техните метаболити в биометал.. "Запознаването с основите на качествения" анализ ще помогне да се избегнат често срещани грешки, например разграничаване на примеси в проба от примеси в разтворител или проверка на чистотата на дадено вещество на повече от един спектрофотометър с дължина на вълната, но на различни и др.

Преди да продължите с анализа, е необходимо да определите дали цялата проба се елуира от колоната от дадена система от разтворители или не. За да сте сигурни в пълното елуиране, е необходимо да се събере цялата течност, изтичаща от колоната, да се изпари разтворителят, да се претегли остатъкът и да се установи степента на възстановяване на пробата.

Идентифицирането на компоненти в HPLC може да се извърши по три начина: 1) използване на информация за задържане; 2) изследвайте зоните, получени по време на разделянето в колона с течен хроматограф, като използвате спектрални или химичен анализ; 3) директно свържете спектралния анализатор към колоната.

Задържащият обем се използва за записване на пикове в хроматографията. V R или време на задържане t R. И двете величини са характерни за дадено вещество в дадена хроматографска система. Тъй като времето на задържане на отделяното вещество се състои от времето на взаимодействие в колоната и времето на преминаване на празните секции на тръбата, то варира от инструмент до инструмент. Удобно е да имате вещество, което не се задържа от дадена колона, като го вземете за стандарт, чието време на задържане и обем T 0 , V o. Хроматографията на веществото и стандарта трябва да се извършват при еднакви условия (налягане и скорост на потока). Когато се идентифицират чрез данни за задържане, известните отделни вещества, които могат да присъстват в пробите, се разделят в същата хроматографска система и за тях се получават стойности t R. Сравнявайки тези стойности t R с времето на задържане на неизвестния пик, може да се установи, че те или съвпадат, в който случай е вероятно пиковете да съответстват на едно и също вещество, или t R известно вещество не съответства t R непозната зона. Тогава все още е възможна приблизителна оценка на стойностите t R вещества, които не са достъпни за директно измерване на степента на тяхното задържане. Нека разгледаме и двата варианта.

В първия случай очевидно е необходимо предварително изследване на пробата, за да се постулира наличието на специфични вещества в нея. При работа с прости смеси не е трудно да се определи дали степента на задържане на зоните на пробата и известните вещества съвпада или не, т.е. tB еднакви или различни. В случай на сложни смеси, няколко вещества могат да се елуират с подобни стойности t R, и действително получените зони по време на хроматографското разделяне се припокриват. В резултат на това се получават точни стойности t R става невъзможно за различни зони. Надеждността на идентификацията се увеличава с увеличаване на разделителната способност, по-внимателен контрол на условията на разделяне и многократно измерване на стойностите t R и осредняване на намерените стойности. В този случай хроматографското разделяне на известни и неизвестни вещества трябва да се редува. При разделяне на сложни смеси стойността t R веществата могат да се променят под въздействието на матрицата на самата проба. Този ефект е възможен в началото на хроматограмата и когато пиковете се припокриват; Възможно е и затягане на зоните, както вече беше споменато.

В такива случаи стандартът трябва да се добави към пробата в съотношение 1: 1. Ако веществата са идентични, стойността t R изходният материал не се променя и в хроматограмата се получава само един пик. Ако имате устройство с циклична хроматографска система, тогава за надеждна идентификация е препоръчително да прекарате сместа през колоната няколко пъти.

Информация за нивата на задържане също може да се намери в литературата, но стойността на тази информация е ограничена. Тъй като колоните дори от една и съща партида дават лоша възпроизводимост, литературните стойности не винаги отговарят на истинската стойност t R на тази колона. За адсорбционната хроматография обаче е възможно да се предвиди t R въз основа на литературни данни. Друга трудност е свързана с използването на литературни значения t R, - трудността при намирането им в специализираната литература, въпреки че библиографските прегледи, публикувани в Journal of chromatography, имат актуализиран индекс по вид вещество.

Във втория случай, когато времената на задържане на известните съединения и пробните зони не съвпадат, е възможно да се предвиди времето на задържане на неизвестния компонент. Прогнозите за относителното задържане въз основа на структурни данни в пространствената ексклюзивна хроматография са доста надеждни. Те са по-малко точни при адсорбционна и разделителна хроматография и особено когато работят върху химически свързана фаза. За йонна и йонно-двойна хроматография на вещества с известни p КаВъзможни са само приблизителни определяния на стойностите tR. Винаги е по-лесно да се предвиди относително задържане или *x стойности, отколкото абсолютни стойности к". Относителни стойности t R по-лесен за оценка за свързани съединения или производни, като например заместени алкилкарбоксилни киселини или бензенови производни.

При изократно разделяне на хомолози или олигомери понякога се наблюдава следният модел:

\ gk" = А + Bn,

Където АИ IN- константи за брой избрани проби и за дадена хроматографска система (на една и съща колона, с еднакви подвижни и неподвижни фази); П- броят на идентичните структурни единици в молекулата на пробата.

Въвеждането на функционална група / в молекулата на пробата ще доведе до промяна к" в първото уравнение с някакъв постоянен коефициент a/ в дадена хроматографска система. Възможно е да се получат групови константи а/ за различни заместващи групи/, чиито стойности ще нарастват с увеличаване на полярността на функционалните групи при всички видове хроматография, с изключение на обратната фаза, където стойностите на константите ще намаляват с нарастваща полярност.

Някои групови константи а/ за различни заместващи групи/ са дадени в табл. 9.1.

При адсорбционната хроматография първото уравнение не винаги е приложимо, тъй като е валидно при условие, че всички изомери имат еднаква стойност к", което не винаги се спазва. Възможно е обаче да се начертае графика на logfe" на същите съединения на една колона спрямо logfe" на същите съединения на различна колона или спрямо съответните характеристики в тънкослойна хроматография, например log[(l- Rf) IRf].

Стойностите на коефициента на капацитет могат да се използват при сравняване на данни за задържане к", защото за разлика от него t R скоростта на подвижната фаза и геометричните характеристики на колоната не са засегнати.

Разделянето на химически свързаните фази е подобно на разделянето чрез разделителна хроматография с подобни фази и следователно данните за екстракция в стационарно състояние могат да се използват за прогнозиране на времето на задържане.

При йонообменната хроматография три фактора влияят върху степента на задържане: степента на йонизация на киселините и основите, зарядът на йонизираната молекула и способността на веществото от водната подвижна фаза, използвана в йонообменната хроматография, да мигрира в органичните фаза. Последното зависи от молекулното тегло на съединението и неговата хидрофобност. Следователно по-силните киселини или основи се задържат по-силно по време на анионобменно или катионнообменно разделяне. При намаляване pK aна отделна киселина, включена в пробата, задържането се увеличава, когато редица киселини се отделят поради анионен обмен, а с увеличаване на p/C o, задържането на основи се увеличава, когато те се разделят поради катионен обмен.

По този начин съвпадението на времето на задържане на известно вещество с наблюдаваното дава възможност да се предположи тяхната идентичност. Надеждността на идентификацията се увеличава, ако хроматограмите на известно вещество и неизвестен компонент се сравняват при различни условия. Ако веществата се държат еднакво при адсорбция и обратна фаза или йонообменна и хроматография с изключване по размер, надеждността на идентификацията се увеличава. Ако надеждността на идентификацията при еднакво относително задържане е 90%, тогава при изследване на поведението на едни и същи вещества при значително различни условия надеждността на идентификацията вече е 99%.

Ценна характеристика на дадено вещество, използвано при идентификация, е съотношението на сигналите, получени за дадено вещество на два различни детектора. Анализираното вещество, след като излезе от колоната, преминава първо през първия детектор, след това през втория, а сигналите, идващи от детекторите, се записват едновременно с помощта на многописково записващо устройство или на два записващи устройства. Обикновено се използва последователно свързване на ултравиолетов детектор (по-чувствителен, но селективен) с рефрактометър, или ултравиолетов с флуоресцентен детектор, или два ултравиолетови детектора, работещи на различни дължини на вълната. Относителният отговор, т.е. съотношението на сигнала на рефрактометъра към сигнала на фотометъра, е характеристика на веществото, при условие че и двата детектора работят в своя линеен диапазон; това се тества чрез прилагане на различни количества от едно и също вещество. Качествена информация може да бъде получена чрез работа с фотометрични детектори, оборудвани с устройство за спиране на потока, което позволява спектърът на пика, излизащ от колоната, да бъде записан, докато е в проточната клетка, сравнявайки го със спектъра на известно съединение.

Съвременните, все още скъпи, спектрофотометри с диодна матрица представляват значителен интерес за идентификация.

Напълно непознато вещество не може да бъде идентифицирано само с помощта на високоефективна течна хроматография; необходими са и други методи.

КОЛИЧЕСТВЕН АНАЛИЗ

Количествената течна хроматография е добре разработен аналитичен метод, който не отстъпва по точност на количествената газова хроматография и значително надвишава точността на TLC или електрофореза.За съжаление в HPLC няма детектор, който да има близка чувствителност за съединения с различна химична структура ( като катарометър в GLC) Следователно, за да се получат количествени резултати, калибрирането на устройството е задължително.

Количественият анализ се състои от следните етапи: 1) хроматографско разделяне; 2) измерване на пикови площи или височини; 3) изчисляване на количествения състав на сместа въз основа на хроматографски данни; 4) интерпретация на получените резултати, т.е. статистическа обработка. Нека разгледаме всички тези етапи.

4.1. ХРМАТОГРАФСКО РАЗДЕЛЯНЕ

По време на вземането на проби могат да се допуснат грешки. Особено важно е да се избягват грешки и да се получи подходяща представителна проба от хетерогенни твърди вещества, летливи или нестабилни вещества и селскостопански продукти и биоматериали. Хетерогенните проби, например хранителни продукти, се смесват старателно и се нарязват на четвъртинки. Чрез многократно извършване на тази операция се постига хомогенност на пробата.

Грешки и загуби на вещества могат да бъдат направени на етапа на екстракция, изолиране, пречистване и др.

Пробите трябва да бъдат напълно разтворени и техните разтвори приготвени с точност от ±0,1%. Препоръчително е пробата да се разтвори в подвижната фаза, което ще елиминира възможността за нейното утаяване след въвеждане в хроматографа. Ако разтварянето в подвижната фаза не е възможно, тогава трябва да се използва разтворител, който може да се смесва с него, и обеми на пробата (по-малко от 25 µl) трябва да бъдат въведени в хроматографа.

Могат да възникнат значителни грешки по време на инжектирането на пробата поради фракциониране на пробата, изтичане и размазване на пика. Замъгляването на пиковете причинява образуването на опашки, което води до частично припокриване на пиковете и, като следствие, до грешки в откриването. Устройствата с кръгов клапан са за предпочитане пред спринцовките за въвеждане на проба при количествен анализ поради по-висока точност и по-малка зависимост от оператора.

При хроматографско разделяне на вещества също могат да възникнат усложнения, които водят до изкривяване на данните: количествен анализ. Възможно е да има разлагане или превръщане на пробата по време на хроматографския процес или необратима адсорбция на веществото върху колоната. Важно е да се гарантира липсата на тези нежелани явления и, ако е необходимо, регенерирайте колоната или я сменете. Пиковото припокриване и изоставането също могат да бъдат намалени чрез промяна на хроматографските условия.

Пикове с фалшиви или неясни форми, както и пикове, чието време на освобождаване е близко до да се, тъй като разделянето им може да не е достатъчно. Обикновено се използват пикове със стойност d"^0,5. Най-висока ефективност на колоната се постига чрез въвеждане на 10~ 5 -10~ 6 g разтворено вещество на 1 g сорбент. При въвеждане на големи количества проба, зависимостта от пиковата височина на товара може да се окаже нелинейна и е необходима количествена оценка по пикови площи.

Грешките, свързани с откриването или усилването, водят до значително изкривяване на резултатите от хроматографското разделяне. Всеки детектор се характеризира със специфичност, линейност и чувствителност. Тестването за селективност е особено важно при анализиране на следи от примеси. Реакцията на UV детекторите може да варира с коефициент 104 спрямо вещества с подобни функционални групи. Необходимо е да се калибрира реакцията на детектора за всеки аналит. Естествено, вещества, които не абсорбират в UV областта, няма да дадат сигнал на записващото устройство, когато се използва като фотометър детектор. При използване на рефрактометър може да се появят отрицателни пикове. Освен това този детектор трябва да бъде термостатиран, което не се изисква за UV детектора.

Линейността на детектора определя размера на инжектираната проба. Важно е да запомните, че дебитът на колоната, температурите на колоната и детектора и конструкцията на детектора влияят върху точността на количествения анализ. Грешки при предаването на електрически сигнал към изходно устройство (рекордер), интегратор или компютър могат да възникнат поради индукция на шум, липса на заземяване, колебания на напрежението в мрежата и др.

4.2. ИЗМЕРВАНЕ НА ПИКОВА ПЛОЩ ИЛИ ВИСОЧИНА

Височина на върха ч (Фиг. 10.1) е разстоянието от върха на пика до основната линия; то се измерва линейно или чрез преброяване на броя на деленията на записващо устройство. Някои електронни интегратори и компютри предоставят информация за пиковите височини. Позицията на базовата линия на изместените пикове се намира чрез интерполиране на ординатните стойности, съответстващи на началото и края на пика (пик 1 и 3виж фиг. 10.1). За да се подобри точността, е необходимо да има равна, стабилна базова линия. В случай на неразделени пикове, базовата линия се изчертава между началото и края на пика, вместо да се заменя с нулева линия. Тъй като височините на пиковете са по-малко зависими от влиянието на съседни припокриващи се пикове, оценката на височината на пиковете е по-точна и почти винаги се използва в анализа на следите.

Пиковата площ може да се определи по различни начини. Нека разгледаме някои от тях.

1. Планиметричният метод включва проследяване на пика с ръчен планиметър, който е устройство, което механично определя площта на пика. Методът е точен, но трудоемък и слабо възпроизводим. Този метод не се препоръчва.

2. Метод на хартиен силует - върхът се изрязва и претегля. Методът е силно възпроизводим, но трудоемък и хроматограмата се унищожава. Неговата приложимост зависи от еднородността на диаграмата. Методът също не може да се препоръчва широко.

4. Методът на триангулация се състои в конструиране на триъгълник чрез начертаване на допирателни към страните на върха. Върхът на триъгълника е по-висок от върха на върха. Увеличаването на площта, образувана от този удължен връх, ще бъде последователно в цялата хроматограма и няма да повлияе значително на точността. Освен това част от загубената площ при чертане на допирателните ще бъде компенсирана. Основата на триъгълника се определя от пресечната точка на допирателните с основната линия, а площта се определя от произведението на 7 g от основата и височината. Този метод е най-добрият за определяне на площите на асиметричните пикове. Въпреки това, възпроизводимостта при конструиране на тангенти от различни оператори е различна и следователно; ниско.

5. Методът на дисковия интегратор се основава на електромеханично устройство, прикрепено към записващо устройство. Писалката, прикрепена към интегратора, се движи по лента в долната част на лентата със скорост, пропорционална на движението на писалката на записващото устройство.

Както при ръчните измервания, пикът трябва да остане в скалата на записващото устройство, но корекциите за компенсиране на изместването на базовата линия и непълното разделяне на съседни пикове намаляват надеждността и увеличават времето за анализ.

Методът е по-точен от методите за ръчно измерване, особено за асиметрични пикове, и предлага предимство в скоростта. В допълнение, той осигурява постоянен количествен запис на анализа.

6. Методите, използващи електронни интегратори, които определят площта на пика и отпечатват информация за тази област и времето на задържане, могат да включват корекция на изместване на базовата линия и да определят площта само на частично разделени пикове. Основните предимства са точност, бързина, независимост на действието от работата на рекордера. Интеграторите имат памет и могат да бъдат програмирани за специфичен анализ с помощта на предварително инсталирана програма. Предимствата на интегратора включват способността му да използва корекционни фактори за реакцията на детектора при преизчисляване на оригиналните данни за площите на пиковете, компенсирайки разликите в чувствителността на детектора към различни вещества. Такива системи спестяват време, подобряват аналитичната точност и са полезни за рутинен аналитичен анализ.

7. В течната хроматография компютрите се използват широко за измерване на площите на пиковете. Те отпечатват пълно съобщение, включително имената на веществата, пикови площи, времена на задържане, корекционни фактори на реакцията на детектора и изобилие (тегловни %) за различните компоненти на пробата.

ОБЩА ФАРМАКОПЕЙНА СТАТИЯ

Вместо чл. GF XI

Високоефективната течна хроматография (течна хроматография под високо налягане) е метод на колонна хроматография, при който подвижната фаза е течност, движеща се през хроматографска колона, пълна с неподвижна фаза (сорбент). Колоните за високоефективна течна хроматография се характеризират с високо хидравлично съпротивление на входа.

В зависимост от механизма на разделяне на веществата се разграничават следните варианти на високоефективна течна хроматография: адсорбция, разделяне, йонообмен, изключване, хирален и др. В съответствие с естеството на основните междумолекулни взаимодействия, които възникват. При адсорбционната хроматография разделянето на веществата се дължи на тяхната различна способност да се адсорбират и десорбират от повърхността на сорбент с развита повърхност, например силикагел. При разпределителната високоефективна течна хроматография разделянето възниква поради разликата в коефициентите на разпределение на веществата, които се разделят между неподвижната фаза (обикновено химически присадена към повърхността на неподвижен носител) и подвижната фаза.

В зависимост от вида на подвижната и неподвижната фаза се разграничават нормалнофазова и обратнофазова хроматография. При нормалнофазовата високоефективна течна хроматография стационарната фаза е полярна (най-често силикагел или силикагел с присадени NH 2 или CN групи и др.), а подвижната фаза е неполярна (хексан или смеси от хексан с по-полярни органични разтворители - хлороформ, алкохоли и др.). Задържането на вещества се увеличава с увеличаване на полярността. При нормална фазова хроматография способността за елуиране на подвижната фаза се увеличава с увеличаване на полярността.

При хроматографията с обърната фаза стационарната фаза е неполярна (хидрофобни силикагелове с присадени групи С4, С8, С18 и др.); подвижна фаза – полярна (смеси от вода и полярни разтворители: ацетонитрил, метанол, тетрахидрофуран и др.). Задържането на вещества се увеличава с увеличаване на хидрофобността (неполярност). Колкото по-високо е съдържанието на органичен разтворител, толкова по-висока е способността за елуиране на подвижната фаза.

В йонообменната хроматография молекулите на смес от вещества, дисоциирани в разтвор на катиони и аниони, се разделят при движение през сорбент (катионобменник или анионобменник) поради различната сила на взаимодействие на определени йони с йонни групи на сорбента.

При хроматографията с изключване на размера (сито, гел-проникване, гел-филтрация) молекулите на веществата се разделят по размер поради различната им способност да проникват през порите на неподвижната фаза. В този случай най-големите молекули, които могат да проникнат в минималния брой пори на стационарната фаза, са първите, които напускат колоната, а веществата с малки молекулни размери са последните, които напускат.

Хиралната хроматография разделя оптически активните съединения на отделни енантиомери. Разделянето може да се извърши върху хирални стационарни фази или върху ахирални стационарни фази, като се използват хирални подвижни фази.

Има и други възможности за високоефективна течна хроматография.

често разделянето става не по един, а по няколко механизма едновременно, в зависимост от вида на подвижната и неподвижната фаза, както и от природата на определяното съединение.

Област на приложение

Високоефективната течна хроматография се използва успешно както за качествен, така и за количествен анализ лекарствав тестовете “Автентичност”, “Чужди примеси”, “Разтваряне”, “Еднородност на дозировката”, “Количествено определяне”. Трябва да се отбележи, че хроматографията ви позволява да комбинирате няколко теста в една проба, включително „Автентичност“ и „Количествено определяне“.

Оборудване

За извършване на анализа се използват подходящи инструменти - течни хроматографи.

Течният хроматограф обикновено включва следните основни компоненти:

— единица за подготовка на подвижната фаза, включваща контейнер с подвижната фаза (или контейнери с отделни разтворители, включени в подвижната фаза) и система за обезгазяване на подвижната фаза;

— помпена система;

— смесител за подвижна фаза (ако е необходимо);

— система за въвеждане на пробата (инжектор), може да бъде ръчна или автоматична (автоматичен пробоотборник);

— хроматографска колона (може да се монтира в термостат);

- детектор (един или повече с различни начиниоткриване);

— система за контрол на хроматографа, събиране и обработка на данни.

Освен това хроматографът може да включва: система за подготовка на пробата и предколонен реактор, система за превключване на колони, следколонен реактор и друго оборудване.

Помпена система

Помпите доставят подвижната фаза към колоната с определена скорост. Съставът на подвижната фаза и скоростта на потока могат да бъдат постоянни или вариращи по време на анализа. При постоянен състав на подвижната фаза процесът се нарича изократичен, а във втория – градиентен. Модерната помпена система за течен хроматограф се състои от една или повече компютърно контролирани помпи. Това ви позволява да промените състава на подвижната фаза според специфична програма по време на градиентно елуиране. Помпите за аналитична високоефективна течна хроматография ви позволяват да поддържате скоростта на потока на подвижната фаза в колоната в диапазона от 0,1 до 10 ml / min при налягане на входа на колоната до 40 MPa. Пулсациите на налягането са сведени до минимум чрез специални амортисьорни системи, включени в конструкцията на помпите. Работните части на помпите са изработени от устойчиви на корозия материали, което позволява използването на агресивни компоненти в подвижната фаза.

Кранове

В миксера се образува единична подвижна фаза от отделни разтворители, подавани от помпи, ако необходимата смес не е предварително приготвена. Смесването на компонентите на подвижната фаза в смесителя може да стане както при ниско налягане (преди помпите), така и при високо налягане (след помпите). Смесителят може да се използва за приготвяне на подвижна фаза и изократно елуиране.

Обемът на миксера може да повлияе на времето на задържане на компонентите по време на градиентно елуиране.

Инжектори

Инжекторите могат да бъдат универсални, с възможност за промяна на обема на инжектираната проба или дискретни за инжектиране само на определен обем проба. И двата типа инжектори могат да бъдат автоматични („автоинжектори“ или „автосамплери“). Инжекторът за въвеждане на пробата (разтвор) е разположен непосредствено пред хроматографската колона. Конструкцията на инжектора ви позволява да промените посоката на потока на подвижната фаза и да извършите предварително въвеждане на пробата в дозиращ контур с определен обем (обикновено от 10 до 100 μl) или в специално дозиращо устройство с променлив обем . Обемът на цикъла е посочен върху неговата маркировка. Дизайнът на дискретния инжектор обикновено позволява смяна на контура. Съвременните автоматични инжектори могат да имат редица допълнителни функции, например да изпълняват функцията на станция за подготовка на проби: смесват и разреждат проби, извършват реакция на дериватизация преди колоната.

Хроматографска колона

Хроматографските колони обикновено са тръби от неръждаема стомана, стъкло или пластмаса, пълни със сорбент и затворени от двете страни с филтри с диаметър на порите 2–5 µm. Дължината на аналитичната колона може да бъде в диапазона от 5 до 60 cm или повече, вътрешният диаметър може да бъде от 2 до 10 mm. Колони с вътрешен диаметър по-малък от 2 mm се използват в микроколонната хроматография. Има и капилярни колони с вътрешен диаметър около 0,3–0,7 mm. Колоните за препаративна хроматография могат да имат вътрешен диаметър от 50 mm или повече.

Пред аналитичната колона могат да се монтират къси колони (предколони), за да изпълняват различни спомагателни функции, основната от които е защитата на аналитичната колона. Обикновено анализът се извършва при стайна температура, но за да се повиши ефективността на разделяне и да се намали времето за анализ, може да се използва колонен термостат при температури до 80 - 100 °C. Възможността за използване на повишени температури по време на разделянето е ограничена от стабилността на неподвижната фаза, тъй като нейното разрушаване е възможно при повишени температури.

Стационарна фаза (сорбент)

Следните обикновено се използват като сорбенти:

• силикагел, алуминиев оксид, използван в нормална фазова хроматография. Механизмът на задържане в този случай обикновено е адсорбция;
• силикагел, смоли или полимери, присадени с киселинни или основни групи. Област на приложение – йонообменна и йонна хроматография;
• силикагел или полимери с определено разпределение на размера на порите (хроматография с изключване по размер);
• химически модифицирани сорбенти (сорбенти с присадени фази), приготвени най-често на базата на силикагел. Механизмът на задържане е адсорбция или разпределение между подвижната и неподвижната фаза. Обхватът на приложение зависи от вида на присадените функционални групи. Някои видове сорбенти могат да се използват както в хроматография с обратна, така и в нормална фаза;
• химически модифицирани хирални сорбенти, например производни на целулоза и амилоза, протеини и пептиди, циклодекстрини, хитозани, използвани за разделяне на енантиомери (хирална хроматография).

Сорбентите с присадени фази могат да имат различна степен на химична модификация. Най-често използваните присадени фази са:

– октадецилови групи (сорбент октадецилсилан (ODS) или C 18);

– октилови групи (сорбент октилсилан или C 8);

– фенилови групи (сорбент фенилсилан);

– цианопропилови групи (CN сорбент);

– аминопропилови групи (NH 2 сорбент);

– диолови групи (сорбент диол).

Най-често анализът се извършва върху неполярни присадени фази в режим на обърната фаза, като се използва сорбент С 18.

Сорбентите с присадени фази, получени на базата на силикагел, са химически стабилни при стойности на pH от 2,0 до 7,0, освен ако не е изрично посочено друго от производителя. Частиците на сорбента могат да имат сферична или неправилна форма и различна порьозност. Размерът на частиците на сорбента в аналитичната високоефективна течна хроматография обикновено е 3–10 µm, в препаративната високоефективна течна хроматография - 50 µm или повече. Има и монолитни колони, в които сорбентът е монолит с проходни пори, запълващ целия обем на колоната.

Високата ефективност на разделяне се осигурява от голямата повърхност на частиците на сорбента (което е следствие от техния микроскопичен размер и наличието на пори), както и от еднородния състав на сорбента и неговата плътна и равномерна опаковка.

Детектори

Високоефективната течна хроматография използва различни методи за откриване. В общия случай подвижната фаза с разтворени в нея компоненти след хроматографската колона навлиза в детекторната клетка, където непрекъснато се измерват едни или други нейни свойства (абсорбция в ултравиолетовата или видимата област на спектъра, флуоресценция, индекс на пречупване, електрическа проводимост и др.). Получената хроматограма е графика на зависимостта на някакъв физичен или физикохимичен параметър на подвижната фаза от времето.

Най-често срещаните детектори във високоефективната течна хроматография са спектрофотометрични. По време на елуирането на веществата, оптичната плътност на елуата се измерва в специално проектирана микрокювета при предварително избрана дължина на вълната. Широкият диапазон на линейност на детектора позволява анализ както на примеси, така и на основните компоненти на сместа в една хроматограма. Спектрофотометричният детектор позволява откриване при всяка дължина на вълната в неговия работен диапазон (обикновено 190-600 nm). Използват се и многовълнови детектори, които позволяват откриване на няколко дължини на вълната едновременно, и детектори с диодна матрица, които позволяват оптичната плътност да се записва едновременно в целия работен диапазон на дължината на вълната (обикновено 190-950 nm). Това прави възможно записването на абсорбционните спектри на компонентите, преминаващи през детекторната клетка.

Флуориметричен детектор се използва за определяне на флуоресцентни съединения или нефлуоресцентни съединения под формата на техните флуоресцентни производни. Принципът на работа на флуориметричния детектор се основава на измерване на флуоресцентното излъчване на абсорбираната светлина. Абсорбцията обикновено се извършва в ултравиолетовата област на спектъра, като дължините на вълните на флуоресцентното лъчение надвишават дължините на вълните на абсорбираната светлина. Флуориметричните детектори имат много висока чувствителност и селективност. Чувствителността на флуоресцентните детектори е приблизително 1000 пъти по-висока от чувствителността на спектрофотометричните. Съвременните флуоресцентни детектори позволяват не само да се получат хроматограми, но и да се регистрират спектрите на възбуждане и флуоресценция на анализираните съединения.

За да определите съединения, които слабо абсорбират в ултравиолетовите и видимите области на спектъра (например въглехидрати), използвайте рефрактометричендетектори (рефрактометри). Недостатъците на тези детектори са тяхната ниска (в сравнение със спектрофотометричните детектори) чувствителност и значителна температурна зависимост на интензитета на сигнала (детекторът трябва да бъде термостатиран), както и невъзможността да се използват в режим на градиентно елуиране.

Принцип на действие изпарителни лазерни детектори за разсейване на светлинасе основава на разликата в налягането на парите на хроматографските разтворители, включени в подвижната фаза и анализираните вещества. Подвижната фаза на изхода на колоната се въвежда в пулверизатора, смесва се с азот или CO 2 и под формата на фин аерозол постъпва в нагрята изпарителна тръба с температура 30–160 °C, в която подвижният фаза се изпарява. Аерозол от нелетливи частици от анализираните вещества разпръсква светлинния поток в дисперсионната камера. По степента на дисперсия на светлинния поток може да се прецени количеството на определяното съединение. Детекторът е по-чувствителен от рефрактометричния, сигналът му не зависи от оптичните свойства на пробата, от вида на функционалните групи в определяните вещества, от състава на подвижната фаза и може да се използва в градиента. режим на елуиране.

Електрохимични детектори (кондуктометрични, амперометрични, кулонометрични и др.). Амперометричен детектор се използва за откриване на електроактивни съединения, които могат да бъдат окислени или редуцирани на повърхността на твърд електрод. Аналитичният сигнал е големината на окислителния или редукционния ток. Детекторната клетка има най-малко два електрода - работен електрод и референтен електрод (сребърнохлориден или стоманен). Към електродите се прилага работен потенциал, чиято стойност зависи от природата на определяните съединения. Измерванията могат да се извършват както при постоянен потенциал, така и в импулсен режим, когато профилът на промените в потенциала на работния електрод се задава по време на един цикъл на запис на сигнала. Амперометричният детектор използва работни електроди, изработени от въглеродни материали (най-често стъкловъглерод или графит) и метални: платина, злато, мед, никел.

Кондуктометричен детектор се използва за откриване на аниони и катиони в йонната хроматография. Принципът на неговото действие се основава на измерване на електропроводимостта на подвижната фаза по време на елуирането на веществото.

Изключително информативен е масспектрометричен детектор, който има висока чувствителност и селективност. Най-новите модели масспектрометри за течна хроматография работят в диапазона на масата m/z от 20 до 4000 amu.

Във високоефективната течна хроматография се използват и детектори на Фурие-IR, радиоактивност и някои други.

Система за събиране и обработка на данни

Модерна система за обработка на данни е персонален компютър, свързан с хроматограф с инсталиран софтуер, който ви позволява да записвате и обработвате хроматограма, както и да контролирате работата на хроматографа и да наблюдавате основните параметри на хроматографската система.

Мобилна фаза

Подвижната фаза във високоефективната течна хроматография изпълнява двойна функция: осигурява транспортирането на десорбираните молекули по протежение на колоната и регулира константите на равновесие и следователно задържане в резултат на взаимодействие със стационарната фаза (сорбирана на повърхността) и с молекулите на веществата, които се разделят. По този начин, чрез промяна на състава на подвижната фаза във високоефективната течна хроматография, е възможно да се повлияе на времето на задържане на съединенията, селективността и ефективността на тяхното разделяне.

Подвижната фаза може да се състои от един разтворител, често два и, ако е необходимо, три или повече. Съставът на подвижната фаза се посочва като обемно съотношение на съставните й разтворители. В някои случаи може да се посочи съотношението на масата, което трябва да бъде специално посочено. Като компоненти на подвижната фаза могат да се използват буферни разтвори с определена стойност на pH, различни соли, киселини и основи и други модификатори.

Хроматографията с нормална фаза обикновено използва течни въглеводороди (хексан, циклохексан, хептан) и други относително неполярни разтворители с малки добавки на полярни органични съединения, които регулират силата на елуиране на подвижната фаза.

При обратнофазовата хроматография като подвижна фаза се използват вода или водно-органични смеси. Органичните добавки обикновено са полярни органични разтворители (ацетонитрил и метанол). За оптимизиране на разделянето могат да се използват водни разтвори с определена стойност на рН, по-специално буферни разтвори, както и различни добавки към подвижната фаза: фосфорна и оцетна киселина при разделяне на киселинни съединения; амоняк и алифатни амини при разделяне на основни съединения и други модификатори.

Хроматографският анализ е силно повлиян от чистотата на подвижната фаза, така че е за предпочитане да се използват разтворители, произведени специално за течна хроматография (включително вода).

Когато се използва UV спектрофотометричен детектор, подвижната фаза не трябва да има значително поглъщане при дължината на вълната, избрана за откриване. Границата на прозрачност или оптичната плътност при определена дължина на вълната на определен производител на разтворител често се посочва на опаковката.

Подвижната фаза и анализираните разтвори не трябва да съдържат неразтворени частици и газови мехурчета. Водата, получена в лабораторни условия, водните разтвори, органичните разтворители, предварително смесени с вода, както и анализираните разтвори трябва да бъдат подложени на фина филтрация и дегазация. За тези цели обикновено се използва вакуумна филтрация през мембранен филтър с размер на порите 0,45 μm, инертен по отношение на даден разтворител или разтвор.

Списък на хроматографските условия, които трябва да бъдат уточнени

Фармакопейната монография трябва да съдържа: пълното търговско наименование на колоната с посочване на производителя и каталожния номер, размерите на колоната (дължина и вътрешен диаметър), вида на сорбента с посочване на размера на частиците, размера на порите, температурата на колоната (ако е термостатирана). необходимо), обемът на инжектираната проба (обемни контури), съставът на подвижната фаза и методът на нейното приготвяне, скоростта на подаване на подвижната фаза, типът на детектора и условията на детекция (ако е необходимо, параметрите на използваната детекторна клетка), описание на градиентния режим (ако се използва), включително етапа на повторно уравновесяване до първоначалните условия, време за хроматография, подробно описание на метода и формулата за изчисление, описание на подготовката на стандартни и тестови разтвори.

Ако дериватизацията преди колоната се използва в автоматичен семплер, се предоставя информация за програмата за автоматичен семплер. Ако се използва дериватизация след колона, се посочват скоростта на подаване на дериватизиращия реагент, обемът на смесителния контур и неговата температура.

Модифицирани видове високоефективна течна хроматография

Хроматография с йонни двойки

Една от разновидностите на високоефективната течна хроматография с обърната фаза е хроматографията с йонни двойки, която позволява определянето на йонизирани съединения. За тази цел към традиционната мобилна фаза за високоефективна течна хроматография с обратна фаза се добавят хидрофобни вещества. органични съединенияс йоногенни групи (реактиви на йонни двойки). Натриевите алкилсулфати обикновено се използват за разделяне на основи; тетраалкиламониевите соли (тетрабутиламониев фосфат, цетилтриметиламониев бромид и др.) се използват за разделяне на киселини. В режим на йонна двойка селективността на разделянето на нейонните компоненти ще бъде ограничена от механизма за задържане на обратната фаза и задържането на основи и киселини ще се увеличи значително, докато формата на хроматографските пикове ще се подобри.

Задържането в режим на йонна двойка се дължи на доста сложни равновесни процеси, които се конкурират помежду си. От една страна, поради хидрофобните взаимодействия и ефекта на изместване на полярната среда на подвижната фаза, сорбцията на хидрофобни йони върху повърхността на алкилсиликагел е възможна по такъв начин, че заредените групи да са обърнати към подвижната фаза. В този случай повърхността придобива йонообменни свойства и задържането се подчинява на законите на йонообменната хроматография. От друга страна, възможно е образуването на йонна двойка директно в обема на елуента, последвано от нейната сорбция върху сорбента по механизма на обърната фаза.

Хроматография на хидрофилно взаимодействие ( HILIC хроматография)

Хроматографията с хидрофилно взаимодействие се използва за разделяне на полярни съединения, които са слабо задържани при високоефективна течна хроматография с обратна фаза. В тази версия на хроматографията като подвижна фаза се използват смеси вода-ацетонитрил с добавяне на соли, киселини или основи. Стационарните фази, като правило, са силикагели, модифицирани с полярни групи (амино, диол, цианопропилови групи и др.). По-полярните съединения се задържат по-силно. Способността за елуиране на подвижната фаза се увеличава с увеличаване на полярността.

Йонообменна и йонна високоефективна течна хроматография

Йонообменната хроматография се използва за анализ както на органични (хетероциклични основи, аминокиселини, протеини и др.), така и на неорганични (различни катиони и аниони) съединения. Разделянето на компонентите на анализираната смес при йонообменна хроматография се основава на обратимото взаимодействие на йоните на анализираните вещества с йонообменните групи на сорбента. Тези сорбенти са главно полимерни йонообменни смоли (обикновено съполимери на стирен и дивинилбензен с присадени йонообменни групи) или силикагелове с присадени йонообменни групи. Сорбенти с групи: -NH 3 +, -R 3 N +, -R 2 HN +, -RH 2 N + и др. се използват за разделяне на аниони (анионобменници) и сорбенти с групи: -SO 3 –, - RSO 3 – , –COOH, -PO 3 – и други за разделяне на катиони (катионобменници).

Като подвижна фаза в йонообменната хроматография се използват водни разтвори на киселини, основи и соли. Обикновено буферните разтвори се използват за поддържане на определени стойности на pH. Също така е възможно да се използват малки добавки от водосмесими органични разтворители - ацетонитрил, метанол, етанол, тетрахидрофуран.

Йонна хроматография – вариант на йонообменна хроматография, при който се използва кондуктометричен детектор за откриване на определяните съединения (йони). За високочувствително определяне на промените в електрическата проводимост на подвижната фаза, преминаваща през детектора, фоновата електрическа проводимост на подвижната фаза трябва да бъде ниска.

Има два основни варианта на йонна хроматография.

Първият от тях, двуколонна йонна хроматография, се основава на потискане на електрическата проводимост на електролита на подвижната фаза с помощта на втора йонообменна колона или специална мембранна система за потискане, разположена между аналитичната колона и детектора. При преминаване през системата електропроводимостта на подвижната фаза намалява.

Вторият вариант на йонна хроматография е йонна хроматография с една колона. Тази опция използва подвижна фаза с много ниска електропроводимост. Като електролити широко се използват слаби органични киселини: бензоена, салицилова или изофталова.

Високоефективна течна хроматография с изключване по размер

Хроматографията с изключване по размер (гел хроматография) е специална версия на високоефективната течна хроматография, базирана на разделянето на молекулите по техния размер. Разпределението на молекулите между неподвижната и подвижната фаза се основава на размера на молекулите и отчасти на тяхната форма и полярност.

Възможни са два ограничаващи типа взаимодействие на молекули с пореста неподвижна фаза. Молекулите, по-големи от максималния диаметър на порите, изобщо не се задържат и се елуират първи, движейки се едновременно с подвижната фаза. Молекулите с размери, по-малки от минималния диаметър на порите на сорбента, свободно проникват през порите и последни се елуират от колоната. Останалите молекули, които имат междинни размери, се задържат частично в порите и по време на елуиране се разделят на фракции в съответствие с техните размери и частично проникват в порите на сорбента в зависимост от техния размер и частично в зависимост от тяхната форма. В резултат на това веществата се елуират с различни времена на задържане.

Хроматография с изключване на йони

Механизмът на йоноизключителната хроматография се основава на ефекта, в резултат на който съединенията в йонизирана форма не се задържат върху йонообменния сорбент, докато съединенията в молекулярна форма се разпределят между неподвижната и водната фаза вътре в порите на йонообменния сорбент. и подвижната фаза, мигрираща в пространството между частиците на сорбента. Разделянето се основава на електростатично отблъскване, полярни и хидрофобни взаимодействия между разтворените съединения и сорбента.

Анионните групи на повърхността на сорбента действат като полупропусклива „мембрана“ между неподвижната и подвижната фаза. Отрицателно заредените компоненти не достигат стационарната подвижна фаза, тъй като се отблъскват от сходно заредени функционални групи и се елуират в „мъртвия“ (свободен) обем на колоната. Компонентите в молекулярна форма не се „отхвърлят” от катионообменния сорбент и се разпределят между неподвижната и подвижната фаза. Разликата в степента на задържане на нейонните компоненти на сместа е продиктувана от комбинация от полярни взаимодействия на нейонни компоненти с функционалните групи на катионообменния сорбент и хидрофобни взаимодействия на нейонни компоненти с неполярната матрица на сорбента.

Хирална хроматография

Целта на хиралната хроматография е разделянето на оптичните изомери. Разделянето се извършва върху хирални стационарни фази или върху конвенционални ахирални стационарни фази, като се използват хирални подвижни фази. Като хирални стационарни фази се използват сорбенти с модифицирана повърхност, групи или вещества с хирални центрове (хитозани, циклодекстрини, полизахариди, протеини и др. (хирални селектори). В този случай същите фази като при нормална фаза или обратна фаза фазова хроматография Когато се използват ахирални стационарни фази, за да се осигури разделянето на енантиомерите, хиралните модификатори ще бъдат добавени към подвижните фази: хирални метални комплекси, неутрални хирални лиганди, хирални йонни двойки реагенти и др.

Свръхефективна течна хроматография

Свръхефективната течна хроматография е вариант на течна хроматография, който е по-ефективен от класическата високоефективна течна хроматография.

Характеристика на ултра-ефективната течна хроматография е използването на сорбенти с размер на частиците от 1,5 до 2 микрона. Размерите на хроматографската колона обикновено варират от 50 до 150 mm дължина и 1 до 4 mm в диаметър. Обемът на инжектираната проба може да варира от 1 до 50 µl. Използването на такива хроматографски колони може значително да намали времето за анализ и да увеличи ефективността на хроматографското разделяне. Въпреки това, в този случай налягането върху колоната може да достигне 80–120 MPa, необходимата честота на събиране на данни от детектора може да се увеличи до 40–100 херца и обемът на извънколоната на хроматографската система трябва да бъде сведен до минимум. Хроматографското оборудване и колоните, използвани в ултра-ефективната течна хроматография, са специално адаптирани да отговарят на изискванията на този тип хроматография.

Оборудването, предназначено за ултра-ефективна течна хроматография, може да се използва и в класическата версия на високоефективна течна хроматография.

(главно междумолекулни) на фазовата граница. Като метод за анализ HPLC е част от група методи, които поради сложността на изследваните обекти включват предварително разделяне на оригиналната сложна смес на относително прости. След това получените прости смеси се анализират с помощта на конвенционални физикохимични методи или специални методи, разработени за хроматография.

Методът HPLC се използва широко в области като химия, нефтохимия, биология, биотехнологии, медицина, хранително-вкусова промишленост, опазване на околната среда, фармацевтично производство и много други.

Според механизма на разделяне на анализираните или разделени вещества, HPLC се разделя на адсорбция, разпределение, йонообмен, изключване, лиганд обмен и други.

Трябва да се има предвид, че в практическа работаразделянето често става не чрез един, а чрез няколко механизма едновременно. По този начин разделянето на изключването може да бъде усложнено от адсорбционни ефекти, адсорбционното разделяне чрез ефекти на разпределение и обратно. Освен това, колкото по-голяма е разликата между веществата в пробата по отношение на степента на йонизация, основност или киселинност, молекулно тегло, поляризуемост и други параметри, толкова по-голяма е вероятността за различен механизъм на разделяне на такива вещества.

Нормална фаза HPLC

Стационарната фаза е по-полярна от подвижната фаза, поради което неполярният разтворител преобладава в елуента:

• Хексан:изопропанол = 95:5 (за вещества с ниска полярност)
• Хлороформ:метанол = 95:5 (за среднополярни вещества)
• Хлороформ:метанол = 80:20 (за силно полярни вещества)

HPLC с обърната фаза

Стационарната фаза е по-малко полярна от подвижната фаза, така че елуентът почти винаги съдържа вода. В този случай винаги е възможно да се осигури пълно разтваряне на BAS в подвижната фаза, почти винаги е възможно да се използва UV откриване, почти всички подвижни фази са взаимно смесими, може да се използва градиентно елуиране, колоната може бързо да се преработи -еквилибриран, колоната може да се регенерира.

Обичайните елуенти за обратнофазова HPLC са:

• Ацетонитрил: вода
• Метанол: вода
• Изопропанол: вода

Матрици за HPLC

Матриците, използвани в HPLC, са неорганични съединения като силикагел или алуминиев оксид, или органични полимери като полистирен (омрежен с дивинилбензен) или полиметакрилат. Силикагелът, разбира се, вече е общоприет.

Основни характеристики на матрицата:

• Размер на частиците (µm);
• Размер на вътрешните пори (Å, nm).

Приготвяне на силикагел за HPLC:

1. Формоване на микросфери от полисилициева киселина;
2. Изсушаване на частици силикагел;
3. Разделяне на въздуха.

Сорбент частици:

• Редовен (сферичен): по-висока устойчивост на натиск, по-висока цена;
• Несферични: по-ниска устойчивост на натиск.

Размерът на порите в HPLC е един от най-важните параметри. Колкото по-малък е размерът на порите, толкова по-лоша е тяхната пропускливост за молекулите на елуираните вещества. И следователно, толкова по-лош е сорбционният капацитет на сорбентите. Колкото по-големи са порите, толкова по-малка е, първо, механичната стабилност на частиците на сорбента и, второ, колкото по-малка е сорбционната повърхност, следователно, толкова по-лоша е ефективността.

Ваксинации в стационарна фаза

Нормална фаза HPLC:

• Стационарна фаза с присаждане на пропилнитрил (нитрил);
• Стационарна фаза с присаждане на пропиламин (амин).

HPLC с обърната фаза:

• Стационарна фаза с присаждане на алкил;
• Стационарна фаза с алкилсилилно присаждане.

End-capping е защитата на неприсадени участъци от сорбента чрез допълнително присаждане с „малки“ молекули. Хидрофобно крайно затваряне (C1, C2): по-висока селективност, по-лоша омокряемост; хидрофилно крайно затваряне (диол): по-ниска селективност, по-висока омокряемост.

Детектори за HPLC

• UV
• Диодна матрица
• Флуоресцентни
• Електрохимия
• Рефрактометричен
• Масово селективно

Връзки

Фондация Уикимедия. 2010 г.

Вижте какво е „високоефективна течна хроматография“ в други речници:

високоефективна Течна хроматография- - [A.S. Goldberg. Англо-руски енергиен речник. 2006] Теми: енергия като цяло EN високоефективна течна хроматография HPLC ... Ръководство за технически преводач

Терминът високоефективна течна хроматография Терминът на английски високоефективна течна хроматография Синоними Съкращения HPLC, HPLC Сродни термини адсорбция, олигопептид, протеомика, сорбент, фулерен, ендоедрален, хроматография... ...

Течна хроматография, при която, за да се повиши ефективността на разделяне, разтворителят (елуент) под налягане (повече от 3x107 Pa) се изпомпва през колони, напълнени със сорбент с частици с малък диаметър (до 1 μm), както и перфузионни филтри. употребявано......

Вид хроматография, при която течността (елуент) служи като подвижна фаза и неподвижна. сорбент, телевизор носител с течност или гел, нанесен върху повърхността му. Извършва се в колона, пълна със сорбент (колонна хроматография) върху плоска... ... Естествени науки. енциклопедичен речник

- [κρώμα (υrum) цвят] процес, основан на неравномерната способност на отделните компоненти на сместа (течни или газообразни) да останат на повърхността на адсорбента както при абсорбирането им от носещия поток, така и когато ... ... Геоложка енциклопедия

- (от други гръцки ... Уикипедия

Терминът хроматография Терминът на английски chromatography Синоними Съкращения Сродни термини високоефективна течна хроматография, клатрат, лаборатория на чип, порометрия, протеом, протеомика, сорбент, ензим, фулерен, ендоедрален... ... Енциклопедичен речник по нанотехнологии

Течна хроматография на базата на разг. способност на отделените йони за йонообмен с фиксирани. йони на сорбента, образувани в резултат на дисоциация на йоногенните групи на последния. Катионообменниците се използват за разделяне на катиони, за... ... Химическа енциклопедия

HPLC- високоефективна Течна хроматография… Речник на руските съкращения

Високоефективната течна хроматография (HPLC) е един от ефективни методиразделяне на сложни смеси от вещества, широко използвани както в аналитичната химия, така и в химическа технология. В основата на хроматографското разделяне е участието ... Wikipedia

Книги

• Практическа високоефективна течна хроматография, Veronica R. Mayer. Представяме на читателя 5-то издание на книгата, допълнено със съвременни методи и оборудване. Много са подобрени в книгата и са добавени голям брой препратки. Тези места в текста, където...