Predmet: Tekućinska kromatografija visoke učinkovitosti onečišćujućih tvari u prirodnim i otpadnim vodama. Tekućinska kromatografija HPLC kromatografija za analizu

9885 0

HPLC je kromatografija na tekućoj koloni u kojoj se mogu koristiti različiti mehanizmi sorpcije. U suštini, HPLC je moderni oblik implementacija klasične tekućinske kolonske kromatografije. Neke od najznačajnijih karakteristika kvalitete HPLC-a navedene su u nastavku:
- velika brzina procesa, što je omogućilo smanjenje trajanja odvajanja od nekoliko sati i dana do minuta;
- minimalni stupanj zamućenja kromatografskih zona, što omogućuje izdvajanje spojeva koji se samo malo razlikuju u sorpcijskim konstantama;
- visok stupanj mehanizacija i automatizacija odvajanja i obrade informacija, zahvaljujući čemu je kromatografija na tekućem stupcu dosegla novu razinu ponovljivosti i točnosti.

Intenzivna istraživanja posljednjih desetljeća i ogromna količina prikupljenih eksperimentalnih podataka sada nam omogućuju da govorimo o klasifikaciji varijanti u okviru metode tekućinske kromatografije visoke učinkovitosti. Naravno, klasifikacija prema gore navedenom mehanizmu sorpcije ostaje važeća.

Uobičajena klasifikacija temelji se na usporednom polaritetu pokretne i stacionarne faze. U tom se slučaju razlikuje normalna kromatografija i kromatografija reverzne faze.

Kromatografija normalne faze (NPC) je varijanta HPLC-a gdje je mobilna faza manje polarna od stacionarne faze i postoji razlog za vjerovanje da je glavni faktor koji određuje retenciju interakcija sorbata izravno s površinom ili volumenom sorbenta.

Kromatografija reverzne faze (RPC) je varijanta HPLC gdje je mobilna faza polarnija od stacionarne faze, a zadržavanje se određuje izravnim kontaktom molekula sorbata s površinom ili volumenom sorbenta; u ovom slučaju, ionizirani sorbati se ne mijenjaju za ione mobilne faze sorbirane na površini.

Kromatografija ionske izmjene je opcija u kojoj se sorpcija provodi izmjenom sorbiranih iona mobilne faze za ione tvari koje se kromatografiraju; Kromatografija izmjene liganda može se definirati na potpuno analogan način.

Kromatografija na dinamički modificiranim sorbentima je varijanta HPLC-a u kojoj sorbat ne stupa u izravnu interakciju s površinom sorbenta, već ulazi u asocijaciju s molekulama površinskih slojeva eluensa.
Ionsko-parna kromatografija je varijanta reverzno-fazne kromatografije ioniziranih spojeva u kojoj se mobilnoj fazi dodaje hidrofobni protuion koji kvalitativno mijenja sorpcijske karakteristike sustava.

Size exclusion kromatografija je metoda odvajanja spojeva prema njihovoj molekulskoj masi, koja se temelji na razlici u brzini difuzije molekula različitih veličina u porama stacionarne faze.

Za HPLC, vrlo važna karakteristika je veličina sorbenata, obično 3-5 mikrona, sada do 1,8 mikrona. To omogućuje brzo i potpuno odvajanje složenih smjesa tvari (prosječno vrijeme analize od 3 do 30 minuta).

Problem odvajanja rješava se pomoću kromatografske kolone, koja je cijev ispunjena sorbentom. Prilikom provođenja analize, tekućina (eluens) određenog sastava dovodi se kroz kromatografsku kolonu s stalna brzina. Precizno izmjerena doza uzorka ubrizgava se u ovaj tok. Komponente uzorka unesene u kromatografsku kolonu, zbog različitih afiniteta prema sorbensu kolone, kreću se duž nje različitim brzinama i dolaze do detektora sekvencijalno u različito vrijeme.

Dakle, kromatografska kolona je odgovorna za selektivnost i učinkovitost odvajanja komponenti. Odabirom različitih tipova kolona može se kontrolirati stupanj razdvajanja analita. Spojevi se identificiraju po retencijskom vremenu. Kvantitativno određivanje svake od komponenti izračunava se na temelju veličine analitičkog signala izmjerenog pomoću detektora spojenog na izlaz kromatografske kolone.

Sorbenti. Razvoj HPLC-a uvelike je povezan sa stvaranjem novih generacija sorbenata s dobrim kinetičkim svojstvima i raznolikim termodinamičkim svojstvima. Glavni materijal za sorbente u HPLC je silikagel. Mehanički je jak i ima značajnu poroznost, što daje veliki kapacitet izmjene s malim veličinama stupaca. Najčešća veličina čestica je 5-10 mikrona. Što su čestice bliže sferičnom obliku, manji je otpor protoku, to je veća učinkovitost, posebno ako se prosija vrlo uska frakcija (na primjer, 7 +1 mikrona).

Specifična površina silika gela je 10-600 m/g. Silikagel se može modificirati različitim kemijskim skupinama nacijepljenim na površinu (C-18, CN, NH2, SO3H), što omogućuje upotrebu sorbenata koji se temelje na njemu za odvajanje širokog spektra klasa spojeva. Glavni nedostatak silika gela je njegova niska kemijska otpornost pri pH< 2 и рН >9 (silicijev dioksid se otapa u alkalijama i kiselinama). Stoga, trenutno vrijeme teče intenzivna potraga za sorbentima na bazi polimera koji su stabilni na pH od 1 do 14, npr. na bazi polimetil metakrilata, polistirena itd.

Sorbenti za kromatografiju ionske izmjene. Zbog osobitosti odvajanja (u kiselim ili alkalna sredina) glavni sorbent je polistiren s divinilbenzenom različitog stupnja umreženosti sa SO3 -H+ (jako kiseli kationski izmjenjivači) ili -COO-Naf (slabo kiseli kationski izmjenjivači), -H2N+(CH3)3Cl- (jako bazični anionski izmjenjivači ) ili -N+ skupine nacijepljene na njihovu površinu HR2Cl- (slabo bazični anionski izmjenjivači).

Sorbenti za gel permeacijsku kromatografiju. Glavni tip je stiren-DVB. Također se koriste makroporozna stakla, metil metakrilat i silika gel. Isti sorbenti se koriste za ionsku ekskluzionu kromatografiju.
Pumpe. Za osiguranje protoka mobilne faze (MP) kroz kolonu sa zadanim parametrima koriste se visokotlačne pumpe. Onome najvažnijem Tehničke specifikacije LC pumpe uključuju: raspon protoka; maksimalni radni tlak; ponovljivost protoka; raspon pulsiranja dovoda otapala.

Ovisno o prirodi dovoda otapala, crpke mogu biti konstantnog dovoda (protoka) i konstantnog tlaka. U osnovi, tijekom analitičkog rada koristi se režim konstantnog protoka, a kod punjenja kolona koristi se režim konstantnog tlaka. Prema principu rada pumpe se dijele na pumpe sa štrcaljkom i klipne pumpe.

Pumpe za štrcaljke. Crpke ove vrste karakterizira gotovo potpuni odsutnost pulsiranja u protoku mobilne faze tijekom rada. Nedostaci pumpe: a) velika potrošnja vremena i otapala za pranje kod promjene otapala; b) obustava odvajanja tijekom punjenja pumpe; c) velike dimenzije i težina uz osiguranje velikog protoka i tlaka (potreban je snažan motor i velika sila klipa s njegovom velikom površinom).

Klipne klipne pumpe. Crpke ove vrste osiguravaju stalnu volumetrijsku opskrbu mobilne faze dugo vremena. Maksimalni radni tlak 300-500 atm, protok 0,01-10 ml/min. Ponovljivost volumenskog protoka je 0,5%. Glavni nedostatak je što se otapalo u sustav dovodi u obliku niza uzastopnih impulsa, pa dolazi do pulsiranja tlaka i protoka.

To je glavni razlog povećane buke i smanjene osjetljivosti gotovo svih detektora koji se koriste u LC, posebice elektrokemijskih. Načini borbe protiv pulsacija: pomoću dvostrukih pumpi ili Bag-Lai pumpe s dva klipa, pomoću uređaja za prigušivanje i elektroničkih uređaja.

Količina volumetrijskog dodavanja određena je s tri parametra: promjerom klipa (obično 3,13; 5,0; 7,0 mm), njegovom amplitudom (12-18 mm) i frekvencijom (koja ovisi o brzini vrtnje motora i mjenjača).

Dispenzeri. Svrha dozatora je prijenos uzorka pri atmosferskom tlaku do ulaza kolone pri tlaku do nekoliko atmosfera. Važno je da u dozatoru nema “mrtvih” volumena koje mobilna faza ne može isprati i da ne dođe do erozije uzorka tijekom doziranja. Isprva su LC raspršivači bili slični plinskim raspršivačima s probušenom membranom. Međutim, membrane ne podnose više od 50-100 atm, njihova kemijska otpornost je nedovoljna, njihovi komadići kontaminiraju kolonske filtere i kapilare.

Tekuća faza ima mnogo nižu stopu difuzije od plinovite faze. Stoga možete dozirati zaustavljanjem protoka - uzorak nema vremena erodirati u dozatoru. Dok se uzorak unosi u dozator, poseban ventil zatvara protok otapala. Tlak na ulazu u kolonu brzo se smanjuje; nakon nekoliko sekundi uzorak se može ubrizgati u komoru dozatora konvencionalnom mikrošpricom. Zatim se dozator zaključava, uključuje se protok otapala i dolazi do odvajanja.

Tlak koji ova slavina drži je do 500-800 atm. Ali kada protok prestane, ravnoteža u koloni je poremećena, što može dovesti do pojave "praznih" dodatnih vrhova.

Loop dispenzeri su najčešće korišteni. Kada je dozator napunjen, otvori 1, 2 i kanal između njih su pod visokim pritiskom. Ulazi 3-6, kanali između njih i petlje za doziranje su pod atmosferskim tlakom, što vam omogućuje punjenje petlje pomoću štrcaljke ili pumpe. Kada se dozator okrene, protok mobilne faze istiskuje uzorak u kolonu. Kako bi se smanjila pogreška, petlja se ispere s 5-10 puta većim volumenom uzorka. Ako je uzorak mali, može se ubrizgati u petlju pomoću mikrošprica. Volumen petlje je obično 5-50 µl.

NA. Voinov, T.G. Volova

U tekućinskoj kromatografiji visoke učinkovitosti (HPLC), priroda procesa koji se odvijaju u kromatografskoj koloni općenito je identična procesima u plinskoj kromatografiji. Jedina razlika je u korištenju tekućine kao stacionarne faze. Zbog velike gustoće tekućih pokretnih faza i velikog otpora kolona, ​​plinska i tekućinska kromatografija se uvelike razlikuju u instrumentaciji.

U HPLC-u se kao pokretne faze obično koriste čista otapala ili njihove smjese.

Za stvaranje struje čistog otapala (ili smjese otapala), koja se u tekućinskoj kromatografiji naziva eluens, koriste se pumpe uključene u hidraulički sustav kromatografa.

Adsorpcijska kromatografija se provodi kao rezultat interakcije tvari s adsorbentima, kao što su silikagel ili aluminijev oksid, koji imaju aktivna središta na površini. Razlika u sposobnosti interakcije s adsorpcijskim centrima različitih molekula uzorka dovodi do njihovog razdvajanja u zone tijekom kretanja s mobilnom fazom duž stupca. Zonsko odvajanje komponenata postignuto u ovom slučaju ovisi o interakciji s otapalom i adsorbensom.

U HPLC-u se najviše koriste silikagel adsorbenti različitih volumena, površina i promjera pora. Aluminijev oksid i drugi adsorbensi koriste se puno rjeđe. Glavni razlog za to:

nedovoljna mehanička čvrstoća, koja ne dopušta pakiranje i korištenje pri visokim tlakovima karakterističnim za HPLC;

silikagel, u usporedbi s aluminijevim oksidom, ima širi raspon poroznosti, površine i promjera pora; Znatno veća katalitička aktivnost aluminijevog oksida dovodi do iskrivljenja rezultata analize zbog razgradnje komponenti uzorka ili njihove ireverzibilne kemisorpcije.

Detektori za HPLC

Tekućinska kromatografija visoke učinkovitosti (HPLC) koristi se za detekciju polarnih nehlapljivih tvari koje se iz nekog razloga ne mogu prevesti u oblik prikladan za plinsku kromatografiju, čak ni u obliku derivata. Takve tvari posebice uključuju sulfonske kiseline, boje topljive u vodi i neke pesticide, na primjer derivate feniluree.

Detektori:

UV detektor na diodnoj matrici. “Matrika” fotodioda (njih više od dvjesto) konstantno registrira signale u UV i vidljivom području spektra, čime se omogućuje snimanje UV-B spektra u modu skeniranja. To vam omogućuje kontinuirano snimanje, uz visoku osjetljivost, neiskrivljenih spektara komponenti koje brzo prolaze kroz posebnu ćeliju.

U usporedbi s detekcijom jedne valne duljine, koja ne daje informacije o vršnoj čistoći, mogućnost usporedbe punih spektara niza dioda pruža puno veći stupanj pouzdanosti u rezultat identifikacije.

Detektor fluorescencije. Veliku popularnost fluorescentnih detektora duguju njihovoj vrlo visokoj selektivnosti i osjetljivosti, te činjenici da mnogi zagađivači okoliš fluorescirati (na primjer, poliaromatski ugljikovodici).

Elektrokemijski detektor koriste se za otkrivanje tvari koje se lako oksidiraju ili reduciraju: fenoli, merkaptani, amini, aromatski nitro- i halogeni derivati, aldehidi, ketoni, benzidini.

Kromatografsko odvajanje smjese na stupcu zbog sporog napredovanja PF-a zahtijeva dosta vremena. Kako bi se ubrzao proces, kromatografija se provodi pod pritiskom. Ova metoda se naziva tekućinska kromatografija visoke učinkovitosti (HPLC).

Modernizacija opreme koja se koristi u klasičnoj tekućinskoj kolonskoj kromatografiji učinila ju je jednom od najperspektivnijih i najsuvremenijih metoda analize. Tekućinska kromatografija visoke učinkovitosti prikladna je metoda za odvajanje, preparativnu izolaciju te kvalitativnu i kvantitativnu analizu nehlapljivih termolabilnih spojeva s niskom i visokom molekularnom težinom.

Ovisno o vrsti upotrijebljenog sorbenta, ova metoda koristi 2 mogućnosti kromatografije: na polarnom sorbentu uz korištenje nepolarnog eluensa (opcija izravne faze) i na nepolarnom sorbentu uz korištenje polarnog eluenta - takozvana reverzno-fazna visoka -izvedbena tekućinska kromatografija (RPHPLC).

Tijekom prijelaza s eluenta na eluent, ravnoteža u HPLC uvjetima uspostavlja se višestruko brže nego u uvjetima polarnih sorbenata i nevodenih PF-ova. Kao rezultat toga, kao i pogodnosti rada s vodenim i vodeno-alkoholnim eluensima, OFVLC je sada stekao veliku popularnost. Većina HPLC analiza provodi se ovom metodom.

Detektori. Izlaz pojedine komponente iz kolone bilježi se pomoću detektora. Za registraciju možete koristiti promjenu bilo kojeg analitičkog signala koji dolazi iz mobilne faze i povezan je s prirodom i količinom komponente smjese. Tekućinska kromatografija koristi analitičke signale kao što su apsorpcija ili emisija svjetlosti izlazne otopine (fotometrijski i fluorimetrijski detektori), indeks loma (refraktometrijski detektori), potencijal i električna provodljivost(elektrokemijski detektori) itd.

Kontinuirano detektirani signal snima se snimačem. Kromatogram je slijed signala detektora snimljenih na vrpci za snimanje, generiranih kada pojedinačne komponente smjese napuste kolonu. Ako se smjesa odvoji, na vanjskom kromatogramu vidljivi su pojedinačni vrhovi. Položaj pika u kromatogramu koristi se u svrhu identifikacije tvari, visina ili površina pika - u svrhu kvantitativnog određivanja.

Uvod.

Nagli razvoj tekućinske kromatografije u posljednjih 10 godina uglavnom je posljedica intenzivnog razvoja teorijske osnove i praktična uporaba njegove visoko učinkovite verzije, kao i stvaranje i industrijska proizvodnja potrebnih sorbenata i opreme.

Izrazita značajka tekućinske kromatografije visoke učinkovitosti (HPLC) je uporaba sorbenata s veličinom zrna od 3-10 mikrona, što osigurava brzi prijenos mase s vrlo visokom učinkovitošću odvajanja.

Trenutačno je HPLC zauzeo prvo mjesto među instrumentalnim metodama po brzini razvoja, čak i nadmašujući plinsku kromatografiju. Najvažnija prednost HPLC-a u usporedbi s plinskom kromatografijom je mogućnost proučavanja gotovo bilo kojeg objekta bez ograničenja njihovih fizikalno-kemijskih svojstava, na primjer, vrelišta ili molekularne težine.

Danas je HPLC dobro osmišljena instrumentalna metoda koja se široko koristi u raznim područjima znanosti i tehnologije. Njegov značaj posebno je velik u kritičnim područjima kao što su biokemija, molekularna biologija, kontrola onečišćenja okoliša, kao iu kemijskoj, petrokemijskoj, prehrambenoj i farmaceutskoj industriji.

budući da je potrebno uzeti u obzir niz vrlo specifičnih zahtjeva zbog sljedećih značajki metodologije.

A. HPLC stupci su napunjeni medijima vrlo malog promjera čestica. Kao rezultat toga, pri volumetrijskim brzinama otapala potrebnim za brzo odvajanje uzorka, na stupcu se stvara visoki tlak.

b. Detektori koji se koriste u HPLC-u osjetljivi su na fluktuacije u protoku eluenta i tlaku (šum). Štoviše, kada se koriste detektori koncentracije, potrebna je još veća stabilnost volumetrijske brzine eluenta.

V. Proces kromatografskog odvajanja prati niz antagonističkih učinaka, na primjer, disperzija uzorka u mobilnoj fazi dovodi do miješanja odvojenih komponenti i smanjuje maksimalnu koncentraciju tvari u eluiranom vrhu (u detektoru). Disperzija se opaža u svim područjima sustava od točke ubrizgavanja uzorka do detektora.

d. Otapala koja djeluju kao pokretna faza često mogu uzrokovati koroziju opreme. To se prvenstveno odnosi na otapala koja se koriste u kromatografiji reverzne faze, koja se preferira u biokemijskim HPLC aplikacijama.

Specifičnosti HPLC-a kao instrumentalne tehnike moraju se uzeti u obzir pri razvoju, stvaranju i radu ovih sustava. Bilo je potrebno više od deset godina potrage i istraživanja da bi se stvorili komercijalni uzorci kromatografskih sustava i njihovih komponenti koji su dovoljno pouzdani, jednostavni i sigurni za rad uz prihvatljiv omjer cijene i tehničkih karakteristika. Nedavni trendovi prema smanjivanju stupova (i duljine i promjera) nameću nove zahtjeve instrumentima.

1.1. UČINKOVITOSTISELEKTIVNOST

Kromatografija je metoda odvajanja komponenata smjese koja se temelji na razlici u njihovoj ravnotežnoj raspodjeli između dviju "faza koje se ne miješaju, od kojih je jedna nepokretna, a druga pokretna. Komponente uzorka se kreću duž kolone kada se nalaze u mobilnoj fazi, a ostaju na mjestu kada su u stacionarnoj fazi Što je veći afinitet komponente za stacionarnu fazu, a manji za mobilnu fazu, to se ona sporije kreće kroz kolonu i duže se u njoj zadržava. Zbog razlike u afinitetu komponenata smjese za stacionarnu i mobilnu fazu, postiže se glavni cilj kromatografije - razdvajanje prihvatljivog vremenskog perioda smjese na pojedinačne vrpce (vrhove) komponenti dok se kreću duž kolona s mobilnom fazom.

Iz ovih općih koncepata jasno je da je kromatografsko odvajanje moguće samo ako su komponente uzorka, koje ulaze u kolonu kada se uzorak unese, prvo otopljene u mobilnoj fazi i, drugo, međusobno djeluju (zadržavaju se) sa stacionarnom fazom. . Ako prilikom unošenja uzorka neka komponenta nije u obliku otopine, bit će filtrirana i neće sudjelovati u kromatografskom procesu. Isto tako, komponente koje ne stupaju u interakciju sa stacionarnom fazom proći će kroz kolonu s mobilnom fazom bez razdvajanja na svoje komponente.

Prihvatimo uvjet da su neke dvije komponente topive u mobilnoj fazi i da uzajamno djeluju sa stacionarnom fazom, tj. krojatografski proces može teći bez smetnji. U tom slučaju, nakon prolaska smjese kroz kolonu, možete dobiti kromatograme oblika a, b ili V(Slika 1.1). Ovi kromatogrami ilustriraju kromatografske separacije koje se razlikuju po učinkovitosti (A i b) s jednakom selektivnošću i selektivnošću (b I V) s jednakom učinkovitošću.

Što je uži vrh dobiven u istom retencijskom vremenu, veća je učinkovitost kolone. Učinkovitost kolone mjeri se brojem teoretskih ploča (NPT) N: veća je učinkovitost

Riža. 1.2. Parametri kromatografskih vrhova i izračun broja teoretskih ploča:

t R - vršno vrijeme zadržavanja; h - visina vrha; Wj/j - širina vrha na polovici visine

Riža. 1.1. Vrsta kromatograma ovisno o učinkovitosti i selektivnosti kolone:

A- normalna selektivnost, smanjena učinkovitost (manje teoretskih ploča); b - uobičajena selektivnost i učinkovitost; V - normalna učinkovitost, povećana selektivnost (veći omjer vremena zadržavanja komponente)

učinkovitosti, što je FTT veći, to je manje širenje vrha početno uskog pojasa dok prolazi kroz stupac, i to je uži vrh na izlazu iz stupca. PTT karakterizira broj koraka u uspostavljanju ravnoteže između pokretne i stacionarne faze.

Poznavajući broj teoretskih ploča po stupcu i duljinu stupca L (µm), kao i prosječni promjer zrna sorbensa d c (µm), lako je dobiti vrijednosti visine ekvivalentne teoretskoj ploči (HETT), kao i smanjene visine ekvivalentne teoretskoj ploči (RHETT):

KLADI SE = L/ N

PVETT =B3TT/d c .

Imajući vrijednosti FTT, HETT i PHETT, lako se može usporediti učinkovitost kolona različitih tipova, različitih duljina, ispunjenih sorbentima različite prirode i granularnosti. Usporedbom PTT-a dvaju stupova iste duljine uspoređuje se njihova učinkovitost. Pri usporedbi HETP uspoređuju se kolone s sorbentima iste veličine zrna i različite duljine. Konačno, vrijednost PVETT omogućuje bilo koje dvije kolone da procijene kvalitetu sorbensa, prvo, i kvalitetu punjenja kolona, ​​i drugo, bez obzira na duljinu kolona, ​​granulaciju sorbensa po svojoj prirodi.

Selektivnost kolone igra veliku ulogu u postizanju kromatografskog odvajanja.

Selektivnost kolone ovisi o mnogim čimbenicima, a vještina eksperimentatora uvelike je određena sposobnošću utjecaja na selektivnost odvajanja. Za to su tri vrlo važna čimbenika u rukama kromatografa: izbor kemijske prirode sorbensa, izbor sastava otapala i njegovih modifikatora te uzimanje u obzir kemijske strukture i svojstava odvojenih komponenti. . Ponekad primjetan utjecaj Na selektivnost utječu promjene temperature stupca, što mijenja koeficijente raspodjele tvari između pokretne i nepokretne faze.

Kada se razmatra i procjenjuje odvajanje dviju komponenti u kromatogramu, rezolucija je važan parametar. R s, koji povezuje izlazna vremena i vršne širine obiju odvojenih komponenti

Razlučivost kao parametar koji karakterizira razdvajanje vrhova raste kako raste selektivnost, što se odražava povećanjem brojnika, a povećava učinkovitost, što se odražava smanjenjem vrijednosti nazivnika zbog smanjenja širine vrhova. Stoga je brzi napredak tekućinske kromatografije doveo do promjene koncepta “high pressure liquid chromatography” - zamijenjen je “high resolution liquid chromatography” (dok je sačuvan skraćeni oblik pojma na engleskom jeziku). HPLC kao najispravnije karakteriziraju smjer razvoja moderne tekućinske kromatografije).

Stoga se ispiranje kolone smanjuje, a učinkovitost povećava kada se koristi finiji sorbent, ujednačenijeg sastava (uska frakcija), gušće i ravnomjernije pakiran u koloni, korištenjem tanjih slojeva graft faze, manje viskoznih otapala i optimalnih brzina protoka.

Međutim, uz zamućenje trake kromatografske zone tijekom procesa separacije u koloni, može doći i do ispiranja u uređaju za uvođenje uzorka, u veznim kapilarama injektoru - koloni i koloni - detektoru, u detektorskoj ćeliji i u nekim pomoćni uređaji (mikrofilteri za hvatanje mehaničkih čestica iz uzoraka instaliranih nakon injektora, predkolona, ​​spiralnih reaktora, itd.) - Što je veći volumen izvan kolone u usporedbi sa zadržanim volumenom vrha, veća je erozija. Također je važno gdje se mrtvi volumen nalazi: što je kromatografski signal uži, to je veće zamućenje mrtvog volumena. Stoga posebnu pozornost treba obratiti na dizajn onog dijela kromatografa gdje je kromatografska zona najuža (injektor i uređaji od injektora do kolone) - tu je izvankolonska erozija najopasnija i ima najveći utjecaj. Iako se vjeruje da u dobro dizajniranim kromatografima izvore dodatnog razrjeđivanja izvan kolone treba svesti na najmanju moguću mjeru, ipak, svaki novi uređaj, svaka modifikacija kromatografa mora nužno završiti testiranjem na koloni i usporedbom dobivenog kromatograma. s onom za putovnicu. Ako se primijeti vršno izobličenje ili oštro smanjenje učinkovitosti, potrebno je pažljivo pregledati kapilare i druge uređaje koji su tek uvedeni u sustav.

Ispiranje izvan kolone i njegova pogrešna procjena mogu dovesti do značajnog (više od 50%) gubitka učinkovitosti, posebno u slučajevima kada se relativno stari kromatografi pokušavaju koristiti za HPLC velike brzine, HPLC na mikrokoloni i druge varijante moderne HPLC koje zahtijevaju mikroinjektori, spojni kapilari s unutarnjim promjera 0,05-0,15 mm minimalne duljine, kolone kapaciteta 10-1000 µl, detektori s mikrokivetama kapaciteta 0,03-1 µl i velikom brzinom, brzi snimači i integratori .

1.2. ZADRŽAVANJE OTAPALA I ČVRSTOĆA

Kako bi se analiti mogli odvojiti na koloni, kao što je gore navedeno, koeficijent kapaciteta k" mora biti veći od 0, tj. tvari moraju biti zadržane stacionarnom fazom, sorbentom. Međutim, faktor kapaciteta ne smije biti previsok da bi se postiglo prihvatljivo vrijeme eluiranja. Ako je za danu smjesu tvari odabrana stacionarna faza koja ih zadržava, tada se daljnji rad na razvoju tehnike analize sastoji u odabiru otapala koje bi idealno dalo različite za sve komponente, ali prihvatljivo ne jako velike k". To se postiže promjenom eluacijske snage otapala.

U slučaju adsorpcijske kromatografije na silikagelu ili aluminijevom oksidu, u pravilu se jačina dvokomponentnog otapala (npr. heksana s dodatkom izopropanola) povećava povećanjem udjela polarne komponente (izopropanola), ili smanjena smanjenjem sadržaja izopropanola. Ako polarna komponenta koja sadrži postane premala (manje od 0,1%), treba je zamijeniti sa slabijom snagom eluiranja. Isto se radi, zamjenjujući polarne ili nepolarne komponente s drugima, čak i ako ovaj sustav ne pruža željenu selektivnost s obzirom na komponente od interesa u smjesi. Pri odabiru sustava otapala uzimaju se u obzir i topljivost komponenti smjese i eluotropni niz otapala koji su sastavili različiti autori.

Snaga otapala odabire se na približno isti način kada se koriste cijepljene polarne faze (nitril, amino, diol, nitro itd.), uzimajući u obzir moguće kemijske reakcije i isključujući fazno opasna otapala (na primjer, ketone za amino fazu).

U slučaju kromatografije obrnute faze, jačina otapala se povećava povećanjem sadržaja organske komponente u eluensu (metanol, acetonitril ili THF) i smanjuje dodavanjem više vode. Ako nije moguće postići željenu selektivnost, koriste se druge organske komponente ili se pokušavaju promijeniti različitim dodacima (kiseline, reagensi ionskih parova itd.).

Kod odvajanja kromatografijom ionske izmjene jakost otapala mijenja se povećanjem ili smanjenjem koncentracije puferske otopine ili promjenom pH; u nekim slučajevima koristi se modifikacija organskim tvarima.

Međutim, posebno u slučaju složenih prirodnih i bioloških smjesa, često nije moguće odabrati jačinu otapala na takav način da sve komponente uzorka eluiraju unutar prihvatljivog vremena. Tada morate pribjeći gradijentnom eluiranju, tj. koristiti otapalo čija se jačina eluiranja mijenja tijekom procesa analize tako da stalno raste prema unaprijed zadanom programu. Ovom tehnikom moguće je postići eluiranje svih komponenti složenih smjesa u relativno kratkom vremenu i njihovo razdvajanje na komponente u obliku uskih vrhova.

1.3. VELIČINA ČESTICA SORBENTA, PROPUSNOST I UČINKOVITOST

S obzirom na eroziju u koloni, ukazali smo da učinkovitost kolone (HETT) ovisi o veličini čestica sorbensa. U velikoj mjeri, brzi razvoj HPLC-a u posljednjih 10-12 godina bio je posljedica, prvo, razvoja metoda za proizvodnju sorbenata s veličinama čestica od 3 do 10 mikrona i s uskim frakcijskim sastavom, pružajući visoku učinkovitost s dobrim propusnost, i drugo, razvojne metode za punjenje kolona ovim sorbentima i, treće, razvoj i serijska proizvodnja tekućinskih kromatografa s visokotlačnim pumpama, injektora i detektora s kivetama malog volumena koji mogu bilježiti pikove malog volumena.

Za dobro napunjene kolone napunjene kašom, smanjena ekvivalentna teoretska visina ploče (LPHE) može biti 2 bez obzira koriste li se za pakiranje čestice od 3, 5, 10 ili 20 μm. U ovom slučaju, dobit ćemo redom stupce (standardne duljine od 250 mm) s učinkom od 41670, 25000, 12500 i 6250 t.t. Čini se prirodnim odabrati najučinkovitiju kolonu napunjenu česticama od 3 µm. Međutim, ova će učinkovitost doći po cijenu rada s vrlo visokim tlakom i relativno malom brzinom odvajanja, budući da će postojeća pumpa najvjerojatnije moći pumpati otapalo kroz takav stupac velikom volumetrijskom brzinom. Ovdje se susrećemo s pitanjem odnosa između veličine čestica sorbensa, učinkovitosti i propusnosti kolona.

Ako odavde izrazimo faktor otpora stupa - bezdimenzionalnu veličinu, dobivamo sljedeću jednadžbu:

Faktor otpora za kolone napunjene mikročesticama iste vrste korištenjem iste metode malo varira i iznosi sljedeće vrijednosti:

Vrsta čestice "... Nepravilna sferna

form form

Suho pakiranje. . . . . 1000-2000 800-1200

Pakiranje suspenzije. . . 700-1500 500-700

Ulazni tlak u stupcu proporcionalan je linearnoj brzini protoka, faktoru otpora u stupcu, viskoznosti otapala i duljini stupca te obrnuto proporcionalan kvadratu promjera čestice.

Primjenom ovog odnosa na gore opisane kolone s česticama promjera 3, 5, 10 i 20 µm i pretpostavkom konstantne linearne brzine protoka, faktora otpora kolone i viskoznosti otapala, dobivamo omjer ulaznog tlaka od 44:16:4:1 za stupove jednake duljine. Dakle, ako za sorbent reverzne faze s veličinom čestica od 10 μm pri korištenju metanolnih sustava otapala - . vode (70:30) obično na standardnoj koloni pri brzini protoka otapala 1 ml/min, tlak na ulazu u kolonu je 5 MPa, zatim za čestice od 5 μm - 20 MPa i za 3 μm - 55 MPa. . Pri korištenju silika gela i manje viskoznog sustava otapala, heksan - izopropanol (100:2), vrijednosti će biti znatno niže: 1, 4 odnosno 11 MPa. Ako je u slučaju sorbenta reverzne faze korištenje čestica veličine 3 μm vrlo problematično, a 5 μm je moguće, ali ne na svim uređajima, onda za sorbent normalne faze nema problema s tlakom. Treba napomenuti da moderni HPLC velike brzine obično koristi veću brzinu protoka otapala nego u gornjem primjeru, tako da se zahtjevi za tlakom još više povećavaju.

Međutim, u slučajevima kada je za separaciju potreban određeni broj teoretskih ploča, a poželjno je provesti analizu brzine, slika se donekle mijenja. Budući da će duljine kolona sa sorbentima veličine zrna od 3, 5, 10 mikrona, uz jednaku učinkovitost, biti 7,5; 12,5 i 25 cm, tada će se omjer tlaka na ulazu u stupce promijeniti na 3:2:1. Sukladno tome, trajanje analize na takvim stupcima jednake učinkovitosti bit će u omjeru 0,3:0,5:1, tj. pri prelasku s 10 na 5 i 3 mikrona, trajanje analize će se smanjiti za 2 i 3,3 puta. Ova brža analiza dolazi po cijenu proporcionalno višeg tlaka na ulazu u kolonu.

Prikazani podaci vrijede za one slučajeve gdje sorbenti različitih veličina zrna imaju iste krivulje raspodjele veličine čestica, kolone su pakirane na isti način i imaju isti faktor otpora kolone. Treba imati na umu da se teškoće dobivanja uskih frakcija sorbenta povećavaju kako se smanjuje veličina čestica i to. Frakcije različitih proizvođača imaju različite frakcijske sastave. Stoga će faktor otpora kolone varirati ovisno o veličini zrna, vrsti sorbenta, načinu pakiranja kolone itd.

KLASIFIKACIJA HPLC METODA PREMA SEPARACIONOM MEHANIZMU

Većina separacija provedenih HPLC-om temelji se na mješovitom mehanizmu interakcije tvari s sorbensom, osiguravajući veće ili manje zadržavanje komponenata u koloni. Mehanizmi odvajanja u više ili manje čistom obliku su dosta rijetki u praksi, na primjer, adsorpcija kada se za odvajanje aromatskih ugljikovodika koristi apsolutno bezvodni silikagel i bezvodni heksan.

S mješovitim retencijskim mehanizmom za tvari različitih struktura i molekulskih masa moguće je procijeniti doprinos retenciji adsorpcije, distribucije, isključivanja i drugih mehanizama. Međutim, za bolje razumijevanje i razumijevanje mehanizama odvajanja u HPLC-u, preporučljivo je uzeti u obzir odvajanja s prevladavanjem jednog ili drugog mehanizma koji se odnose na određenu vrstu kromatografije, na primjer, kromatografiju ionske izmjene.

2.1.1 ADSORPCIJSKA KROMATOGRAFIJA

Razdvajanje adsorpcijskom kromatografijom provodi se kao rezultat interakcije tvari s adsorbentima, poput silika gela ili aluminijevog oksida, koji imaju aktivna središta na površini. Razlika u sposobnosti interakcije s adsorpcijskim centrima različitih molekula uzorka dovodi do njihovog razdvajanja u zone tijekom kretanja s mobilnom fazom duž stupca. Zonsko odvajanje komponenata postignuto u ovom slučaju ovisi o interakciji s otapalom i adsorbensom.

Sorpcija na površini adsorbensa koji sadrži hidroksilne skupine temelji se na specifičnoj interakciji između polarna površina adsorbent i polarne (ili sposobne polarizirati) skupine ili dijelove molekula. Takve interakcije uključuju dipol-dipol interakciju između stalnih ili induciranih dipola, stvaranje vodikove veze, do stvaranja r-kompleksa ili kompleksa prijenosa naboja. Moguća i prilično česta pojava u praktičnom radu je manifestacija kemisorpcije, koja može dovesti do značajnog povećanja vremena zadržavanja, oštrog smanjenja učinkovitosti, pojave produkata razgradnje ili nepovratne sorpcije tvari.

Adsorpcijske izoterme tvari imaju linearni, konveksni ili konkavni oblik. S linearnom adsorpcijskom izotermom, vrh tvari je simetričan i vrijeme zadržavanja ne ovisi o veličini uzorka. Najčešće su adsorpcijske izoterme tvari nelinearne i imaju konveksan oblik, što dovodi do određene asimetrije vrha s formiranjem repa.

U HPLC-u se najviše koriste silikagel adsorbenti s različitim volumenima pora, površinama i promjerima pora. Aluminijev oksid se koristi mnogo rjeđe, a ostali adsorbensi, koji se široko koriste u klasičnoj kolonskoj i tankoslojnoj kromatografiji, koriste se izuzetno rijetko. Glavni razlog za to je nedovoljna mehanička čvrstoća većine drugih adsorbenata, što ne dopušta njihovo pakiranje ili korištenje pri visokim tlakovima karakterističnim za HPLC.

Polarne skupine koje uzrokuju adsorpciju i nalaze se na površini silika gela i aluminijevog oksida sličnih su svojstava. Stoga je obično redoslijed eluiranja smjesa tvari i eluotropni niz otapala za njih isti. Međutim, razlika u kemijskoj strukturi silikagela i aluminijevog oksida ponekad dovodi do razlika u selektivnosti - tada se daje prednost jednom ili drugom adsorbensu koji je prikladniji za određeni zadatak. Na primjer, glinica osigurava veću selektivnost za odvajanje određenih polinuklearnih aromatskih ugljikovodika.

Prednost koja se obično daje silika gelu u odnosu na aluminijev oksid objašnjava se većim izborom silika gela u pogledu poroznosti, površine i promjera pora, kao i znatno većom katalitičkom aktivnošću aluminijevog oksida, što često dovodi do iskrivljenja rezultata analize zbog razgradnje komponenti uzorka ili njihove ireverzibilne kemisorpcije .

2.1.2 Nedostaci adsorpcijske kromatografije koji ograničavaju njezinu upotrebu

Popularnost adsorpcijske kromatografije postupno je padala kako se HPLC metoda razvijala; sve više su je zamjenjivale i nastavljaju zamjenjivati ​​druge mogućnosti, kao što su reverzno-fazna i normalno-fazna HPLC na sorbentima s cijepljenom fazom. Koji su nedostaci adsorpcijske kromatografije koji su doveli do toga?

Prije svega, to je dugotrajnost procesa ekvilibriranja adsorbenata s otapalima koja sadrže vodu u tragovima, teškoće pripreme takvih otapala s određenom i ponovljivom vlagom. To rezultira slabom obnovljivošću parametara zadržavanja, rezolucije i selektivnosti. Iz istog razloga nemoguće je koristiti gradijentnu eluciju - povratak u početno stanje je toliko dug da značajno premašuje vrijeme dobiveno korištenjem gradijenta.

Značajni nedostaci adsorbenata, posebice aluminijeva oksida, povezani s čestim slučajevima preraspodjele spojeva osjetljivih na katalizu, njihovu razgradnju i ireverzibilnu sorpciju, također su dobro poznati i više puta su zapaženi u literaturi. Ireverzibilno sorbirane tvari, nakupljajući se na početnom dijelu kolone, mijenjaju prirodu sorbensa i mogu dovesti do povećanja otpora kolone ili čak do njenog potpunog začepljenja. Posljednji nedostatak može se eliminirati korištenjem predstupca, koji Po- Kako se otpor i začepljenje povećava, zamjenjuje se novim* ili se ponovno puni novim sorbentom. Međutim, ireverzibilna sorpcija, koja se također događa u ovom slučaju, rezultira kromatogramom u kojem komponente uzorka osjetljive na sorpciju ili katalitičku razgradnju potpuno ili djelomično nedostaju.

2.2. DISTRIBUCIJSKA KROMATOGRAFIJA

Razdjelna kromatografija je varijanta HPLC-a u kojoj se razdvajanje smjese na komponente provodi zbog razlike u njihovim koeficijentima raspodjele između dviju faza koje se ne miješaju: otapala (mobilna faza) i faze na sorbensu (stacionarna faza). Povijesno gledano, prvi su bili sorbenti ove vrste, koji su se dobivali nanošenjem tekućih faza (oksidipropionitril, parafinsko ulje i dr.) na porozne podloge, slično kao što su se pripremali i pripremaju sorbenti za plinsko-tekućinsku kromatografiju (GLC). Međutim, odmah su otkriveni nedostaci takvih sorbenata, od kojih je glavni bio relativno brzo ispiranje faze iz nosača. Zbog toga se količina faze u koloni postupno smanjivala, retencijska vremena također su se smanjivala, a adsorpcijski centri koji nisu bili pokriveni fazom pojavili su se u početnom dijelu kolone, uzrokujući stvaranje repova vrhova. Ovaj nedostatak je riješen zasićenjem otapala primijenjenom fazom prije nego što je ušlo u kolonu. Uvlačenje je također smanjeno kada su korištene viskoznije i manje topive polimerne faze, ali u ovom slučaju, zbog poteškoće difuzije iz debelih polimernih filmova, učinkovitost kolone je značajno smanjena.

Pokazalo se logičnim kemijskim vezama nacijepiti tekuću fazu na nosač na način da njegovo uklanjanje postane fizički nemoguće, odnosno pretvoriti nosač i fazu u jedno – u tzv. sorbent cijepljene faze.

Daljnji napori istraživača bili su usmjereni na potragu za reagensima čije bi se cijepljenje odvijalo prilično brzo i potpuno, a nastale veze bile što stabilnije. Takvi reagensi bili su alkilklorosilani i njihovi derivati, što je omogućilo da se sličnom tehnologijom dobiju sorbenti graft-faze različitih tipova s ​​različitim polarnim i nepolarnim skupinama na površini.

Uspješna primjena potonjeg tipa sorbenata za HPLC pridonijela je rastu njihove proizvodnje od strane raznih proizvođača. Svaka tvrtka proizvodi takve sorbente, u pravilu, na temelju vlastite vrste silika gela i koristeći vlastitu tehnologiju, koja obično predstavlja proizvodni "know-how". Kao rezultat toga, velik broj sorbenata, kemijski potpuno jednako nazvanih (na primjer, silikagel cijepljen oktadecilsilanom), ima vrlo različite kromatografske karakteristike. To je zbog činjenice da silikagel može imati šire ili uže pore, drugačiju površinu, poroznost, njegova površina prije cijepljenja može biti hidroksilirana ili ne, mogu se cijepiti mono-, di- ili triklorosilani, uvjeti cijepljenja mogu dati monomerne, polimerne. ili faza miješanog sloja, različite metode se koriste za uklanjanje zaostalih reagensa, dodatna deaktivacija silanola i drugih aktivnih skupina može se ali ne mora koristiti.

Složenost tehnologije cijepljenja reagensa i pripreme sirovina i materijala, njegova višestupanjska priroda, dovodi do činjenice da čak i serije sorbenata dobivenih istom tehnologijom od jedne proizvodne tvrtke mogu imati malo različite kromatografske karakteristike. To se posebno odnosi na slučajeve kada se takvi sorbenti koriste za analizu višekomponentnih smjesa koje sadrže tvari koje se izrazito razlikuju po broju i položaju funkcionalnih skupina, te vrsti funkcionalnosti.

Uzimajući u obzir gore navedeno, uvijek treba težiti tome da se pri korištenju tehnike analize opisane u literaturi koristi isti sorbent i isti radni uvjeti. U ovom slučaju, vjerojatnost da se djelo neće reproducirati je minimalna. Ako to nije moguće, ali se uzima sorbent druge tvrtke sa sličnom cijepljenom fazom, morate biti spremni na činjenicu da će trebati dugo vremena za preradu tehnike. Istodobno, postoji mogućnost (i to treba uzeti u obzir) da se s ovim sorbensom ni nakon dugog razvoja ne može postići potrebno odvajanje. Prisutnost u literaturi mnogih opisanih tehnika separacije na starim sorbentima koji se proizvode već duže vrijeme potiče njihovu daljnju proizvodnju i korištenje iz tog razloga. Međutim, u slučajevima kada je potrebno prijeći na razvoj izvornih metoda, posebno u odnosu na tvari sklone razgradnji, kemisorpciji, preraspodjeli, preporučljivo je započeti rad na sorbentima koji su nedavno razvijeni i proizvedeni korištenjem novih, poboljšanih verzije tehnologije. Novi sorbenti imaju ujednačeniji frakcijski sastav, ujednačeniju i potpuniju pokrivenost površine cijepljenom fazom i naprednije završne faze obrade sorbensa.

2.3. KROMATOGRAFIJA IONSKE IZMJENE

U kromatografiji ionske izmjene odvajanje komponenata smjese postiže se reverzibilnom interakcijom ionizirajućih tvari s ionskim skupinama sorbensa. Očuvanje električne neutralnosti sorbenta osigurava se prisutnošću sposobnih ionska izmjena protuioni koji se nalaze u neposrednoj blizini površine. Ion unesenog uzorka, u interakciji s fiksnim nabojem sorbenta, izmjenjuje se s protuionom. Tvari s različitim afinitetima za fiksne naboje odvajaju se na anionskim izmjenjivačima ili kationskim izmjenjivačima. Anionski izmjenjivači imaju pozitivno nabijene skupine na površini i sorbiraju anione iz mobilne faze. Kationski izmjenjivači prema tome sadrže skupine s -negativnim nabojem koje međusobno djeluju s kationima.

Kao mobilna faza koriste se vodene otopine soli kiselina, baza i otapala poput tekućeg amonijaka, tj. sustavi otapala s visokom dielektričnom konstantom e i većom sklonošću ionizaciji spojeva. Obično rade s puferskim otopinama koje omogućuju pH vrijednost koju treba prilagoditi.

Tijekom kromatografskog odvajanja, ioni analita natječu se s ionima sadržanim u eluensu, težeći interakciji sa suprotno nabijenim skupinama sorbenta. Iz toga slijedi da se kromatografija ionske izmjene može koristiti za odvajanje bilo kojih spojeva koji se na neki način mogu ionizirati. Moguće je analizirati čak i neutralne molekule šećera u obliku njihovih kompleksa s boratnim ionom:

Šećer + VO 3 2 - = Šećer -VO 3 2 -.

Kromatografija ionske izmjene nezamjenjiva je za odvajanje visoko polarnih tvari, koje se ne mogu analizirati GLC-om bez pretvorbe u derivate. Ovi spojevi uključuju aminokiseline, peptide i šećere.

Kromatografija ionske izmjene ima široku primjenu u medicini, biologiji, biokemiji, za praćenje okoliša, u analizi sadržaja lijekova i njihovih metabolita u krvi i urinu, pesticida u prehrambenim sirovinama, kao i za odvajanje anorganskih spojeva, uključujući radioizotope, lantanide, aktinoide, itd. Analiza biopolimera (proteini, nukleinske kiseline itd.), što je obično trajalo satima ili danima, provodi se kromatografijom ionske izmjene u 20-40 minuta uz bolje odvajanje. Korištenje kromatografije ionske izmjene u biologiji omogućilo je promatranje uzoraka izravno u biološkom mediju, smanjujući mogućnost preraspodjele ili izomerizacije, što može dovesti do netočne interpretacije konačnog rezultata. Zanimljivo je koristiti ovu metodu za praćenje promjena koje se događaju u biološkim tekućinama. Korištenje poroznih slabih anionskih izmjenjivača na bazi silika gela omogućilo je odvajanje peptida. V

Mehanizam ionske izmjene može se prikazati u obliku sljedećih jednadžbi:

za anionsku izmjenu

X-+R+Y- h ->■ Y-+R+X-.

za kationsku izmjenu |

X+ + R-Y+ h=* Y++R-X+.

U prvom slučaju, ion X~ uzorka se natječe s ionom mobilne faze Y~ za R+ ionske centre ionskog izmjenjivača, a u drugom slučaju, X+ kationi uzorka se natječu s Y+ ionima mobilne faze za R ~ ionski centri.

Naravno, ioni uzorka koji slabo stupaju u interakciju s ionskim izmjenjivačem slabo će se zadržati na koloni tijekom ovog natjecanja i prvi će biti isprani iz nje, i obrnuto, jače zadržani ioni zadnji će eluirati iz kolone. . Tipično, BTqpH4Hbie interakcije neionske prirode javljaju se zbog adsorpcije ili vodikovih veza uzorka s neionskim dijelom matrice ili zbog ograničene topljivosti uzorka u mobilnoj fazi. Teško je izolirati "klasičnu" kromatografiju ionske izmjene u njenom "čistom" obliku, pa stoga neki kromatografi polaze od empirijskih, a ne teoretskih načela kromatografije ionske izmjene.

Razdvajanje pojedinih tvari prvenstveno ovisi o izboru najprikladnijeg sorbensa i mobilne faze. Ionsko-izmjenjivačke smole i silika gelovi s cijepljenim ionogenim skupinama koriste se kao stacionarne faze u ionsko-izmjenjivačkoj kromatografiji.

2.4. KROMATOGRAFIJA ISKLJUČIVANJA ODSJEKA

Ekskluziona kromatografija je opcija! tekućinska kromatografija, kod koje dolazi do odvajanja zbog raspodjele molekula između otapala koje se nalazi unutar pora sorbensa i otapala koje teče " između njegovih čestica.

Za razliku od drugih HPLC opcija, gdje razdvajanje dolazak Zbog različitih interakcija komponenata s površinom sorbensa, uloga krutog punila u kromatografiji za isključivanje veličine je samo formiranje pora određene veličine, a stacionarna faza je otapalo koje ispunjava te pore. Stoga je uporaba pojma "sorbent" za ova punila u određenoj mjeri proizvoljna.

Temeljna značajka metode je mogućnost razdvajanja molekula prema njihovoj veličini u otopini u rasponu gotovo bilo koje molekularne težine - od 10 2 do 10 8, što je čini nezamjenjivom za proučavanje sintetskih i biopolimera.

Tradicionalno, proces koji se provodi u organskim otapalima još uvijek se često naziva gel permeacijska kromatografija, au vodenim sustavima - gel filtracijska kromatografija. U ovoj knjizi za obje opcije usvojen je jedan pojam, koji dolazi od engleskog "Size Exclusion" - isključenje veličinom - i najpotpunije odražava mehanizam procesa.

U monografijama je provedena detaljna analiza postojećih ideja o vrlo složenoj teoriji procesa eliminacijske kromatografije.

Ukupni volumen otapala u koloni Vt (ovo se često naziva ukupni volumen stupca, jer Vd ne sudjeluje u kromatografskom procesu) je zbroj volumena pokretne i stacionarne faze.

Zadržavanje molekula u koloni za isključenje određeno je vjerojatnošću njihove difuzije u pore i ovisi o omjeru veličina molekula i pora, što je shematski prikazano na sl. 2.15. Koeficijent distribucije ka, kao i u drugim varijantama kromatografije, to je omjer koncentracija tvari u stacionarnoj i pokretnoj fazi.

Budući da mobilna i stacionarna faza imaju isti sastav, onda Kd tvar kojoj su obje faze jednako dostupne jednaka je jedinici. Ova situacija se ostvaruje za molekule C najmanjih veličina (uključujući molekule otapala), koje prodiru u sve pore (vidi sliku 2.15) i stoga se najsporije kreću kroz kolonu. Njihov retencijski volumen jednak je ukupnom volumenu otapala Vt-

Riža. 2.15. Model molekularne separacije mjerenjem u kromatografiji isključenja veličine

Sve molekule čija je veličina veća od veličine pora sorbensa ne mogu ući u njih (potpuna isključenost) i proći kroz kanale između čestica. One eluiraju iz kolone s istim retencijskim volumenom jednakim volumenu mobilne faze V 0 - Koeficijent raspodjele za ove molekule je nula.

Molekule srednje veličine, koje mogu prodrijeti samo kroz neke pore, zadržavaju se u stupcu prema svojoj veličini. Koeficijent distribucije ovih molekula varira od nule do jedan i karakterizira udio volumena pora koji je dostupan molekulama određene veličine. Njihov zadržani volumen određen je zbrojem V o i dostupnog dijela volumena pora.

KVALITATIVNA ANALIZA

Kromatograf koji ulazi u područje tekućinske kromatografije visoke učinkovitosti mora se upoznati s osnovama kvalitativne analize. Kvalitativnom analizom identificira se poznati proizvod, dobiven na novi način ili pronađen u mješavini s drugim proizvodima." Neophodna je pri izdvajanju različitih komponenti iz složenih bioloških i kemijskih smjesa, što je posebno važno u medicini, forenzici, ekologiji, za praćenje prisutnosti nekih medicinskih kemijskih proizvoda i njihovih metabolita u bioml.ter.ialima. "Upoznavanje s osnovama kvalitativne" analize pomoći će u izbjegavanju uobičajenih pogrešaka, npr. razlikovanje nečistoća u uzorku od nečistoća u otapalu ili provjera čistoće tvari na više od jednog spektrofotometra valne duljine, ali na različitim itd.

Prije nastavka analize potrebno je utvrditi je li cijeli uzorak eluiran iz kolone danim sustavom otapala ili ne. Kako bi se osiguralo potpuno ispiranje, potrebno je prikupiti svu tekućinu koja teče iz kolone, ispariti otapalo, izvagati ostatak i utvrditi stupanj iskorištenja uzorka.

Identifikacija komponenti u HPLC-u može se obaviti na tri načina: 1) korištenjem informacija o zadržavanju; 2) ispitati zone dobivene odvajanjem u stupcu tekućinskog kromatografa spektralnim odn kemijska analiza; 3) izravno spojite analizator spektra na kolonu.

Retencijski volumen se koristi za bilježenje vrhova u kromatografiji. V R ili vrijeme zadržavanja t R. Obje su veličine karakteristične za tvar u određenom kromatografskom sustavu. Budući da se vrijeme zadržavanja tvari koja se odvaja sastoji od vremena interakcije u stupcu i vremena prolaska praznih dijelova cijevi, ono se razlikuje od instrumenta do instrumenta. Prikladno je imati tvar koju određena kolona ne zadržava, uzimajući je kao standard čije vrijeme zadržavanja i volumen t 0 , V o. Kromatografija tvari i standarda mora se provesti pod istim uvjetima (tlak i protok). Kada se identificiraju retencijskim podacima, poznate pojedinačne tvari koje mogu biti prisutne u uzorcima odvajaju se u istom kromatografskom sustavu i za njih se dobivaju vrijednosti t R. Uspoređujući ove vrijednosti t R s vremenom zadržavanja nepoznatog vrha, može se ustanoviti da se ili podudaraju, u kojem slučaju je vjerojatno da vrhovi odgovaraju istoj tvari, ili t R poznata tvar ne odgovara t R nepoznata zona. Tada je još uvijek moguća približna procjena vrijednosti t R tvari koje nisu dostupne za izravno mjerenje stupnja njihove retencije. Razmotrimo obje opcije.

U prvom slučaju, preliminarno istraživanje uzorka očito je potrebno kako bi se pretpostavila prisutnost specifičnih tvari u njemu. Pri radu s jednostavnim smjesama nije teško utvrditi podudara li se stupanj zadržavanja zona uzorka i poznatih tvari ili ne, tj. vrijednosti tB isti ili različiti. U slučaju složenih smjesa, nekoliko tvari može eluirati sa sličnim vrijednostima t R, a zone stvarno dobivene tijekom kromatografske separacije preklapaju se. Kao rezultat, dobivanje točnih vrijednosti t R postaje nemoguće za različite zone. Pouzdanost identifikacije povećava se povećanjem razlučivosti, pažljivijom kontrolom uvjeta odvajanja i ponovnim mjerenjem vrijednosti t R i usrednjavanje pronađenih vrijednosti. U tom slučaju, kromatografsko odvajanje poznatih i nepoznatih tvari mora se izmjenjivati. Pri razdvajanju složenih smjesa vrijednost t R tvari se mogu promijeniti pod utjecajem matrice samog uzorka. Ovaj je učinak moguć na početku kromatograma i kada se vrhovi preklapaju; Također je moguće zategnuti zone, kao što je već spomenuto.

U takvim slučajevima, standard treba dodati uzorku u omjeru 1: 1. Ako su tvari identične, vrijednost t R početni materijal se ne mijenja, au kromatogramu se dobije samo jedan vrh. Ako imate uređaj sa sustavom cikličke kromatografije, tada je za pouzdanu identifikaciju preporučljivo provući smjesu kroz kolonu nekoliko puta.

Podaci o stopama zadržavanja također se mogu pronaći u literaturi, ali je vrijednost tih podataka ograničena. Budući da stupci čak i iz iste serije daju lošu ponovljivost, literaturne vrijednosti ne odgovaraju uvijek pravim vrijednostima t R na ovom stupcu. Za adsorpcijsku kromatografiju, međutim, moguće je predvidjeti t R na temelju literaturnih podataka. Još jedna poteškoća povezana s upotrebom književnih značenja t R, - poteškoće u pronalaženju u stručnoj literaturi, iako bibliografski pregledi objavljeni u Journal of chromatography imaju ažurirani indeks prema vrsti tvari.

U drugom slučaju, kada se vremena zadržavanja poznatih spojeva i zona uzorka ne poklapaju, moguće je predvidjeti vrijeme zadržavanja nepoznate komponente. Predviđanja relativnog zadržavanja temeljena na strukturnim podacima u steričkoj ekskluzijskoj kromatografiji prilično su pouzdana. Manje su precizni u adsorpcijskoj i razdjelnoj kromatografiji, a posebno kada rade na kemijski vezanoj fazi. Za ionsku kromatografiju i kromatografiju ionskih parova tvari s poznatim p Ka Moguća su samo približna određivanja vrijednosti tR. Uvijek je lakše predvidjeti relativno zadržavanje ili *x vrijednosti nego apsolutne vrijednosti k". Relativne vrijednosti t R lakše procijeniti za srodne spojeve ili derivate, kao što su supstituirane alkilkarboksilne kiseline ili derivati ​​benzena.

Pri izokratskom odvajanju homologa ili oligomera ponekad se opaža sljedeći obrazac:

\ gk" = A + Bn,

Gdje A I U- konstante za određeni broj odabranih uzoraka i za određeni kromatografski sustav (na istoj koloni, s istom mobilnom i stacionarnom fazom); P- broj identičnih strukturnih jedinica u molekuli uzorka.

Uvođenje funkcionalne skupine / u molekulu uzorka dovest će do promjene k" u prvoj jednadžbi nekim konstantnim koeficijentom a/ u danom kromatografskom sustavu. Moguće je dobiti konstante skupine a/ za različite skupine supstituenata/, čije će vrijednosti rasti s povećanjem polariteta funkcionalnih skupina u svim vrstama kromatografije, osim reverzne faze, gdje će vrijednosti konstanti padati s povećanje polariteta.

Neke konstante skupine a/ za različite skupine supstituenata/ dane su u tablici. 9.1.

U adsorpcijskoj kromatografiji prva jednadžba nije uvijek primjenjiva, jer vrijedi pod uvjetom da svi izomeri imaju istu vrijednost k", što se ne poštuje uvijek. Međutim, moguće je iscrtati logfe" istih spojeva na jednoj koloni u odnosu na logfe" istih spojeva na drugoj koloni ili u odnosu na odgovarajuće karakteristike u tankoslojnoj kromatografiji, na primjer, log[(l- Rf) IRf].

Vrijednosti koeficijenta kapaciteta mogu se koristiti pri usporedbi podataka o zadržavanju k", jer za razliku od njega t R brzina pokretne faze i geometrijske značajke stupca ne utječu.

Odvajanja kemijski vezanih faza slična su odvajanjima razdjelnom kromatografijom sa sličnim fazama, pa se stoga podaci o ekstrakciji u stabilnom stanju mogu koristiti za predviđanje vremena zadržavanja.

U kromatografiji ionske izmjene tri čimbenika utječu na stupanj retencije: stupanj ionizacije kiselina i baza, naboj ionizirane molekule i sposobnost tvari iz vodene pokretne faze koja se koristi u kromatografiji ionske izmjene da migrira u organsku. faza. Potonji ovisi o molekulskoj težini spoja i njegovoj hidrofobnosti. Stoga se jače kiseline ili baze jače zadržavaju tijekom odvajanja anionskom ili kationskom izmjenom. Prilikom smanjenja pK a pojedine kiseline uključene u uzorak povećava se zadržavanje kada se anionskom izmjenom odvaja veći broj kiselina, a s porastom p/C o raste zadržavanje baza kada se odvajaju zbog kationske izmjene.

Dakle, podudarnost vremena zadržavanja poznate tvari s promatranom omogućuje pretpostavku njihovog identiteta. Pouzdanost identifikacije se povećava ako se kromatogrami poznate tvari i nepoznate komponente uspoređuju pod različitim uvjetima. Ako se tvari ponašaju identično u adsorpciji i reverznoj fazi ili ionskoj izmjeni i kromatografiji isključenja veličine, povećava se pouzdanost identifikacije. Ako je pouzdanost identifikacije s jednakim relativnim zadržavanjem 90%, tada je pri proučavanju ponašanja istih tvari u značajno različitim uvjetima pouzdanost identifikacije već 99%.

Vrijedna karakteristika tvari koja se koristi u identifikaciji je omjer signala dobivenih za određenu tvar na dva različita detektora. Analizirana tvar nakon izlaska iz kolone prolazi najprije kroz prvi detektor, zatim kroz drugi, a signali koji dolaze iz detektora snimaju se istovremeno pomoću višeperka ili na dva snimača. Obično se koristi serijski spoj ultraljubičastog detektora (osjetljivijeg, ali selektivnog) s refraktometrom, ili ultraljubičastog s fluorescentnim detektorom, ili dva ultraljubičasta detektora koji rade na različitim valnim duljinama. Relativni odziv, tj. omjer signala refraktometra i signala fotometra, karakteristika je tvari, pod uvjetom da oba detektora rade u svom linearnom rasponu; to se ispituje davanjem različitih količina iste tvari. Kvalitativne informacije mogu se dobiti radom s fotometrijskim detektorima opremljenim uređajem za zaustavljanje protoka koji omogućuje snimanje spektra vrha koji izlazi iz kolone dok je u protočnoj ćeliji, uspoređujući ga sa spektrom poznatog spoja.

Moderni, još uvijek skupi, spektrofotometri s nizom dioda od velikog su interesa za identifikaciju.

Potpuno nepoznata tvar ne može se identificirati samo pomoću tekućinske kromatografije visoke učinkovitosti; potrebne su i druge metode.

KVANTITATIVNA ANALIZA

Kvantitativna tekućinska kromatografija je dobro razvijena analitička metoda koja nije inferiorna u točnosti od kvantitativne plinske kromatografije i značajno premašuje točnost TLC ili elektroforeze. Nažalost, u HPLC ne postoji detektor koji bi imao blisku osjetljivost za spojeve različitih kemijskih struktura ( poput katarometra u GLC) Stoga je za dobivanje kvantitativnih rezultata obavezna kalibracija uređaja.

Kvantitativna analiza sastoji se od sljedećih faza: 1) kromatografsko odvajanje; 2) mjerenje vrhova ili visina; 3) izračun kvantitativnog sastava smjese na temelju kromatografskih podataka; 4) interpretacija dobivenih rezultata, odnosno statistička obrada. Razmotrimo sve ove faze.

4.1. KROMATOGRAFSKO RAZDVAJANJE

Tijekom prikupljanja uzorka mogu se napraviti pogreške. Posebno je važno izbjeći pogreške i dobiti odgovarajući reprezentativni uzorak heterogenih krutih tvari, hlapljivih ili nestabilnih tvari te poljoprivrednih proizvoda i biomaterijala. Heterogeni uzorci, na primjer prehrambeni proizvodi, temeljito se promiješaju i isjeckaju na četvrtine. Izvođenjem ove operacije mnogo puta postiže se homogenost uzorka.

Pogreške i gubici tvari mogu se napraviti u fazi ekstrakcije, izolacije, pročišćavanja itd.

Uzorci moraju biti potpuno otopljeni, a njihove otopine pripremljene s točnošću od ±0,1%. Preporučljivo je uzorak otopiti u mobilnoj fazi, čime se eliminira mogućnost njegovog taloženja nakon unošenja u kromatograf. Ako otapanje u mobilnoj fazi nije moguće, treba upotrijebiti otapalo koje se s njim miješa i volumene uzorka (manje od 25 µl) treba unijeti u kromatograf.

Značajne pogreške mogu se pojaviti tijekom ubrizgavanja uzorka zbog frakcioniranja uzorka, curenja i razmazivanja vrha. Zamućenje vrhova uzrokuje stvaranje repova, što dovodi do djelomičnog preklapanja vrhova i, kao posljedicu, do pogrešaka u detekciji. Ventili s petljom poželjniji su od štrcaljki za uvođenje uzorka u kvantitativnu analizu zbog veće točnosti i manje ovisnosti o operateru.

Kod kromatografskog odvajanja tvari također mogu nastati komplikacije koje dovode do iskrivljenja podataka: kvantitativna analiza. Može doći do razgradnje ili pretvorbe uzorka tijekom kromatografskog procesa ili nepovratne adsorpcije tvari na stupac. Važno je osigurati odsutnost ovih nepoželjnih pojava i, ako je potrebno, regenerirati stupac ili ga zamijeniti. Preklapanje vrhova i zaostajanje također se mogu smanjiti mijenjanjem kromatografskih uvjeta.

Vrhovi s lažnim ili nejasnim oblicima, kao i vrhovi čije je vrijeme oslobađanja blizu do, budući da njihovo razdvajanje možda neće biti dovoljno. Tipično se koriste pikovi s vrijednošću d"^0,5. Najveća učinkovitost kolone postiže se uvođenjem 10~ 5 -10~ 6 g otopljene tvari na 1 g sorbenta. Kod unošenja velikih količina uzorka, ovisnost o vršna visina opterećenja može se pokazati nelinearnom i potrebna je kvantitativna procjena po vršnim površinama.

Pogreške povezane s detekcijom ili pojačavanjem dovode do značajnog izobličenja rezultata kromatografskog odvajanja. Svaki detektor karakterizira specifičnost, linearnost i osjetljivost. Ispitivanje selektivnosti posebno je važno pri analizi nečistoća u tragovima. Odziv UV detektora može varirati faktorom 104 prema tvarima sa sličnim funkcionalnim skupinama. Potrebno je kalibrirati odziv detektora za svaki analit. Naravno, tvari koje ne apsorbiraju u UV području neće dati signal snimaču kada se koristi kao fotometarski detektor. Pri korištenju refraktometra mogu se pojaviti negativni vrhovi. Osim toga, ovaj detektor mora biti termostatiran, što nije potrebno za UV detektor.

Linearnost detektora određuje veličinu ubrizganog uzorka. Važno je zapamtiti da brzina protoka kolone, temperatura kolone i detektora te dizajn detektora utječu na točnost kvantitativne analize. Pogreške u prijenosu električnog signala do izlaznog uređaja (snimača), integratora ili računala mogu nastati zbog indukcije šuma, nedostatka uzemljenja, fluktuacija napona u mreži itd.

4.2. MJERENJE POVRŠINE VRHA ILI VISINE

Visina vrha h (Sl. 10.1) udaljenost je od vrha vrha do osnovne crte; mjeri se linearno ili brojanjem broja podjela na pisaču. Neki elektronički integratori i računala daju informacije o vršnim visinama. Položaj osnovne linije pomaknutih vrhova nalazi se interpolacijom ordinatnih vrijednosti koje odgovaraju početku i kraju vrha (vrh 1. i 3 vidi sl. 10.1). Kako bi se poboljšala točnost, potrebno je imati ravnu, stabilnu osnovnu liniju. U slučaju nepodijeljenih vrhova, osnovna crta je nacrtana između početka i kraja vrha umjesto zamijenjena nultom linijom. Budući da visine vrhova manje ovise o utjecaju susjednih vrhova koji se preklapaju, procjena visine vrha je točnija i gotovo se uvijek koristi u analizi tragova tragova.

Područje vrha može se odrediti na različite načine. Pogledajmo neke od njih.

1. Planimetrijska metoda uključuje praćenje vrha s ručnim planimetrom, koji je uređaj koji mehanički određuje područje vrha. Metoda je točna, ali je zahtjevna i slabo ponovljiva. Ova metoda se ne preporučuje.

2. Metoda papirne siluete - vrh se izrezuje i važe. Metoda je vrlo ponovljiva, ali je radno intenzivna, a kromatogram se uništava. Njegova primjenjivost ovisi o ujednačenosti trake grafikona. Metoda se također ne može široko preporučiti.

4. Metoda triangulacije sastoji se od konstruiranja trokuta povlačenjem tangenti na stranice vrha. Vrh trokuta viši je od vrha vrha. Povećanje površine koju tvori ovaj prošireni vrh bit će dosljedno kroz cijeli kromatogram i neće značajno utjecati na točnost. Osim toga, neka površina izgubljena prilikom crtanja tangenti bit će nadoknađena. Osnovica trokuta određena je sjecištem tangenti s osnovkom, a površina je određena umnoškom 7 g osnovke i visine. Ova metoda je najbolja za određivanje površina asimetričnih vrhova. Međutim, ponovljivost kod konstruiranja tangenti različitim operatorima je različita i stoga; nizak.

5. Metoda disk integratora temelji se na elektromehaničkom uređaju spojenom na snimač. Olovka pričvršćena na integrator kreće se duž trake na dnu vrpce brzinom proporcionalnom kretanju olovke za snimanje.

Kao i kod ručnih mjerenja, vršna vrijednost bi trebala ostati na ljestvici snimača, ali prilagodbe za kompenzaciju pomaka osnovne linije i nepotpunog odvajanja susjednih vršnih vrijednosti smanjuju pouzdanost i povećavaju vrijeme analize.

Metoda je preciznija od metoda ručnog mjerenja, posebno za asimetrične vrhove, i nudi prednost u brzini. Osim toga, osigurava trajni kvantitativni zapis analize.

6. Metode koje koriste elektroničke integratore koji određuju područje vrha i ispisuju informacije o tom području i vremenima zadržavanja mogu uključivati ​​korekciju pomaka osnovne linije i odrediti područje samo djelomično razriješenih vrhova. Glavne prednosti su točnost, brzina, neovisnost djelovanja od rada snimača. Integratori imaju memoriju i mogu se programirati za određenu analizu pomoću unaprijed instaliranog programa. Prednosti integratora uključuju njegovu sposobnost korištenja faktora korekcije za odziv detektora pri ponovnom izračunavanju izvornih podataka o područjima vrhova, kompenzirajući razlike u osjetljivosti detektora na različite tvari. Takvi sustavi štede vrijeme, poboljšavaju analitičku točnost i korisni su za rutinsku analitičku analizu.

7. U tekućinskoj kromatografiji računala se naširoko koriste za mjerenje površina vrhova. Oni ispisuju potpunu poruku, uključujući nazive tvari, vršne površine, vremena zadržavanja, korekcijske faktore odgovora detektora i obilje (težinski %) za različite komponente uzorka.

OPĆI FARMAKOPEJSKI ČLANAK

Umjesto čl. GF XI

Tekućinska kromatografija visoke učinkovitosti (visokotlačna tekućinska kromatografija) je metoda kolonske kromatografije u kojoj je mobilna faza tekućina koja se kreće kroz kromatografsku kolonu ispunjenu stacionarnom fazom (sorbentom). Kolone za tekućinsku kromatografiju visoke učinkovitosti odlikuju se visokim hidrauličkim otporom na ulazu.

Ovisno o mehanizmu odvajanja tvari, razlikuju se sljedeće varijante tekućinske kromatografije visoke učinkovitosti: adsorpcijska, particiona, ionska izmjena, isključivanje, kiralna itd. U skladu s prirodom glavnih međumolekulskih interakcija koje se javljaju. U adsorpcijskoj kromatografiji do razdvajanja tvari dolazi zbog njihove različite sposobnosti da se adsorbiraju i desorbiraju s površine sorbensa s razvijenom površinom, na primjer silika gela. U razdjelnoj tekućinskoj kromatografiji visoke učinkovitosti, odvajanje se događa zbog razlike u koeficijentima raspodjele tvari koje se odvajaju između stacionarne faze (obično kemijski cijepljene na površinu stacionarnog nosača) i mobilne faze.

Ovisno o vrsti mobilne i stacionarne faze, razlikuju se normalnofazna i reverznofazna kromatografija. U normalnofaznoj tekućinskoj kromatografiji visoke djelotvornosti stacionarna faza je polarna (najčešće silikagel ili silikagel s cijepljenim NH 2 ili CN skupinama itd.), a mobilna faza je nepolarna (heksan ili smjese heksana s polarnijim organskim otapalima - kloroformom, alkoholima itd.). Zadržavanje tvari raste s povećanjem polariteta. U kromatografiji s normalnom fazom, sposobnost eluiranja mobilne faze raste s povećanjem polariteta.

U reverzno-faznoj kromatografiji stacionarna faza je nepolarna (hidrofobni silika gel s cijepljenim skupinama C4, C8, C18 itd.); pokretna faza – polarna (mješavine vode i polarnih otapala: acetonitril, metanol, tetrahidrofuran i dr.). Zadržavanje tvari povećava se povećanjem hidrofobnosti (nepolarnosti). Što je veći sadržaj organskog otapala, to je veća sposobnost eluiranja mobilne faze.

U kromatografiji ionske izmjene molekule smjese tvari, disocirane u otopini na katione i anione, razdvajaju se pri kretanju kroz sorbent (kationski izmjenjivač ili anionski izmjenjivač) zbog različite snage međudjelovanja određenih iona s ionskim skupinama. sorbensa.

U kromatografiji s isključenjem veličine (sita, gel permeacija, gel filtracija) molekule tvari se odvajaju po veličini zbog njihove različite sposobnosti prodiranja u pore stacionarne faze. U ovom slučaju, najveće molekule koje mogu prodrijeti u minimalni broj pora stacionarne faze prve napuštaju stupac, a tvari s malim molekulskim veličinama posljednje napuštaju.

Kiralna kromatografija razdvaja optički aktivne spojeve u pojedinačne enantiomere. Razdvajanje se može izvesti na kiralnim stacionarnim fazama ili na akiralnim stacionarnim fazama korištenjem kiralnih mobilnih faza.

Postoje i druge opcije za tekućinsku kromatografiju visoke učinkovitosti.

često se razdvajanje ne događa jednim, već više mehanizama istovremeno, ovisno o vrsti mobilne i stacionarne faze, kao i prirodi spoja koji se određuje.

Područje primjene

Tekućinska kromatografija visoke učinkovitosti uspješno se koristi i za kvalitativnu i za kvantitativnu analizu lijekovi u testovima „Autentičnost“, „Strane nečistoće“, „Otapanje“, „Ujednačenost doziranja“, „Kvantitativno određivanje“. Treba napomenuti da vam kromatografija omogućuje kombiniranje nekoliko testova u jednom uzorku, uključujući "Autentičnost" i "Kvantitativno određivanje".

Oprema

Za provođenje analize koriste se odgovarajući instrumenti - tekućinski kromatografi.

Tekućinski kromatograf obično uključuje sljedeće glavne komponente:

— jedinica za pripremu mobilne faze, uključujući spremnik s mobilnom fazom (ili spremnike s pojedinačnim otapalima uključenim u mobilnu fazu) i sustav za otplinjavanje mobilne faze;

— crpni sustav;

— miješalica mobilne faze (ako je potrebno);

— sustav za uvođenje uzorka (injektor), može biti ručni ili automatski (autouzorkivač);

— kromatografska kolona (može se ugraditi u termostat);

- detektor (jedan ili više sa različiti putevi otkrivanje);

— sustav kontrole kromatografa, prikupljanje i obrada podataka.

Osim toga, kromatograf može uključivati: sustav za pripremu uzorka i reaktor pred kolonom, sustav za promjenu kolone, reaktor nakon kolone i drugu opremu.

Pumpni sustav

Pumpe dovode mobilnu fazu u kolonu zadanom brzinom. Sastav mobilne faze i brzina protoka mogu biti konstantni ili varirati tijekom analize. U slučaju konstantnog sastava mobilne faze, proces se naziva izokratski, au drugom - gradijent. Suvremeni crpni sustav tekućinskog kromatografa sastoji se od jedne ili više kompjuterski upravljanih pumpi. To vam omogućuje promjenu sastava mobilne faze prema specifičnom programu tijekom gradijentnog eluiranja. Pumpe za analitičku tekućinsku kromatografiju visoke učinkovitosti omogućuju vam održavanje brzine protoka mobilne faze u kolonu u rasponu od 0,1 do 10 ml/min pri tlaku na ulazu u kolonu do 40 MPa. Pulsacije tlaka minimalizirane su posebnim sustavima prigušnica uključenim u dizajn crpki. Radni dijelovi crpki izrađeni su od materijala otpornih na koroziju, što omogućuje korištenje agresivnih komponenti u mobilnoj fazi.

Slavine

U mješaču se iz pojedinačnih otapala dovedenih pumpama stvara jedna mobilna faza, ako potrebna smjesa nije unaprijed pripremljena. Miješanje komponenti mobilne faze u miješalici može se dogoditi i pri niskom tlaku (prije pumpi) i pri visokom tlaku (poslije pumpi). Mikser se može koristiti za pripremu mobilne faze i izokratsko eluiranje.

Volumen miješalice može utjecati na vrijeme zadržavanja komponenti tijekom gradijentnog eluiranja.

Injektori

Injektori mogu biti univerzalni, s mogućnošću promjene volumena ubrizganog uzorka ili diskretni za ubrizgavanje samo određenog volumena uzorka. Oba tipa injektora mogu biti automatski ("autoinjectors" ili "autosamplers"). Injektor za uvođenje uzorka (otopine) nalazi se neposredno ispred kromatografske kolone. Dizajn injektora omogućuje promjenu smjera protoka mobilne faze i preliminarno uvođenje uzorka u petlju za doziranje određenog volumena (obično od 10 do 100 μl) ili u poseban uređaj za doziranje promjenjivog volumena. . Volumen petlje je naznačen na njegovoj oznaci. Dizajn diskretnog injektora obično omogućuje zamjenu petlje. Moderni automatski injektori mogu imati niz dodatnih funkcija, na primjer, obavljati funkciju stanice za pripremu uzorka: miješati i razrijediti uzorke, provesti reakciju derivatizacije prije kolone.

Kromatografska kolona

Kromatografske kolone obično su cijevi izrađene od nehrđajućeg čelika, stakla ili plastike, ispunjene sorbentom i obostrano zatvorene filtrima promjera pora od 2-5 µm. Duljina analitičke kolone može biti u rasponu od 5 do 60 cm ili više, unutarnji promjer može biti od 2 do 10 mm. U mikrokolonskoj kromatografiji koriste se kolone s unutarnjim promjerom manjim od 2 mm. Postoje i kapilarni stupci s unutarnjim promjerom od oko 0,3–0,7 mm. Kolone za preparativnu kromatografiju mogu imati unutarnji promjer od 50 mm ili više.

Kratki stupovi (predkolone) mogu se postaviti ispred analitičkog stupca za obavljanje raznih pomoćnih funkcija, od kojih je glavna zaštita analitičkog stupca. Obično se analiza provodi na sobnoj temperaturi, ali za povećanje učinkovitosti odvajanja i smanjenje vremena analize, termostatiranje kolone može se koristiti na temperaturama do 80 - 100 °C. Mogućnost korištenja povišenih temperatura tijekom separacije ograničena je stabilnošću stacionarne faze, jer je na povišenim temperaturama moguća njezina destrukcija.

Stacionarna faza (sorbent)

Kao sorbenti obično se koriste:

• silika gel, aluminijev oksid, koji se koristi u kromatografiji normalne faze. Mehanizam zadržavanja u ovom slučaju obično je adsorpcija;
• silika gel, smole ili polimeri cijepljeni s kiselim ili bazičnim skupinama. Područje primjene – ionska izmjena i ionska kromatografija;
• silikagel ili polimeri s određenom raspodjelom veličine pora (kromatografija isključenja veličine);
• kemijski modificirani sorbenti (sorbenti s cijepljenim fazama), najčešće pripremljeni na bazi silika gela. Mehanizam zadržavanja je adsorpcija ili distribucija između mobilne i stacionarne faze. Opseg primjene ovisi o vrsti cijepljene funkcionalne skupine. Neke vrste sorbenata mogu se koristiti i u kromatografiji reverzne i normalne faze;
• kemijski modificirani kiralni sorbenti, na primjer, derivati ​​celuloze i amiloze, proteini i peptidi, ciklodekstrini, kitozani, koji se koriste za odvajanje enantiomera (kiralna kromatografija).

Sorbenti s cijepljenim fazama mogu imati različite stupnjeve kemijske modifikacije. Najčešće korištene kalemljene faze su:

– oktadecilne skupine (sorbent oktadecilsilan (ODS) ili C 18);

– oktilne skupine (sorbent oktilsilan ili C 8);

– fenilne skupine (sorbent fenilsilan);

– cijanopropilne skupine (CN sorbent);

– aminopropilne skupine (sorbent NH 2);

– diolne skupine (sorbent diol).

Najčešće se analiza provodi na nepolarnim cijepljenim fazama u reverzno-faznom modu pomoću sorbenta C 18.

Sorbenti s cijepljenim fazama dobiveni na bazi silika gela kemijski su stabilni pri pH vrijednostima od 2,0 do 7,0, osim ako proizvođač nije drugačije naveo. Čestice sorbenta mogu imati sferni ili nepravilni oblik i različitu poroznost. Veličina čestica sorbenta u analitičkoj tekućinskoj kromatografiji visoke učinkovitosti obično je 3-10 µm, u preparativnoj tekućinskoj kromatografiji visoke učinkovitosti - 50 µm ili više. Postoje i monolitne kolone u kojima je sorbens monolit s prolaznim porama koji ispunjava cijeli volumen kolone.

Visoka učinkovitost odvajanja osigurana je velikom površinom čestica sorbenta (što je posljedica njihove mikroskopske veličine i prisutnosti pora), kao i ujednačenim sastavom sorbenta te njegovim gustim i jednoličnim pakiranjem.

Detektori

Tekućinska kromatografija visoke učinkovitosti koristi različite metode detekcije. U općem slučaju, mobilna faza s komponentama otopljenim u njoj nakon kromatografske kolone ulazi u detektorsku ćeliju, gdje se kontinuirano mjere jedna ili druga njena svojstva (apsorpcija u ultraljubičastom ili vidljivom području spektra, fluorescencija, indeks loma, električni vodljivost, itd.). Rezultirajući kromatogram je graf ovisnosti nekog fizikalnog ili fizikalno-kemijskog parametra mobilne faze o vremenu.

Najčešći detektori u tekućinskoj kromatografiji visoke učinkovitosti su spektrofotometrijski. Tijekom eluiranja tvari, optička gustoća eluata mjeri se u posebno dizajniranoj mikrokiveti na unaprijed odabranoj valnoj duljini. Širok raspon linearnosti detektora omogućuje analizu i nečistoća i glavnih komponenti smjese u jednom kromatogramu. Spektrofotometrijski detektor omogućuje detekciju na bilo kojoj valnoj duljini u svom radnom području (obično 190-600 nm). Također se koriste viševalni detektori, koji omogućuju detekciju na nekoliko valnih duljina istovremeno, i detektori s nizom dioda, koji omogućuju istovremeno bilježenje optičke gustoće u cijelom radnom rasponu valnih duljina (obično 190-950 nm). To omogućuje snimanje apsorpcijskih spektara komponenti koje prolaze kroz ćeliju detektora.

Fluorimetrijski detektor koristi se za određivanje fluorescentnih spojeva ili nefluorescentnih spojeva u obliku njihovih fluorescentnih derivata. Princip rada fluorimetrijskog detektora temelji se na mjerenju fluorescentne emisije apsorbirane svjetlosti. Apsorpcija se obično provodi u ultraljubičastom području spektra, pri čemu su valne duljine fluorescentnog zračenja veće od valnih duljina apsorbirane svjetlosti. Fluorimetrijski detektori imaju vrlo visoku osjetljivost i selektivnost. Osjetljivost fluorescentnih detektora je otprilike 1000 puta veća od osjetljivosti spektrofotometrijskih. Suvremeni fluorescentni detektori omogućuju ne samo dobivanje kromatograma, već i snimanje ekscitacijskih i fluorescentnih spektara analiziranih spojeva.

Za određivanje spojeva koji slabo apsorbiraju u ultraljubičastom i vidljivom području spektra (na primjer, ugljikohidrati), koristite refraktometrijski detektori (refraktometri). Nedostaci ovih detektora su niska (u usporedbi sa spektrofotometrijskim detektorima) osjetljivost i značajna temperaturna ovisnost intenziteta signala (detektor mora biti termostatiran), kao i nemogućnost korištenja u gradijentnom načinu eluiranja.

Princip rada evaporativni detektori raspršenja laserskog svjetla temelji se na razlici u tlaku pare kromatografskih otapala uključenih u mobilnu fazu i analiziranih tvari. Mobilna faza na izlazu iz kolone uvodi se u raspršivač, miješa se s dušikom ili CO 2 i u obliku finog aerosola ulazi u zagrijanu cijev za isparavanje s temperaturom 30–160 °C, u kojoj se mobilni faza isparava. Aerosol nehlapljivih čestica analiziranih tvari raspršuje svjetlosni tok u disperzijskoj komori. Po stupnju disperzije svjetlosnog toka može se procijeniti količina spoja koji se određuje. Detektor je osjetljiviji od refraktometrijskog, njegov signal ne ovisi o optičkim svojstvima uzorka, o vrsti funkcionalnih skupina u tvarima koje se određuju, o sastavu mobilne faze i može se koristiti u gradijentu. način eluiranja.

Elektrokemijski detektori (konduktometrijski, amperometrijski, kulometrijski itd.). Amperometrijski detektor koristi se za otkrivanje elektroaktivnih spojeva koji se mogu oksidirati ili reducirati na površini čvrste elektrode. Analitički signal je veličina struje oksidacije ili redukcije. Detektorska ćelija ima najmanje dvije elektrode - radnu elektrodu i referentnu elektrodu (srebrokloridna ili čelična). Na elektrode se primjenjuje radni potencijal čija vrijednost ovisi o prirodi spojeva koji se određuju. Mjerenja se mogu provoditi i pri konstantnom potencijalu iu pulsirajućem načinu rada, kada se profil promjena potencijala radne elektrode postavlja tijekom jednog ciklusa snimanja signala. Amperometrijski detektor koristi radne elektrode od karbonskih materijala (najčešće staklasti ugljik ili grafit) i metalnih: platine, zlata, bakra, nikla.

Konduktometrijski detektor koristi se za detekciju aniona i kationa u ionskoj kromatografiji. Načelo njegovog rada temelji se na mjerenju električne vodljivosti mobilne faze tijekom eluiranja tvari.

Maseni spektrometrijski detektor, koji ima visoku osjetljivost i selektivnost, izuzetno je informativan. Najnoviji modeli masenih spektrometara tekućinske kromatografije rade u rasponu mase m/z od 20 do 4000 amu.

U tekućinskoj kromatografiji visoke učinkovitosti također se koriste Fourier-IR detektori, radioaktivnost i neki drugi.

Sustav prikupljanja i obrade podataka

Suvremeni sustav za obradu podataka je osobno računalo povezano s kromatografom s instaliranim softverom koji vam omogućuje snimanje i obradu kromatograma, kao i kontrolu rada kromatografa i praćenje glavnih parametara kromatografskog sustava.

Mobilna faza

Mobilna faza u tekućinskoj kromatografiji visoke učinkovitosti ima dvostruku funkciju: osigurava transport desorbiranih molekula duž kolone i regulira konstante ravnoteže, a time i zadržavanje kao rezultat interakcije sa stacionarnom fazom (sorbiranom na površini) a s molekulama tvari koje se odvajaju. Dakle, promjenom sastava mobilne faze u tekućinskoj kromatografiji visoke učinkovitosti moguće je utjecati na retencijska vremena spojeva, selektivnost i učinkovitost njihova odvajanja.

Mobilna faza može se sastojati od jednog otapala, često dva, a po potrebi i tri ili više. Sastav mobilne faze je naznačen kao volumni omjer njenih sastavnih otapala. U nekim slučajevima može se navesti omjer mase, koji mora biti posebno naveden. Kao komponente mobilne faze mogu se koristiti puferske otopine određene pH vrijednosti, razne soli, kiseline i baze te drugi modifikatori.

Normalnofazna kromatografija obično koristi tekuće ugljikovodike (heksan, cikloheksan, heptan) i druga relativno nepolarna otapala s malim dodacima polarnih organskih spojeva koji reguliraju snagu eluiranja mobilne faze.

U reverzno faznoj kromatografiji kao mobilna faza koriste se voda ili vodeno-organske smjese. Organski aditivi su obično polarna organska otapala (acetonitril i metanol). Za optimizaciju odvajanja mogu se koristiti vodene otopine s određenom pH vrijednošću, posebice puferske otopine, kao i različiti dodaci mobilnoj fazi: fosforna i octena kiselina pri odvajanju kiselih spojeva; amonijak i alifatski amini pri odvajanju bazičnih spojeva, te drugi modifikatori.

Na kromatografsku analizu uvelike utječe čistoća mobilne faze, stoga je poželjno koristiti otapala proizvedena posebno za tekućinsku kromatografiju (uključujući vodu).

Kada se koristi UV spektrofotometrijski detektor, mobilna faza ne bi trebala imati značajnu apsorpciju na valnoj duljini odabranoj za detekciju. Granica prozirnosti ili optička gustoća na određenoj valnoj duljini pojedinog proizvođača otapala često je naznačena na ambalaži.

Mobilna faza i analizirane otopine ne smiju sadržavati neotopljene čestice i mjehuriće plina. Voda dobivena u laboratorijskim uvjetima, vodene otopine, organska otapala prethodno pomiješana s vodom, kao i analizirane otopine moraju se podvrgnuti finoj filtraciji i otplinjavanju. U ove svrhe obično se koristi vakuumska filtracija kroz membranski filtar s veličinom pora od 0,45 μm, inertan u odnosu na određeno otapalo ili otopinu.

Popis kromatografskih uvjeta koje treba specificirati

Farmakopejska monografija mora sadržavati: puni komercijalni naziv kolone s naznakom proizvođača i kataloški broj, dimenzije kolone (duljina i unutarnji promjer), vrstu sorbensa s naznakom veličine čestica, veličinu pora, temperaturu kolone (ako se radi o termostatiranju). potrebno), volumen ubrizganog uzorka (volumenske petlje), sastav mobilne faze i način njezine pripreme, brzina punjenja mobilne faze, vrsta detektora i uvjeti detekcije (ako je potrebno, parametri korištene ćelije detektora), opis načina gradijenta (ako se koristi), uključujući fazu reekvilibracije na početne uvjete, vrijeme kromatografije, detaljan opis metode izračuna i formule, opis pripreme standardnih i ispitnih otopina.

Ako se derivatizacija prije stupca koristi u automatskom uzorkivaču, pružaju se informacije o programu za automatsko uzorkovanje. Ako se koristi derivatizacija nakon kolone, naznačena je brzina dodavanja derivatizirajućeg reagensa, volumen petlje za miješanje i njezina temperatura.

Modificirani tipovi tekućinske kromatografije visoke učinkovitosti

Kromatografija ionskih parova

Jedna od varijanti reverzno-fazne tekućinske kromatografije visoke učinkovitosti je kromatografija ionskih parova, koja omogućuje određivanje ioniziranih spojeva. U tu svrhu tradicionalnoj mobilnoj fazi tekućinske kromatografije visoke učinkovitosti reverzne faze dodaju se hidrofobne tvari. organski spojevi s ionogenim skupinama (reagensi ionskih parova). Za odvajanje baza obično se koriste natrijevi alkil sulfati, a za odvajanje kiselina tetraalkilamonijeve soli (tetrabutilamonijev fosfat, cetiltrimetilamonijev bromid itd.). U načinu rada ionskih parova, selektivnost odvajanja neionskih komponenti bit će ograničena mehanizmom zadržavanja reverzne faze, a zadržavanje baza i kiselina će se značajno povećati, dok će se oblik kromatografskih vrhova poboljšati.

Zadržavanje u načinu rada ionskog para je zbog prilično složenih ravnotežnih procesa koji se međusobno natječu. S jedne strane, zbog hidrofobnih interakcija i efekta istiskivanja polarnog okoliša mobilne faze, moguća je sorpcija hidrofobnih iona na površini alkilsilika gela na način da su nabijene skupine okrenute prema mobilnoj fazi. U tom slučaju površina dobiva svojstva ionske izmjene, a zadržavanje se pokorava zakonima kromatografije ionske izmjene. S druge strane, moguće je formirati ionski par izravno u volumenu eluensa, nakon čega slijedi njegova sorpcija na sorbent prema mehanizmu reverzne faze.

Kromatografija hidrofilne interakcije ( HILIĆ kromatografija)

Hidrofilna interakcijska kromatografija koristi se za odvajanje polarnih spojeva koji se slabo zadržavaju u tekućinskoj kromatografiji visoke učinkovitosti s reverznom fazom. U ovoj inačici kromatografije kao mobilna faza koriste se smjese vode i acetonitrila s dodatkom soli, kiselina ili baza. Stacionarne faze, u pravilu, su silika geli modificirani polarnim skupinama (amino, diol, cijanopropilne skupine, itd.). Polarniji spojevi se jače drže. Sposobnost eluiranja mobilne faze raste s povećanjem polariteta.

Ionska izmjena i ionska tekućinska kromatografija visoke učinkovitosti

Kromatografija ionske izmjene koristi se za analizu organskih (heterocikličke baze, aminokiseline, proteini itd.) i anorganskih (razni kationi i anioni) spojeva. Razdvajanje komponenata analizirane smjese u ionsko-izmjenjivačkoj kromatografiji temelji se na reverzibilnoj interakciji iona analiziranih tvari s ionsko-izmjenjivačkim skupinama sorbensa. Ovi sorbenti su uglavnom polimerne ionsko-izmjenjivačke smole (obično kopolimeri stirena i divinilbenzena s cijepljenim ionsko-izmjenjivačkim skupinama) ili silika gelovi s cijepljenim ionsko-izmjenjivačkim skupinama. Za odvajanje aniona (anionskih izmjenjivača) koriste se sorbenti sa skupinama: -NH 3 +, -R 3 N +, -R 2 HN +, -RH 2 N + itd., a za odvajanje aniona (anionski izmjenjivači) sorbenti sa skupinama: -SO 3 –, - RSO 3 – , –COOH, -PO 3 – i drugi za odvajanje kationa (kationski izmjenjivači).

Vodene otopine kiselina, baza i soli koriste se kao pokretna faza u kromatografiji ionske izmjene. Obično se puferske otopine koriste za održavanje određenih pH vrijednosti. Također je moguće koristiti male dodatke organskih otapala koja se miješaju s vodom - acetonitril, metanol, etanol, tetrahidrofuran.

Ionska kromatografija – varijanta kromatografije ionske izmjene, u kojoj se konduktometrijski detektor koristi za detekciju spojeva (iona) koji se određuju. Za visoko osjetljivo određivanje promjena električne vodljivosti mobilne faze koja prolazi kroz detektor, pozadinska električna vodljivost mobilne faze mora biti niska.

Postoje dvije glavne varijante ionske kromatografije.

Prva od njih, dvokolonska ionska kromatografija, temelji se na supresiji električne vodljivosti elektrolita mobilne faze pomoću druge kolone za ionsku izmjenu ili posebnog membranskog supresijskog sustava koji se nalazi između analitičke kolone i detektora. Kako prolazi kroz sustav, električna vodljivost mobilne faze se smanjuje.

Druga varijanta ionske kromatografije je ionska kromatografija s jednom kolonom. Ova opcija koristi mobilnu fazu s vrlo niskom električnom vodljivošću. Kao elektroliti naširoko se koriste slabe organske kiseline: benzojeva, salicilna ili izoftalna.

Tekućinska kromatografija visoke učinkovitosti s isključivanjem veličine

Size exclusion chromatography (gel kromatografija) posebna je inačica tekućinske kromatografije visoke učinkovitosti koja se temelji na odvajanju molekula po veličini. Raspodjela molekula između stacionarne i mobilne faze temelji se na veličini molekula, a dijelom i na njihovom obliku i polaritetu.

Moguća su dva ograničavajuća tipa interakcije molekula s poroznom stacionarnom fazom. Molekule veće od maksimalnog promjera pora uopće se ne zadržavaju i prve eluiraju, krećući se istodobno s mobilnom fazom. Molekule veličine manje od minimalnog promjera pora sorbenta slobodno prodiru u pore i posljednje se eluiraju iz kolone. Preostale molekule, srednje veličine, djelomično se zadržavaju u porama i tijekom eluiranja se dijele na frakcije u skladu s njihovom veličinom i djelomično prodiru u pore sorbenta ovisno o njihovoj veličini, a djelomično ovisno o obliku. Kao rezultat, tvari eluiraju s različitim vremenima zadržavanja.

Ionska ekskluziona kromatografija

Mehanizam ionske ekskluzijske kromatografije temelji se na učinku uslijed kojeg se spojevi u ioniziranom obliku ne zadržavaju na sorbentu ionske izmjene, dok se spojevi u molekularnom obliku raspoređuju između stacionarne i vodene faze unutar pora sorbenta ionske izmjene. a mobilna faza migrira u prostoru između čestica sorbensa. Razdvajanje se temelji na elektrostatskom odbijanju, polarnim i hidrofobnim interakcijama između otopljenih spojeva i sorbenta.

Anionske skupine na površini sorbensa djeluju kao polupropusna "membrana" između stacionarne i mobilne faze. Negativno nabijene komponente ne dospijevaju u stacionarnu mobilnu fazu, budući da ih odbijaju slično nabijene funkcionalne skupine i eluiraju u "mrtvom" (slobodnom) volumenu kolone. Komponente u molekularnom obliku ne "odbacuju" sorbent kationske izmjene i raspoređuju se između stacionarne i mobilne faze. Razlika u stupnju zadržavanja neionskih komponenata smjese uvjetovana je kombinacijom polarnih interakcija neionskih komponenti s funkcionalnim skupinama sorbenta kationske izmjene i hidrofobnih interakcija neionskih komponenti s matricom nepolarnog sorbenta.

Kiralna kromatografija

Cilj kiralne kromatografije je odvajanje optičkih izomera. Odvajanje se provodi na kiralnim stacionarnim fazama ili na konvencionalnim akiralnim stacionarnim fazama korištenjem kiralnih mobilnih faza. Kao kiralne stacionarne faze koriste se sorbenti s modificiranom površinom, skupine ili tvari koje imaju kiralne centre (kitozani, ciklodekstrini, polisaharidi, proteini itd. (kiralni selektori). U ovom slučaju, iste faze kao u normalnoj fazi ili reverzno-fazi fazna kromatografija. Kada se koriste akiralne stacionarne faze, kako bi se osiguralo odvajanje enantiomera, kiralni modifikatori će se dodati mobilnim fazama: kiralni metalni kompleksi, neutralni kiralni ligandi, kiralni reagensi ionskih parova, itd.

Tekućinska kromatografija ultraučinkovitosti

Tekućinska kromatografija ultraučinkovitosti je varijanta tekućinske kromatografije koja je učinkovitija od klasične tekućinske kromatografije visoke učinkovitosti.

Značajka tekućinske kromatografije ultraučinkovitosti je uporaba sorbenata s veličinama čestica od 1,5 do 2 mikrona. Veličine kromatografskih stupaca obično se kreću od 50 do 150 mm u duljinu i 1 do 4 mm u promjeru. Volumen ubrizganog uzorka može biti u rasponu od 1 do 50 µl. Korištenje takvih kromatografskih kolona može značajno smanjiti vrijeme analize i povećati učinkovitost kromatografske separacije. Međutim, u ovom slučaju tlak na stupcu može doseći 80–120 MPa, potrebna učestalost prikupljanja podataka detektora može se povećati na 40–100 herca, a volumen izvan stupca kromatografskog sustava mora biti minimiziran. Oprema za kromatografiju i kolone koje se koriste u tekućinskoj kromatografiji ultraučinkovitosti posebno su prilagođene za ispunjavanje zahtjeva ove vrste kromatografije.

Oprema dizajnirana za tekućinsku kromatografiju ultraučinkovitosti također se može koristiti u klasičnoj verziji tekućinske kromatografije visoke učinkovitosti.

(uglavnom intermolekulski) na granici faza. Kao metoda analize, HPLC je dio skupine metoda koje, zbog složenosti proučavanih objekata, uključuju preliminarno razdvajanje izvorne složene smjese na relativno jednostavne. Dobivene jednostavne smjese zatim se analiziraju uobičajenim fizikalno-kemijskim metodama ili posebnim metodama razvijenim za kromatografiju.

HPLC metoda ima široku primjenu u područjima kao što su kemija, petrokemija, biologija, biotehnologija, medicina, prehrambena industrija, zaštita okoliša, farmaceutska proizvodnja i mnogim drugim.

Prema mehanizmu odvajanja analiziranih ili odvojenih tvari HPLC se dijeli na adsorpcijsku, distribucijsku, ionsku izmjenu, ekskluziju, izmjenu liganda i druge.

Treba imati na umu da u praktični rad odvajanje se često događa ne kroz jedan, već kroz nekoliko mehanizama istovremeno. Stoga, odvajanje isključivanjem može biti komplicirano adsorpcijskim učincima, adsorpcijsko odvajanje učincima distribucije i obrnuto. Štoviše, što je veća razlika između tvari u uzorku u smislu stupnja ionizacije, bazičnosti ili kiselosti, Molekularna težina, polarizabilnosti i drugih parametara, veća je vjerojatnost različitog mehanizma odvajanja za takve tvari.

HPLC normalne faze

Stacionarna faza je polarnija od mobilne faze, stoga nepolarno otapalo prevladava u eluensu:

• Heksan:izopropanol = 95:5 (za tvari niske polarnosti)
• Kloroform:metanol = 95:5 (za srednje polarne tvari)
• Kloroform:metanol = 80:20 (za visoko polarne tvari)

HPLC reverzne faze

Stacionarna faza je manje polarna od mobilne faze, tako da eluens gotovo uvijek sadrži vodu. U ovom slučaju uvijek je moguće osigurati potpuno otapanje BAS-a u mobilnoj fazi, gotovo uvijek je moguće koristiti UV detekciju, gotovo sve mobilne faze se međusobno miješaju, može se koristiti gradijentna elucija, kolona se može brzo rekonstruirati -uravnotežena, kolona se može regenerirati.

Uobičajeni eluenti za HPLC reverzne faze su:

• Acetonitril:voda
• Metanol:voda
• Izopropanol:voda

Matrice za HPLC

HPLC koristi anorganske spojeve kao matrice, kao što je silicijev oksid (silikagel) ili aluminijev oksid, ili organske polimere, kao što je polistiren (umreženo s divinilbenzenom) ili polimetakrilat. Silikagel je, naravno, sada općeprihvaćen.

Glavne karakteristike matrice:

• Veličina čestica (µm);
• Veličina unutarnje pore (Å, nm).

Priprema silika gela za HPLC:

1. Oblikovanje mikrosfera polisilicijeve kiseline;
2. Sušenje čestica silikagela;
3. Odvajanje zraka.

Čestice sorbensa:

• Pravilan (kuglasti): veća otpornost na pritisak, veća cijena;
• Nesferično: manja otpornost na pritisak.

Veličina pora u HPLC-u jedan je od najvažnijih parametara. Što su pore manje, to je njihova propusnost za molekule eluiranih tvari lošija. I stoga, lošiji je sorpcijski kapacitet sorbenata. Što su pore veće, to je, prvo, manja mehanička stabilnost čestica sorbensa, i, drugo, što je manja sorpcijska površina, dakle, lošija je učinkovitost.

Cijepljenje u stacionarnoj fazi

HPLC normalne faze:

• Stacionarna faza s cijepljenjem propilnitrila (nitril);
• Stacionarna faza s propilaminskim cijepljenjem (amin).

HPLC reverzne faze:

• Stacionarna faza s cijepljenjem alkila;
• Stacionarna faza s kalemljenjem alkilsilila.

End-capping je zaštita necijepljenih područja sorbenta dodatnim cijepljenjem s "malim" molekulama. Hidrofobno zatvaranje (C1, C2): veća selektivnost, lošija močivost; hidrofilni end-capping (diol): manja selektivnost, veća sposobnost vlaženja.

Detektori za HPLC

• UV
• Diodna matrica
• Fluorescentna
• Elektrokemijski
• Refraktometrijski
• Masovno selektivno

Linkovi

Zaklada Wikimedia. 2010.

Pogledajte što je "tekućinska kromatografija visoke učinkovitosti" u drugim rječnicima:

tekuća kromatografija visokog učinka- - [A.S. Goldberg. Englesko-ruski energetski rječnik. 2006] Teme: energija općenito EN tekućinska kromatografija visoke učinkovitosti HPLC ... Vodič za tehničke prevoditelje

Pojam tekućinska kromatografija visoke učinkovitosti Pojam na engleskom jeziku tekućinska kromatografija visoke učinkovitosti Sinonimi Skraćenice HPLC, HPLC Srodni pojmovi adsorpcija, oligopeptid, proteomika, sorbent, fuleren, endoedral, kromatografija... ...

Tekućinska kromatografija, u kojoj se, radi povećanja učinkovitosti odvajanja, otapalo (eluent) pod tlakom (više od 3x107 Pa) pumpa kroz kolone napunjene sorbentom s česticama malog promjera (do 1 μm), a također se koriste i perfuzijski filtri. korišten......

Vrsta kromatografije u kojoj tekućina (eluens) služi kao mobilna faza, a kao stacionarna. sorbent, TV nosač s tekućinom ili gelom nanesenim na površinu. Provedite u koloni ispunjenoj sorbentom (kolonska kromatografija) na ravnoj... ... Prirodna znanost. enciklopedijski rječnik

- [κρώμα (υrum) boja] proces koji se temelji na nejednakoj sposobnosti pojedinih komponenti smjese (tekućih ili plinovitih) da ostanu na površini adsorbensa i kada ih apsorbiraju iz protoka nosača i kada ... ... Geološka enciklopedija

- (s drugog grčkog ... Wikipedia

Pojam kromatografija Pojam na engleskom jeziku kromatografija Sinonimi Skraćenice Srodni pojmovi tekućinska kromatografija visoke učinkovitosti, klatrat, laboratorij na čipu, porometrija, proteom, proteomika, sorbent, enzim, fuleren, endoedral... ... Enciklopedijski rječnik nanotehnologije

Tekućinska kromatografija na bazi razg. sposobnost odvojenih iona na ionsku izmjenu s fiksnim. ioni sorbenta nastali kao rezultat disocijacije ionogenih skupina potonjeg. Kationski izmjenjivači se koriste za odvajanje kationa, za... ... Kemijska enciklopedija

HPLC- tekuća kromatografija visokog učinka… Rječnik ruskih kratica

Tekućinska kromatografija visoke učinkovitosti (HPLC) jedna je od učinkovite metode odvajanje složenih smjesa tvari, naširoko se koristi u analitičkoj kemiji i in kemijska tehnologija. Osnova kromatografskog odvajanja je sudjelovanje ... Wikipedia

knjige

• Praktična tekućinska kromatografija visoke učinkovitosti, Veronica R. Mayer. Čitatelju predstavljamo 5. izdanje knjige, koje je dopunjeno suvremenim metodama i opremom. U knjizi je mnogo toga poboljšano i dodan je velik broj referenci. Ona mjesta u tekstu gdje...