parovi drugih. Ove promjene doista prate svaki ciklus replikacije DNA, ali njihova je učestalost puno manja nego što bi trebala biti. To se objašnjava činjenicom da se većina promjena ove vrste eliminira djelovanjem mehanizma popravka (molekularne obnove) izvorne sekvence nukleotida DNA.
Mehanizam popravka temelji se na prisutnosti dvaju komplementarnih lanaca u molekuli DNA. Izobličenje nukleotidnog slijeda u jednom od njih otkrivaju specifični enzimi. Zatim se odgovarajući dio uklanja i zamjenjuje novim, sintetiziranim na drugom komplementarnom lancu DNK. Ova vrsta popravka naziva se ekscizijski popravak, tj. sa “rezanjem” (slika 3.15). Provodi se prije sljedećeg ciklusa replikacije, zbog čega se i naziva
predreplikacijski.
Riža. 3.14. Shema procesa korekcije tijekom sinteze DNA: I - uključivanje u lanac DNA nukleotida s promijenjenim (tautomernim) oblikom citoeina, koji se "ilegalno" spaja s adeninom; II - brzi prijelaz
citozin u svoj normalni oblik remeti njegovo sparivanje s adeninom; nespareni 3"-OH kraj sintetiziranog lanca sprječava njegovo daljnje produljenje pod djelovanjem DNA polimeraze; III - DNA polimeraza uklanja ilegalni nukleotid, zbog čega se ponovno pojavljuje 3"-OH kraj uparen s matricom; IV - DNA polimeraza nastavlja produžavanje lanca na 3"-OH kraju
Obnavljanje izvorne strukture DNK zahtijeva sudjelovanje niza enzima. Važna točka u pokretanju mehanizma popravka je otkrivanje greške u strukturi DNK. Često se takve pogreške događaju u novosintetiziranom lancu tijekom procesa replikacije. Enzimi za popravak moraju otkriti ovaj određeni lanac. Kod mnogih vrsta živih organizama novosintetizirani lanac DNA razlikuje se od materinskog po stupnju metilacije svojih dušičnih baza, koji zaostaje za sintezom. U ovom slučaju, nemetilirani lanac prolazi kroz popravak. Pukotine lanaca DNK također se mogu prepoznati pomoću enzima za popravak. U višim organizmima, gdje se sinteza DNA ne odvija kontinuirano, već u zasebnim replikonima, novosintetizirani lanac DNA ima prekide, što omogućuje njegovo prepoznavanje.
Obnavljanje strukture DNA kada su purinske baze jednog od njezinih lanaca izgubljene uključuje otkrivanje defekta pomoću enzima endonukleaze, koji prekida fosfoestersku vezu na mjestu oštećenja lanca. Tada se promijenjeni dio s nekoliko susjednih nukleotida uklanja enzimom egzonukleazom, a na njegovom mjestu, u skladu s redoslijedom baza komplementarnog lanca, formira se ispravan slijed nukleotida (sl. 3.15).
Riža. 3.15. Shema ekscizije, predreplikacijski popravak DNA Kada se jedna od baza u lancu DNA promijeni u obnovi izvorne
U strukturama sudjeluje oko 20 enzima DNA glikozilaza, koji specifično prepoznaju oštećenja uzrokovana deaminacijom, alkilacijom i drugim strukturnim transformacijama baza. Tako modificirane baze se uklanjaju. Pojavljuju se područja bez baza i popravljaju se, kao kod gubitka purina. Ako se normalna struktura ne uspostavi, npr. u slučaju deaminacije dušičnih baza, neki parovi komplementarnih baza se zamjenjuju drugima - C-G par se može zamijeniti T-A parom itd. (vidi odjeljak 3.4.2.3).
Stvaranje dimera timina (T-T) u polinukleotidnim lancima pod utjecajem UV zraka zahtijeva sudjelovanje enzima koji ne prepoznaju pojedine promijenjene baze, već opsežnija oštećenja strukture DNA. Proces popravka u ovom slučaju također je povezan s uklanjanjem regije koja nosi dimer i obnavljanjem normalnog slijeda nukleotida sintezom na komplementarnom DNA lancu.
U slučaju kada sustav ekscizijskog popravka ne ispravi promjenu koja se dogodila u jednom lancu DNK, fiksacija se događa tijekom replikacije
ova promjena i postaje vlasništvo oba lanca DNA. To dovodi do zamjene jednog para komplementarnih nukleotida drugim ili do pojave prekida (praznina) u novosintetiziranom lancu naspram promijenjenih dijelova. Obnavljanje normalne strukture DNK također se može dogoditi nakon replikacije.
Postreplikacijski popravak provodi se rekombinacijom (razmjenom fragmenata) između dvije novonastale dvostruke spirale DNA. Primjer takvog post-replikativnog popravka je obnova normalne strukture DNA kada se dimeri timina (T-T) pojave kada se ne eliminiraju spontano pod utjecajem vidljive svjetlosti ( laka reparacija) ili tijekom popravka prije replikativne ekscizije.
Kovalentne veze koje nastaju između susjednih timinskih ostataka čine ih nesposobnima za vezanje na komplementarne nukleotide. Kao rezultat toga, pojavljuju se prekidi (praznine) u novosintetiziranom lancu DNK, koje prepoznaju enzimi za popravak. Obnavljanje cjelovitosti novog polinukleotidnog lanca jedne od kćeri DNK provodi se zbog rekombinacije s odgovarajućim normalnim matičnim lancem druge kćeri DNK. Praznina nastala u matičnom lancu zatim se popunjava sintezom na njemu komplementarnom polinukleotidnom lancu (slika 3.16). Manifestacija takvog post-replikativnog popravka, provedenog rekombinacijom između lanaca dviju molekula kćeri DNA, može se smatrati često opaženom razmjenom materijala između sestrinskih kromatida (slika 3.17).
Riža. 3.16. Shema postreplikativnog popravka DNA: I - pojava dimera timina u jednom od lanaca DNA;
II - stvaranje "praznine" u novosintetiziranom lancu u odnosu na promijenjeni dio matične molekule nakon replikacije (strelica prikazuje naknadno popunjavanje "praznine" s dijelom iz odgovarajućeg lanca druge molekule kćeri DNA);
III - obnova cjelovitosti lanca kćeri gornje molekule zbog rekombinacije i u donjoj molekuli zbog sinteze na komplementarnom lancu
Riža. 3.17. Interkromatidne izmjene (označene strelicama)
Tijekom predreplikativnog i postreplikativnog popravka, većina oštećenja strukture DNK se obnavlja. Međutim, ako se dogodi prevelika šteta u nasljednom materijalu stanice, a dio se ne eliminira, aktivira se sustav inducibilnih (stimuliranih) reparacijskih enzima (SOS sustav). Ovi enzimi ispunjavaju praznine, vraćajući cjelovitost sintetiziranih polinukleotidnih lanaca bez strogog poštivanja načela komplementarnosti. Zbog toga ponekad sami procesi popravka mogu poslužiti kao izvor trajnih promjena u strukturi DNA (mutacija). Ova reakcija vrijedi i za SOS sustav.
Ako u stanici, unatoč izvršenom popravku, količina oštećenja strukture DNA ostane velika, procesi replikacije DNA u njoj su blokirani. Takva se stanica ne dijeli, što znači da ne prenosi nastale promjene na svoje potomke.
Zastoj staničnog ciklusa uzrokovan oštećenjem DNA, u kombinaciji s nemogućnošću molekularnog popravka promijenjenog nasljednog materijala, može, uz sudjelovanje proteina čiju sintezu kontrolira gen p53, dovesti do aktivacije procesa samouništenja (apoptoze ) oštećene stanice kako bi je eliminirali iz tijela.
Dakle, opsežan skup različitih enzima za popravak kontinuirano "pregledava" DNK, uklanja oštećena područja iz nje i pomaže u održavanju stabilnosti nasljednog materijala. Kombinirano djelovanje replikacijskih enzima (DNA polimeraza i editing endonukleaza) i enzima za popravak osigurava relativno nisku učestalost pogrešaka u molekulama DNA, koja se održava na razini od 1 × 10-9 parova promijenjenih nukleotida po genomu. S obzirom na veličinu ljudskog genoma od 3 × 109 parova nukleotida, to znači oko 3 pogreške po repliciranom genomu. Istovremeno, čak i ova razina dovoljna je za stvaranje značajne genetske raznolikosti u obliku genskih mutacija tijekom postojanja života na Zemlji.
3.4.2.3. Promjene u sekvencama nukleotida DNA. Genske mutacije
Neprilagođene promjene kemijska struktura geni koji se reproduciraju u uzastopnim ciklusima replikacije i pojavljuju u potomstvu u obliku novih varijanti znakova nazivaju se genske mutacije.
Promjene u strukturi DNA koja tvori gen mogu se podijeliti u tri skupine. Mutacije prve skupine sastoje se u zamjeni nekih baza s drugima. Oni čine oko 20% spontano nastalih promjena gena. Druga skupina mutacija uzrokovana je pomakom u okviru čitanja do kojeg dolazi kada se promijeni broj parova nukleotida u genu. Konačno, treću skupinu predstavljaju mutacije povezane s promjenom redoslijeda nukleotidnih sekvenci unutar gena (inverzija).
Mutacije prema vrsti zamjene dušičnih baza. Ove se mutacije javljaju iz više specifičnih razloga. Jedna od njih može biti promjena u strukturi baze koja je već uključena u spiralu DNK do koje dolazi slučajno ili pod utjecajem specifičnih kemijskih sredstava. Ako takav izmijenjeni oblik baze ostane neotkriven od strane enzima za popravak, tada tijekom sljedećeg ciklusa replikacije može pričvrstiti drugi nukleotid na sebe. Primjer je deaminacija citozina, koji se spontano ili pod utjecajem pretvara u uracil. dušična kiselina(Slika 3.18). Nastali uracil, kojeg enzim ne primjećujeDNA glikozilaza,tijekom replikacije se veže na adenin, koji zatim veže timidil nukleotid. Kao rezultat toga, par C-G je u DNK zamijenjen parom T-A (Slika 3.19, I ). Deaminacija metiliranog citozina pretvara ga u timin (vidi sliku 3.18). Timidil nukleotid, budući da je prirodna komponenta DNA, enzimi za popravak ne detektiraju kao promjenu i tijekom sljedeće replikacije veže adenil nukleotid. Kao rezultat toga, umjesto para C-G par se pojavljuje i u molekuli DNA T-A (Sl. 3.19, II).
Riža. 3.18. Spontana deaminacija citozina
Drugi razlog za zamjenu baze može biti pogrešno uključivanje nukleotida koji nosi kemijski izmijenjeni oblik baze ili njezinog analoga u sintetizirani lanac DNA. Ako ova pogreška ostane neotkrivena enzimima za replikaciju i popravak, promijenjena baza se uključuje u proces replikacije, što često dovodi do zamjene jednog para drugim. Primjer za to je dodavanje nukleotida s 5-bromuracilom (5-BU), sličnog timidil nukleotidu, na adenin matičnog lanca tijekom replikacije. Tijekom naknadne replikacije, 5-BU lakše veže gvanin nego adenin. Gvanin, tijekom daljnje duplikacije, tvori komplementarni par s citozinom. Eventualno par A-T zamijeniti u molekuli DNA G-C par(Slika 3.20).
Riža. 3. 19. Mutacije prema vrsti supstitucije baza (deaminacija dušičnih baza u lancu DNA):
I - pretvorba citozina u uracil, zamjena C-G para T-A parom;
II - pretvorba metil citozina u timin, zamjena C-G para T-A parom
Iz gornjih primjera jasno je da se promjene u strukturi molekule DNA, kao što je zamjena baza, događaju prije ili tijekom procesa replikacije, prvo u jednom polinukleotidnom lancu. Ako se takve promjene ne isprave tijekom popravka, tada tijekom naknadne replikacije postaju vlasništvo oba lanca DNK.
Riža. 3.20. Mutacije supstitucije baza
(ugradnja analoga dušične baze tijekom replikacije DNA)
Posljedica zamjene jednog para komplementarnih nukleotida drugim je stvaranje novog tripleta u nukleotidnom slijedu DNA koji kodira slijed aminokiselina u peptidnom lancu. Ovo možda neće utjecati na strukturu peptida ako je novi triplet "sinonim" za prethodni, tj. će kodirati istu aminokiselinu. Na primjer, aminokiselina valin šifrirana je s četiri tripleta: CAA, CAG, CAT, CAC. Zamjena treće baze u bilo kojoj od ovih tripleta neće promijeniti njezino značenje (degeneracija genetskog koda).
U U slučaju kada novonastali triplet šifrira drugu aminokiselinu, mijenja se struktura peptidnog lanca i svojstva odgovarajućeg proteina. Ovisno o prirodi i mjestu zamjene, specifična svojstva proteina mijenjaju se u različitim stupnjevima. Postoje slučajevi gdje zamjena samo jedne aminokiseline u peptidu značajno utječe na svojstva proteina, što se očituje u promjenama složenijih karakteristika. Primjer je promjena svojstava ljudskog hemoglobina kada anemija srpastih stanica (slika 3.21). U takvom hemoglobinu (HbS) (za razliku od normalnog HbA) - u p-globinskim lancima na šestom položaju, glutaminska kiselina je zamijenjena valinom. To je posljedica zamjene jedne od baza u tripletu koji kodira glutaminsku kiselinu (CTT ili TTC). Rezultat je triplet koji šifrira valin (CAT ili TsAT). U tom slučaju zamjena jedne aminokiseline u peptidu značajno mijenja svojstva globina, koji je dio hemoglobina (smanjuje se njegova sposobnost vezanja na O2), a osoba razvija znakove anemije srpastih stanica.
U U nekim slučajevima zamjena jedne baze drugom može dovesti do pojave jednog od besmisleni tripleti (ATT, ATC, ACT), koji ne šifriraju niti jednu aminokiselinu. Posljedica takve zamjene bit će prekid sinteze peptidnog lanca. Procjenjuje se da supstitucije nukleotida u jednom tripletu dovode do stvaranja sinonimnih tripleta u 25% slučajeva; u 2-3 - besmislene trojke, u 70-75% - pojava pravih genskih mutacija.
Dakle, mutacije supstitucije baza mogu nastati ili kao rezultat spontanih promjena u strukturi baza u jednom od lanaca postojeće dvostruke spirale DNK ili tijekom replikacije u novo sintetiziranom lancu. Ako se te promjene ne isprave tijekom procesa popravka (ili, obrnuto, nastanu tijekom popravka), one se fiksiraju u oba lanca i zatim će se reproducirati u sljedećim ciklusima replikacije. Stoga je važan izvor takvih mutacija poremećaj procesa replikacije i popravka.
Mutacije pomaka okvira. Ova vrsta mutacije čini značajan udio spontanih mutacija. Nastaju kao rezultat gubitka ili umetanja jednog ili više parova komplementarnih nukleotida u sekvencu nukleotida DNA. Većina proučavanih mutacija koje uzrokuju
POPRAVAK DNK
Sustavi popravka
2 Popravak ekscizije. Primjeri i vrste
3 Popravak pogrešaka replikacije DNA
4 Rekombinantni (postreplikacijski) popravak kod bakterija
5 SOS popravak
Sustavi popravka DNK prilično su konzervativni u evoluciji od bakterija do ljudi i najviše su proučavani u E. coli.
Poznate su dvije vrste reparacije:izravni i ekscizijski
Izravna reparacija
Izravni popravak je najjednostavniji način uklanjanja oštećenja u DNK, koji obično uključuje specifične enzime koji mogu brzo (obično u jednoj fazi) eliminirati pripadajuća oštećenja, vraćajući izvornu strukturu nukleotida.
1. Ovo funkcionira, na primjer,O6-metilgvanin DNA metiltransferaza
(suicidni enzim), koji uklanja metilnu skupinu s dušične baze na jedan od vlastitih cisteinskih ostataka
U E. coli može se sintetizirati do 100 molekula ovog proteina u 1 minuti. Protein koji je po funkciji sličan višim eukariotima očito igra važnu ulogu u zaštiti od raka uzrokovanog unutarnjim i vanjskim alkilirajućim čimbenicima.
DNA insertaza
2. DNA insertaze
fotoliaza
3. Dimeri timina su "odvezani" pomoću izravna reparacija glumećifotoliaza, izvodeći odgovarajuću fotokemijsku transformaciju. DNA fotoliaze su skupina svjetlosno aktiviranih enzima valne duljine 300 - 600 nm (vidljiva regija), za koje u svojoj strukturi imaju posebno središte osjetljivo na svjetlo.
Rasprostranjeni su u prirodi i nalaze se u bakterijama, kvascima, kukcima, gmazovima, vodozemcima i ljudima. Ovi enzimi zahtijevaju niz kofaktora (FADH, tetrahidrofolna kiselina, itd.) uključenih u fotokemijsku aktivaciju enzima. E. coli fotoliaza je protein molekularne težine 35 kDa, čvrsto povezan s oligoribonukleotid dug 10-15 nukleotida neophodan za aktivnost enzima.
Primjeri izravne reparacije
1. Metilirana baza O 6-mG dimetiliran enzimom metiltransferazomO6-metilgvanin DNA metiltransferaza (suicidni enzim), koji prenosi metilnu skupinu na jedan od svojih ostataka
cistein
2. AP mjesta mogu se popraviti izravnim umetanjem purina uz sudjelovanje enzima tzvDNA insertaze(od engleskog umetka - umetnuti).
DIJAGRAM PRIMJERA IZRAVNOG POPRAVKA OŠTEĆENJA U DNA – metilirana baza O6- mGdemetiliran enzimom metiltransferazom, koji prenosi metilnu skupinu na jedan od svojih aminokiselinskih ostataka cisteina.
3. Fotoliaza se veže za dimer timina i nakon ozračivanja ovog kompleksa vidljivim svjetlom (300-600 nm), dimer se razotkriva.
DIJAGRAM PRIMJERA IZRAVNOG POPRAVKA OŠTEĆENJA U DNK – fotoliaza
veže se za dimer timina i, nakon ozračivanja vidljivim spektrom svjetlosti, taj se dimer razmrsi
Popravak ekscizije
(od engleske ekscizije - rezanje).
DEFINICIJA
Popravak ekscizije uključuje brisanje oštećene dušične baze iz DNK i naknadni oporavak normalna molekularna struktura.
MEHANIZAM
Popravak ekscizijom obično uključuje nekoliko enzima, a sam proces uključuje
ne samo oštećena ,
ali i nukleotidi uz njega .
UVJETI
Popravak ekscizijom zahtijeva drugi (komplementarni) lanac DNK. Opći pojednostavljeni dijagram popravka ekscizijom prikazan je na slici. 171.
KORACI
Prvi korak u popravku ekscizijom je uklanjanje abnormalnih dušičnih baza. Katalizira ga grupaDNK-N-glikozilaza- enzimi koji cijepaju glikozidnu vezu između deoksiriboze i dušične baze.
VAŽNA OBAVIJEST:
UosobaDNK-N-glikozilazeimaju visoku specifičnost supstrata: različiti enzimi ove obitelji prepoznaju i režu razne anomalne podloge(8-oksoguanin, uracil, metilpurini, itd.).
UbakterijeDNK-N-glikozilazenema takvu specifičnost supstrata
OBIČNI ENZIMI ZA POPRAVAK IZREZCIVANJA
| IME | FUNKCIJA | MEHANIZAM |
| DNK-N-glikozilaze | ekscizija abnormalnih dušičnih baza | cijepa glikozidnu vezu između deoksiriboze i dušične baze |
| AP endonukleaza | stvara uvjete za rad sljedećeg enzima - egzonukleaze | razbija šećerno-fosfatnu okosnicu molekule DNA na AP mjestu |
| egzonukleaza | oslobađa nekoliko nukleotida | sekvencijalno odcjepljuje nekoliko nukleotida s oštećenog dijela jednog lanca DNA |
SPECIFIČNI POSLJEDIČNI KORACI OVOG MEHANIZMA:
Kao rezultat djelovanja DNK- N-glikozilazaformira se AP mjesto koje napada enzim AP endonukleaza. Razbija šećerno-fosfatnu okosnicu molekule DNA na AP mjestu i time stvara uvjete za rad sljedećeg enzima - egzonukleaze, koji sekvencijalno odcjepljuje nekoliko nukleotida s oštećenog dijela jednog lanca DNA.
U bakterijskim stanicama ispražnjeni prostor popunjava se odgovarajućim nukleotidima uz sudjelovanje DNA polimeraza I, usmjeren prema drugom (komplementarnom) lancu DNA.
Budući da je DNA polimeraza I sposobna produžiti 3" kraj jednog od lanaca na mjestu prekida u dvolančanoj DNA i ukloniti nukleotide s 5" kraja istog prekida,
oni. ostvariti “nick emitiranje” , ovaj enzim igra ključnu ulogu u popravku DNK. Izvodi se završno šivanje popravljenih područja DNA ligaza.
U eukariotskim (sisavskim) stanicama
Popravak ekscizije DNA u stanicama sisavaca popraćen je naglim porastom aktivnosti drugog enzima -poli ADR-riboza polimeraza . Ovo se dogodi ADP-ribozilacija proteina kromatina(histoni i nehistonski proteini), što dovodi do slabljenja njihove veze s DNA i otvara pristup reparacijskim enzimima.
Donator ADP-ribozadjeluje u tim reakcijamaNAD+, čije se rezerve uvelike iscrpljuju tijekom ekscizijskog popravljanja oštećenja uzrokovanih rendgenskim zračenjem:
Negativno nabijeni ostaci ADP-riboza od unutarnjeg sastava molekule NAD+ dodati preko radikalaglutamin kiseline ili fosfoserinna proteine kromatina, što dovodi do neutralizacije pozitivnih naboja tih proteina i slabljenja njihovog kontakta s DNA.
ŠTO JE SKUPINA ENZIMA
DNA glikozilaze
cijepa glikozidnu vezu između deoksiriboze i dušične baze
što rezultira ekscizijom abnormalnih dušičnih baza
DNA glikozilaze uključeni u eliminaciju oksidativnog oštećenja DNK u stanicama prokarioti i eukarioti, vrlo su raznoliki i razlikuju se po specifičnosti supstrata, prostornoj strukturi i metodama interakcije s DNA.
Najviše proučavane DNA glikozilaze uključuju:
endonukleaza III(EndoIII),
tvori amido pirimidin DNA glikozilazu (Fpg),
Mut T I
Mut Ycoli.
Endonukleaza IIIE. coli "prepoznaje" i specifično cijepa DNK oksidirano pirimidinske baze.
Ovaj enzim je monomerni globularni protein koji se sastoji od 211 aminokiselina ostaci (mol. masa 23,4 kDa). Sekvencioniran je gen koji kodira Endo III i određena mu je nukleotidna sekvenca. Endo III je željezo sumpor protein [(4 Fe-4S )2+ protein] koji ima element iznad sekundarna struktura Tip "grčki ključ" (spirala - ukosnica - spirala), služe za vezanje na DNK. Također su izolirani enzimi sa sličnom specifičnošću supstrata i sličnim sekvencama aminokiselina goveđih i ljudskih stanica.
Tvore amido piridin DNA glikozilazu E. coli "prepoznaje" i cijepa oksidirane heterocikličke spojeve iz DNA purinske baze .
SHEMA 1. FAZA POPRAVKA EKSCIZIJE
DNKN
SHEMA POPRAVKA IZREZCIVANJEM
1 DNKNglikozidaza uklanja oštećenu bazu
AP endonukleaza razbija DNK
2 Egzonukleaza uklanja određeni broj nukleotida
3 DNA polimeraza ispunjava ispražnjeno područje komplementarom
Mononukleotidi
DNA ligaza povezuje popravljeni lanac DNA
Mut T- mali protein molekulske mase 15 kDa s aktivnošću nukleozid trifosfataze, koja je pretežno hidrolizira dGTP u dGMP i pirofosfat.
Biološka uloga Mut T je spriječiti stvaranje nekanonskih parova tijekom replikacijeA:G I A: 8-okso-G.
Takvi se parovi mogu pojaviti kada oksidirani oblik
dGTP (8-okso-dGTP) postaje supstrat DNA polimeraze.
Mut T hidrolizira 8-okso-dGTP10 puta brži od dGTP-a.
To radi 8-okso-dGTPnajpoželjniji supstratMutTte objašnjava njegovu funkcionalnu ulogu.
Mut Yje specifična adenin DNA glikozilaza koja cijepa N-glikozidnu vezu između adenina i deoksiriboze adenozin, tvoreći nekanonski par s gvaninom.
Funkcionalna uloga ovog enzima je sprječavanje mutacija
T:A - G:A autor cijepanje intaktnog ostatka adeniniz baznog para A: 8-okso-G.
Popravak ekscizije nukleotida
(mehanizam za uklanjanje oštećenja DNA ovisan o ATP-u)
Nedavno se u ekscizijskom popravku posebna pažnja posvećuje mehanizmu koji ovisi o ATP-u za uklanjanje oštećenja s DNK. Ova vrsta ekscizijskog popravka naziva se nukleotidnim ekscizijskim popravkom (NER).
Uključuje DVIJE ETAPE :
1. uklanjanje iz DNKoligonukleotidni fragmenti koji sadrže oštećenja, i
Eksinukleaza
2. naknadna rekonstrukcija lanca DNA uz sudjelovanje kompleksa enzima (nukleaza, DNA polimeraza, DNA ligaza itd.).
Dolazi do uklanjanja fragmenta DNK s obje strane oštećenog nukleotid. Duljina uklonjenih fragmenata oligonukleotida razlikuje se između prokariota i eukariota.
Uklanjanje fragmenta DNA iz prokariota
Dakle, kod E. coli, B. subtilus, Micrococcus luteus, duljina fragmenta 12-13 nukleotidi,
Uklanjanje fragmenta DNA u eukariota
a kod kvasca, vodozemaca i ljudi – fragment koji se sastoji od 24-32 nukleotidi.
Eksinukleaza– enzim koji uklanja fragmente DNA
Cijepanje fragmenta DNA provodi enzimeksinukleaza(eksinukleaza). U E. coli, ovaj enzim se sastoji od 3 različita protomera -
uvrA
uvr B
uvr C
od kojih svaki obavlja specifičnu funkciju tijekom ekscizijskog cijepanja fragmenta DNA. Imena ovih proteina dana su prvim slovima riječi"ultraljubičasto popravljanje".
Protomer uvr Aima aktivnost ATPaze, veže se za DNA u obliku dimera, izvodeći
početno prepoznavanje štete i
vezivanjeuvr B
Protomer uvr B ima:
1 . Latentan Aktivnost ATPaze i latentne helikaze, neophodna za promjenu konformacija i odmotavanje dvostruke spirale DNA;
2. Endonukleaza aktivnosti, cijepajući internukleotidnu (fosfodiestersku) vezu odZ"-krajokrhnuti ulomak.
Protomer uvr Cponaša se kao endonukleaza, uvodeći prekid u DNK lancu koji se popravlja5" završavaizrezani fragment.
Dakle, protomeriuvr A, uvr B, uvr Cstupaju u interakciju s DNA u određenom nizu, izvodeći reakciju ovisnu o ATP-ucijepanje oligonukleotidnog fragmenta iz DNK lanca koji se popravlja.
Nastala praznina u molekuli DNA obnavlja se uz sudjelovanje DNA polimeraze I i DNA ligaze. Model popravka ekscizijom koji uključuje gore navedene enzime prikazan je na slici. 172.
Ekscizijski popravci kod ljudi
Ekscizijski popravci kod ljudi također ovise o ATP-u i uključujutri glavne faze :
priznavanje štete,
rezanje dvostrukog lanca DNA
reduktivna sinteza i
podvezivanje popravljene niti.
Međutim, popravak ekscizije ljudske DNK uključuje
25 različitih polipeptida ,
16 od kojih sudjeluju u cijepanju oligonukleotidnog fragmenta, budući da su protomerieksinukleaze,
i ostalo 9 izvršiti sintezu popravljenog dijela molekule.
U sustavu popravka DNK kod ljudi vrlo je značajnu ulogu provode transkripciju proteina -
RNA polimeraza II I
TF pon- jedan od šest glavnih faktora transkripcije eukarioti.
Treba napomenuti da ekscizijski popravak kod prokariota, kao i kod eukariota, ovisi o funkcionalnom stanju DNA:
Transkribirana DNK se brže popravlja
nego transkripcijski neaktivan.
Ovaj fenomen se objašnjava sljedećim čimbenicima:
struktura kromatina,
homologija lanaca transkribiranih dijelova DNA,
učinak oštećenja lanca i njegov utjecaj na RNA polimerazu.
VAŽNA OBAVIJEST:
LANAC DNA KODIRANJA (lanac pohranjivanja informacija)
DNK MATRIČNI LANAC (informacije se kopiraju iz njega)
Poznato je da tako velika šteta kao stvaranje dimera timina, blokiraju transkripciju i kod bakterija i kod ljudi ako se pojave na matrični sklop DNK (oštećenje kodiranje lanci ne utječu na transkripcijski kompleks). RNK polimeraza se zaustavlja na mjestu oštećenja DNK i blokira funkcioniranje transkripcijskog kompleksa.
Faktor povezivanja transkripcije i popravka (TRCF) .
U E. coli, povećani popravak transkripcije je posredovan jednim posebnim proteinom -faktor povezivanja transkripcije i popravka (TRCF) .
Ovaj protein potiče :
1. odvajanje RNA polimeraze od DNA
2. ujedno potiče obrazovanje kompleks proteina,
Izvođenje sanacije oštećenog područja.
Nakon završetka popravka, RNA polimeraza se vraća u svoj izvorni položaj i transkripcija se nastavlja (vidi sliku).
Tako opća shema ekscizijski popravak
1. DNA-N -glikozilaza uklanja oštećenu bazu
2. AP endonukleaza prekida lanac DNA
3. Egzonukleaza uklanja određeni broj nukleotida
4. DNA polimeraza ispunjava ispražnjeno područje
Komplementarni nukleotidi
5. DNA ligaza povezuje popravljeni lanac DNA
Popravak pogreške replikacije DNA
metilacijom
Pogreške u parenju dušičnih baza tijekom replikacije DNA javljaju se vrlo često (kod bakterija jednom na 10 tisuća nukleotida), zbog čegana lanac kćeri DNK uključeni su nukleotidi koji nisu komplementarni nukleotidima matičnog lanca -neusklađenosti(eng. mismatch n e dopisivati se).
IakoDNA polimeraza Iprokarioti imaju sposobnost samoispravljanja, svoje napore da eliminiraju pogrešno pričvršćene nukleotide ponekad nisu dovoljni, a zatim u DNK ostaju neki neispravni (nekomplementarni) parovi.
U ovom slučaju, popravak se odvija pomoću određenog sustava povezanog sDNA metilacija . Djelovanje ovog sustava popravka temelji se na činjenici da nakon replikacije, nakon određenog vremena (nekoliko minuta), DNA prolazi kroz metilaciju.
Kod E. coli metiliran uglavnom adenin s obrazovanjem
N6-metil-adenin (N6-mA).
Do ove točke, novo sintetiziran(podružnica)lanac ostaje nemetiliran.
Ako takav lanac sadrži nesparene nukleotide, tada se podvrgava popravku: Daklemetilacija obilježava DNK i
uključuje sustav za ispravljanje grešaka replikacija.
U ovom sustavu popravka prepoznaju se posebne strukture:
podslijedG-N6-mA-T-CI Sljedeći iza toga postoji deformacija
u dvostrukoj spirali gdje nema komplementarnosti (slika dolje).
U eliminaciji nesparenih nukleotida u polu-metiliran Molekula DNA uključuje prilično složen kompleks enzima za popravak, koji skeniraju površinu molekule DNA,reže dio dječjeg lanca pribjegavajući mismatcham, a zatim stvara uvjete za razvoj
njegove potrebne (komplementarne) nukleotide.
Različite komponente ovog kompleksa imaju različite aktivnostinukleaza,
helikaza,
ATPaza,
nužna za uvođenje lomova u DNA i cijepanje nukleotida, odvijanje dvostruke spirale DNA i osiguravanje energije za kretanje kompleksa duž popravljenog dijela molekule.
Kod ljudi je identificiran kompleks enzima za popravak slične strukture i funkcije.
Rekombinantni (postreplikacijski) popravak
U slučajevima kada su, iz jednog ili drugog razloga, gore spomenuti sustavi popravka poremećeni, mogu nastati praznine (nedovoljno popravljeni dijelovi) u lancima DNK, koji su ponekad prilično značajne veličine, što je prepuno poremećaja sustava replikacije i može dovesti do smrti stanica.
U tom slučaju stanica može upotrijebiti drugu molekulu DNA dobivenu nakon replikacije za popravak jedne molekule DNA, tj. privući mehanizam za tu svrhurekombinacija.
U bakterijama
Kod bakterija sudjeluje u rekombinantnom popravku.protein Rec A. Veže se na jednolančanu regiju DNA i uključuje je u rekombinaciju shomologne regije intaktnih niti druge molekule DNA .
Kao rezultat toga, i prekinuti (koji sadrže praznine) i intaktni lanci molekule DNK koji se popravljaju su upareni s netaknutim komplementarnim regijama DNA, što otvara mogućnost popravka kroz gore opisane sustave.
U ovom slučaju može biti rezanje određeni fragment i
punjenjeuz njegovu pomoć, praznine u neispravnom krugu.
Praznine i prekidi koji nastaju u lancima DNK popunjavaju se sudjelovanjemDNA polimeraza I i DNA ligaza .
SOS popravak
Postojanje ovog sustava prvi je pretpostavio M. Radman 1974. godine. On je i dao naziv ovom mehanizmu uključivši u njega međunarodni signal za pomoć “SOS” (spasite naše duše).
Doista, ovaj sustav se uključuje kada Oštećenje DNK postaje toliko veliko da prijeti životu stanice. U tom slučaju dolazi do indukcije aktivnosti raznolike skupine gena uključenih u različite stanične procese povezane s popravkom DNA.
Uključivanje određenih gena, određeno količinom oštećenja u DNA, dovodi do staničnih odgovora različitog značaja (počevši od standardnih popravak oštećenog nukleotidi i završetak suzbijanje dijeljenje stanica).
Većina proučavanihSOS popravaku E. coli, čiji su glavni sudionici proteini kodirani geni Rec AILex A.
Prvi od njih je višenamjenskiRec A protein, sudjeluje
V rekombinacija DNA, i
V regulacija transkripcije gena fag lambda, koji utječe na E. coli,
i drugo (Lex A protein)je potiskivač transkripcija velike skupine gena namijenjenih popravak DNK bakterije. Kada je inhibiran ili riješen popravak je aktiviran.
Uvezivanje Rec A s Lex Avodi do cijepanja potonjeg i sukladno tome da aktivacija gena za popravak.
Zauzvrat, indukcija bakterijskog SOS sustava služi zafag lambda signal za opasnost i uzrokuje prelazak profaga s pasivni u aktivni (litički) put postojanje, uzrokujući time smrt stanice domaćina.
SOS sustav popravka identificiran je ne samo kod bakterija, već i kod životinja i ljudi.
Geni uključeni u popravak oštećenja SOS DNK
| Geni | Posljedice aktivacije gena |
| uvr A, B, C, D | Popravak oštećenja sekundarne strukture DNA |
| Rec A | Postreplikacijski popravak, indukcija SOS sustava |
| lex A | Gašenje SOS sustava |
| rec N,ruv | Popravak dvostrukih prekida |
| Osiguravanje popravka rekombinacije |
|
| umu C, D | Mutageneza uzrokovana promjenama svojstava DNA polimeraze |
| sul A | Supresija stanične diobe |
Zaključak
Popravak oštećenja DNK usko je povezan s drugim temeljnim molekularno-genetičkim procesima: replikacija, transkripcija i rekombinacija. Svi ti procesi pokazuju se isprepleteno V zajednički sustav interakcije, koje služi velik broj različitih proteina, od kojih su mnogi multifunkcionalne molekule uključene u kontrola provedbe genetske informacije u pro- i eukariotskim stanicama. Pritom je očito da priroda "ne štedi" na kontrolnim elementima, stvarajući vrlo složene sustave za ispravljanje onih oštećenja u DNK koja su opasni za tijelo, a posebno za njegovo potomstvo. S druge strane, u slučajevima kada sposobnosti popravka nisu dovoljne za očuvanje genetskog statusa organizma, javlja se potreba za programiranom smrću stanice -apoptoza..
SHEMA POPRAVKA EKSCIZIJE NUKLEOTIDA E. COLIUZ SUDJELOVANJE EXINUCLEASE
1. MEHANIZAM NEOVISAN O TRANSKRIPCIJI
2. MEHANIZAM OVISAN O TRANSKRIPCIJI
3. OPĆI FAZA POPRAVKA
LEGENDA
A - proteinuvr A
B - proteinuvr U
C - proteinuvr S
mali crni trokut - znak označava mjesto oštećenja
SHEMA POPRAVKA POVEZANA S METILIRANJEM DNA
Reparacije
nazvati sposobnost molekule DNA da "ispravi" promjene koje se događaju u njezinim lancima. Najmanje 20 proteina uključeno je u obnavljanje izvorne strukture: prepoznavanje izmijenjenih dijelova DNK i njihovo uklanjanje iz lanca, vraćanje ispravnog slijeda nukleotida i spajanje obnovljenog fragmenta s ostatkom molekule DNK.
Navedene značajke kemijske strukture i svojstva DNA određuju funkcije koje ona obavlja. DNK bilježi, pohranjuje, reproducira genetsku informaciju i sudjeluje u procesima njezine implementacije između novih generacija stanica i organizama.
Ribonukleinske kiseline - RNA -
predstavljeni su molekulama različitih veličina, struktura i funkcija. Sve molekule RNA su kopije određenih dijelova molekule DNA i, uz već navedene razlike, kraće su od nje i sastoje se od jednog lanca. Između pojedinih dijelova jednog lanca RNA koji su međusobno komplementarni moguće je sparivanje baza (A s Y, G s C) i stvaranje spiralnih odjeljaka. Kao rezultat toga, molekule dobivaju specifičnu konformaciju.
Matrična, ili informacijska, RNA (mRNA, mRNA) sintetizira se u jezgri pod kontrolom enzima RNA polimeraze, komplementarna informacijskim sekvencama DNA, prenosi ovu informaciju u ribosome, gdje postaje matrica za sintezu proteinske molekule. Ovisno o količini kopiranih informacija, molekula mRNA može imati različite duljine i čini oko 5% ukupne stanične RNA.
Riboproteinska RNA (rRNA) sintetizira se uglavnom u jezgrici, u području gena rRNA i predstavljena je različitim Molekularna težina molekule koje čine velike i male podjedinice ribosoma. rRNK čini 85% ukupne RNK u stanici.
Prijenosna RNA (tRNA) čini oko 10% stanične RNA. Postoji više od 40 vrsta tRNA. Prilikom implementacije genetske informacije, svaka tRNA veže specifičnu aminokiselinu i transportira je do mjesta sastavljanja polipentida. U eukariota, tRNA se sastoji od 70-90 nukleotida.
Građa stanice
Tipovi stanične organizacije.
Među svom raznolikošću organizama koji trenutno postoje na Zemlji, razlikuju se dvije skupine: virusi i fagi, koji nemaju staničnu strukturu; svi ostali organizmi predstavljeni su različitim staničnim oblicima života. Postoje dvije vrste stanične organizacije: prokariotski
I eukariotski (
vidi sl.1 ).
Prokariotske stanice imaju relativno jednostavnu strukturu. Nemaju morfološki odvojenu jezgru, jedini kromosom je formiran kružnom DNA i nalazi se u citoplazmi; membranske organele su odsutne (njihovu funkciju obavljaju različite invaginacije plazma membrane); citoplazma sadrži brojne male ribosome; Nema mikrotubula, pa je citoplazma nepomična, a cilije i flagele imaju posebnu strukturu. Bakterije se klasificiraju kao prokarioti.
Većina modernih živih organizama pripada jednom od tri carstva - biljkama, gljivama ili životinjama, ujedinjenim u nadkraljevstvo eukariota.
Ovisno o količini od kojih se organizmi sastoje, potonji se dijele na jednostanične i višestanične. Jednostanični organizmi sastoje se od jedne stanice koja obavlja sve funkcije. Mnoge od tih stanica mnogo su složenije od stanica višestaničnog organizma. Svi prokarioti su jednostanični, kao i protozoe, neke zelene alge i gljive.
Sadržaj teme "Genetski elementi bakterija. Mutacije u bakterijama. Transdukcija.":1. Migrirajući genetski elementi bakterija. Transpozoni. Bakteriofagi kao migrirajući genetski elementi.
2. Mutacija. Mutacije u bakterijama. Mutageni. Spontane mutacije. Povratne mutacije (reverzije).
3. Inducirane mutacije bakterija. Kemijska mutageneza. Radijacijska mutageneza. Vrste mutacija.
4. Popravak bakterijske DNA. Sustavi popravka DNA. Kompenzacija za funkcije oštećene kao rezultat mutacija. Intragensko potiskivanje. Ekstragensko potiskivanje.
5. Prijenos bakterijske DNA. Konjugacija bakterija. F-faktor bakterija.
6. Transformacija bakterija. Faze bakterijske transformacije. Mapiranje bakterijskih kromosoma.
7. Transdukcija. Nespecifična transdukcija. Specifična transdukcija. Abortivna transdukcija. Fenomen lizogenije.
8. Svojstva bakterija. Nenasljedne promjene u svojstvima bakterija. S - kolonije. R - kolonije. M - kolonije. D - kolonije bakterija.
Popravak bakterijske DNK. Sustavi popravka DNA. Kompenzacija za funkcije oštećene kao rezultat mutacija. Intragensko potiskivanje. Ekstragensko potiskivanje.
U stanici postoje mehanizmi koji mogu u potpunosti ili djelomično vratiti izvornu strukturu promijenjene DNK. Mutacije uzrokovane zračenjem kemikalije i drugi čimbenici, teoretski bi mogli dovesti do izumiranja bakterijske populacije ako bi potonje bile lišene sposobnosti popravak DNK. Skup enzima koji kataliziraju ispravljanje oštećenja DNK kombiniraju se u takozvane sustave popravka, koji se temeljno razlikuju u biokemijskim mehanizmima "liječenja" oštećenja. Postoje tri glavna smjera za ispravljanje nedostataka DNK.
1. Izravno storniranje od oštećen DNK na izvornu strukturu kada promjene u DNK ispravljen jednom enzimatskom reakcijom. Na primjer, uklanjanje neispravno vezane metilne skupine na šestom atomu kisika gvanina pomoću metiltransferaze; ili cijepanje dimera timina koje je rezultat zračenja pomoću fotoliaze ( rekombinacijski popravak).
2. "Izrezivanje" štete nakon čega slijedi obnova izvorne strukture (ekscizijski popravak).
3. Aktivacija posebnih mehanizama, osiguravajući preživljavanje u slučaju oštećenja DNK(obnova izvorne strukture DNK kao rezultat rekombinacije; ispravak pogrešnog sparivanja baza; translacijska sinteza na oštećenoj matrici DNK). Ti mehanizmi ne dovode uvijek do potpune obnove izvorne strukture DNK.
Kompenzacija za funkcije oštećene kao rezultat mutacija
Primarna mutacija može se kompenzirati sekundarnom mutacijom koja se dogodila unutar mutiranog gena (intragenski) ili u drugom genu (ekstragenski). Promjene koje uklanjaju manifestacije mutacije bez ispravljanja izvornog poremećaja DNK, nazvao suzbijanje.
Intragensko potiskivanje uzrokovane sekundarnom mutacijom ispravljajući učinke primarne mutacije. Na primjer, točkasta mutacija koja rezultira sintezom neispravnog proteina s izgubljenom biološkom aktivnošću može se ispraviti ako sekundarna točkasta mutacija rezultira kodiranjem aminokiseline koja zadržava konfiguraciju i aktivnost proteina. Točna obnova izvorne strukture gena naziva se prava reverzna mutacija ( pravo vraćanje). Ako se učinak prve mutacije kompenzira mutacijom u drugom dijelu gena, takve se mutacije nazivaju sekundarne reverzije.
Ekstragensko potiskivanje- suzbijanje manifestacije mutacije koja se dogodila u jednom genu zbog mutacije u drugom genu.
